武 康，張卓偉，朱麗靜，梁佳佳，武希潤(山西醫(yī)科大學影像系，太原 03000;山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院消化內(nèi)科;通訊作者，E-mail:xirunwu66@6.com)

肝硬化病人大多存在出血傾向，以往研究認為，其主要與肝臟合成凝血因子減少、脾功能亢進、免疫異常導致血小板減少有關。色素上皮衍生因子(pigment pithelium-derived factor，PEDF)是 1989 年Tombran-Tink等從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外培養(yǎng)液中分離純化的一種可溶性糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，是一種內(nèi)生性多功能因子，有研究表明，PEDF通過氧化應激可抑制血小板P選擇素的表達和血小板的聚集，但PEDF在乙肝肝硬化患者血液中變化及其與肝硬化血小板活化、聚集是否存在相關關系，目前國內(nèi)外尚未見相關文獻報道。本實驗檢測乙肝肝硬化患者血中PEDF變化，分析其與肝硬化血小板活化、聚集相關關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2012-11～2013-01乙肝肝硬化患者37例，所有入選病例均根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、胃鏡和腹部彩超或CT檢查確診，其中山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院6例，山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院18例，山西省人民醫(yī)院13例。其中男28例，女9例，年齡34-81歲，平均(54±10)歲，按照肝硬化Child-Pugh分級標準，將37例患者分為3組，Child-Pugh A級15例，B級12例，C級10例。正常健康體檢10例作為對照組，男7例，女3例，年齡28-57歲，平均(47±9)歲。

1.2 主要試劑儀器

ADP誘導劑、CD61-FITC、CD62P-PE、CD63-PE、IgG-PE購自法國Immunotech公司;鏈霉親和素-HRP、生物素標記的抗PEDF抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司。Allegra X-12離心機、FACSC流式細胞儀、LH750型血小板聚集儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司;多功能酶標儀購自鄭州安圖生物科技有限公司。

1.3 檢測指標及方法

CD62P、CD63的測定:晨起空腹肘中靜脈采血2.7 ml，加入含3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑的真空采血管中，輕輕混勻，2 000 r/min離心5 min制備富血小板血漿(PRP)。取3支離心管，分別加入CD61-FITC IgG1-PE(同型對照)、CD61-FITC CD62P-PE、CD61-FITC CD63-PE 各 5 μl，各加入 PRP 10 μl，室溫避光孵育20 min;加入適量PBS緩沖液，輕輕搖勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1%多聚甲醛200 μl，輕輕搖勻，24 h內(nèi)流式細胞儀檢測。將前向散射(FSC)和側向散射(SSC)的檢測信號均設置為對數(shù)放大，并初步圈出血小板群;利用流式細胞術設邏輯門，以CD61-FITC和SSC雙參數(shù)散點圖設門，再圈出CD61陽性表達的血小板群，門內(nèi)采集＞10 000個血小板，分析CD62P、CD63陽性的百分率。

血小板聚集率(platelet aggregation rate，PAgT)測定:晨起空腹肘中靜脈采血2.7 ml，加入含3.2%的枸櫞酸鈉抗凝劑的真空采血管中，800 r/min離心5 min，取上清 200 μl，加入 ADP 誘導劑(5 μmol/L)10 μl，2 h 內(nèi)血小板聚集儀測 PAgT。

PEDF測定:晨起抽取空腹肘中靜脈血5 ml，加入含抗凝劑的真空采血管中，3 000 r/min離心10 min，取上清置于Eppendorf管中，多功能酶標儀檢測PEDF濃度。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 乙肝肝硬化患者CD62P、CD63的變化

乙肝肝硬化患者血小板CD62P陽性表達較正常對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);乙肝肝硬化B級、C級患者血小板CD63的表達較正常對照組有所增加，差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見表1)。

表1 乙肝肝硬化患者CD62P、CD63的變化(±s)Table 1 Plasma levels of CD62P，CD63 in patients with hepatitis B cirrhosis(±s)

表1 乙肝肝硬化患者CD62P、CD63的變化(±s)Table 1 Plasma levels of CD62P，CD63 in patients with hepatitis B cirrhosis(±s)

與對照組比較，△P＜0.05;與A級比較，#P＜0.05;與B級比較，★P ＜0.05

組別 n CD62P(%) CD63(%)對照組10 5.28 ±1.27 2.30 ±0.72乙肝肝硬化組A 級 15 14.79 ±1.82△ 2.95 ±0.64△B 級 12 11.30 ±2.09△# 3.97 ±0.92△#C 級 10 10.24 ±1.62△★ 3.35 ±0.76△F 59.19 9.40 P ＜0.05 ＜0.05

2.2 乙肝肝硬化患者PAgT、PEDF的變化

乙肝肝硬化患者PAgT、PEDF明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(見表2)。

表2 乙肝肝硬化患者PAgT、PEDF的變化(±s)Table 2 Plasma levels of PAgT and PEDF in patients with hepatitis B cirrhosis(±s)

表2 乙肝肝硬化患者PAgT、PEDF的變化(±s)Table 2 Plasma levels of PAgT and PEDF in patients with hepatitis B cirrhosis(±s)

與對照組比較，#P＜0.001;與 A 級比較，△P ＜0.05;與B 級比較，★P ＜0.05

組別 n PAgT(%) PEDF(ng/L)對照組10 39.43 ±2.37 231.36 ±4.81乙肝肝硬化組A 級 15 21.39 ±1.92# 52.40 ±2.74#B 級 12 30.69 ±2.57#△ 46.26 ±5.04#△C 級 10 20.12 ±2.37#★ 48.68 ±4.33#F 172.38 4 914.04 P ＜0.05 ＜0.05

2.3 相關性分析

乙肝肝硬化患者血液中PEDF的表達與CD62P呈負相關(r=-0.755，P ＜0.05)，與 PAgT 呈正相關(r=0.791，P ＜0.05)。

3 討論

肝硬化患者大多存在出血傾向，以往研究多集中在肝硬化脾大、脾功能亢進導致血小板數(shù)量改變，也有研究表明乙肝病毒復制影響骨髓巨核細胞增殖、活化［1］，而對乙肝肝硬化血小板聚集與活化功能變化的研究較少。

血小板膜上含有a-顆粒、致密顆粒及溶酶體，這些顆粒膜蛋白在靜止期不表達或少量表達。當血小板活化時，a顆粒立即與血小板質(zhì)膜發(fā)生融合釋放CD62P，且CD62P只在活化的血小板表面表達，不被血漿蛋白所掩蓋，不隨時間的推移而在活化血小板表面消失。因此，CD62P在血小板質(zhì)膜上的表達或其陽性血小板的百分率的增加被認為是活化血小板的特異性標志。CD63又稱溶酶體顆粒膜糖蛋白，血小板溶酶體在較強刺激劑誘導下緩慢與血小板質(zhì)膜融合，釋放內(nèi)容物，在血小板表面表達溶酶體顆粒膜糖蛋白，因此，CD63也是血小板活化的特異性指標，血小板質(zhì)膜上檢測到CD63被認為是血小板已被較高程度活化。

童照威等［2］對32例乙型肝炎后硬化患者研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血小板表面CD62P、CD63增高不僅與血小板過度破壞有關，還與體內(nèi)血小板活化程度有關。我們的實驗結果表明，乙肝肝硬化患者血中CD62P、CD63陽性百分率與對照組比較均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義，提示乙肝肝硬化患者存在血小板活化異常。

血小板聚集是血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)通過纖維蛋白原(Fg)與另一血小板膜GPⅡb/Ⅲa結合的聚合能力，顯示活化的血小板相互作用聚集成團的特征，是血小板的一種重要止血功能。龔文勝等［3］對121例門脈性肝硬化患者及52例對照組進行PAgT檢測，結果發(fā)現(xiàn)肝硬化組血小板功能明顯下降，表明乙肝肝硬化除存在血小板數(shù)量的減少外，常有血小板功能的減退。本實驗檢測乙肝肝硬化患者血小板聚集率明顯降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義，表明乙肝肝硬化患者存在血小板聚集功能降低。

PEDF是一種具有多種生理作用的保護因子，廣泛分布在人體的腦、眼、胎盤、睪丸、卵巢、前列腺等組織中，抗氧化應激是PEDF眾多生理作用的樞紐［4，5］，PEDF 可通過其抗氧化應激性抑制 NADPH活化，減少ROS生成，抑制血小板P選擇素的表達和血小板的聚集，起到抗血小板聚集及血栓形成［6-8］。肝硬化患者存在血小板數(shù)量及功能的異常，但是否存在肝硬化患者血中PEDF變化與血小板活化、聚集相關關系目前尚無相關文獻報道。我們采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測37例乙肝肝硬化患者血清中PEDF變化，結果血中PEDF濃度較正常對照組明顯減少，提示乙肝肝硬化中存在保護性因子PEDF減少。分析乙肝肝硬化患者血液中PEDF表達與CD62P、PAgT相關關系，結果表明，PEDF的表達與CD62P呈負相關，與PAgT呈正相關，表明乙肝肝硬化患者血清PEDF變化影響其血小板活化和聚集，推測乙肝肝硬化患者血清PEDF降低，血小板活化和聚集功能異?？赡芤彩歉斡不鲅L險增大的原因之一。

［1］王慧緯，武希潤，梁佳佳，等.乙肝肝硬化患者血清對體外培養(yǎng)巨核細胞增殖分化的影響［J］.中華肝臟病雜志，2013，21(2):143-145.

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［3］龔文勝，葉素丹，陳寧.121例肝硬化患者血小板聚集功能觀察［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2005，5(3):21-22.

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［6］Zheng Z，Chen H，Zhao H，et al.Inhibition of JAK2/STAT3-mediated VEGF upregulation under high glucose conditions by PEDF through a mitochondrial ROS pathway in vitro［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(1):64-71.

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