張明娟，張超英，楊 軍，朱參戰(zhàn)，段宗明，宋安齊(西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院心內科，西安70004;西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院病理科;通訊作者，E-mail:zhangmingjuan@mail.xjtu.edu.cn)

心臟是一個具有可塑性的器官，在高血壓或心肌梗死、長時間段的心率加快、收縮期和舒張期縮短、心肌收縮力持續(xù)增強等病理生理狀態(tài)下，心臟能通過心肌形態(tài)的重塑(cardiac remodeling)以適應環(huán)境的變化，保證強有力的心臟搏動，滿足全身器官的血供和血壓的維持。心肌細胞常常會發(fā)生代償性心肌肥厚［1］，表現為心肌纖維肥大、收縮力增強，并伴有心肌纖維間膠原纖維過量積聚、膠原濃度顯著升高/膠原容積分數顯著增加等心肌纖維化過程［2］。一旦上述病理狀態(tài)繼續(xù)存在，則會引起心室逐漸擴張，心肌收縮功能下降，最終表現出一系列臨床癥狀，發(fā)展成為多種心臟疾病。研究已知，自噬是維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要分子機制，在心臟損害中可能具有雙重作用。在上述病理生理狀態(tài)下，心肌細胞既能通過激活自噬提高心肌細胞對缺血缺氧的耐受能力，也可抑制細胞自噬減少細胞死亡、避免過度自噬對心臟的損害。但具體作用還取決于自噬激活作用的水平及誘導環(huán)境。但是，自噬在心肌肥厚中的具體作用機制并不清楚。因此，研究自噬在心肌肥厚的分子機制對于心臟疾病的防治具有重要意義。

而自噬(autophagy)最早由Ashford和Porter在1962年發(fā)現，現已證實，自噬是細胞實現自身物質代謝、細胞器更新的生理過程，是真核生物中進化高度保守的對細胞內物質進行循環(huán)再生利用的重要生理現象，幾乎參與所有細胞的生理和病理過程［3］。研究證實，采用神經刺激因子或不同藥物，例如兒茶酚胺、野百合堿、慢性低氧、持續(xù)抑制一氧化氮合酶、增加壓力及心肌梗死等方法制備不同類型的心肌肥厚動物模型，為研究心肌肥厚病理生理過程提供了堅實的實驗基礎。其中采用異丙腎上腺素制備的心肌肥厚模型［4］，因其與人類心肌肥厚更為相似而應用最為廣泛。因此，本研究擬采用皮下包埋微量泵持續(xù)泵入去甲腎上腺素(isoprenaline，ISO)方法建立小鼠心肌肥厚模型，檢測自噬相關蛋白Beclin1在心肌組織中的表達，探討自噬在心肌肥厚發(fā)生中的作用，為心肌肥厚以及心力衰竭機制的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

ALZET微滲透泵(Model 2004，美國ALZA公司)。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)系美國Sigma產品。Beclin1抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司。免疫組織化學試劑盒(Dako REAL EnVision Detection System)購自丹麥Dako公司。

1.2 心肌肥厚模型的建立

選用20只WT雄性小鼠，購自西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心。完全隨機化分為實驗組和對照組:實驗組為 ISO 小鼠(微量泵，ISO 30 μg/(g·d)，n=10)，對照組為假手術組(微量泵，0.9%NaCl，n=10)。方法 如下［4］:戊巴比妥(20 mg/kg)腹腔內注射麻醉，將小鼠俯臥于手術臺上，背部除毛，75%酒精消毒，埋入微量泵后縫合皮膚(ISO組埋入已預裝ISO 30 μg/(g·d)微量泵，對照組埋入已預裝0.9%NaCl微量泵)。所有小鼠均喂標準顆粒飼料，自由飲水，術后飼養(yǎng)4周，超聲心動圖學檢查后，斷脊髓處死小鼠，常規(guī)取心臟，10%福爾馬林固定、石蠟包埋，備用。

1.3 超聲心動圖檢查

分別在實驗開始時和術后飼養(yǎng)4周時對小鼠進行超聲心動圖學檢查:將小鼠麻醉仰臥位固定，前胸除毛，手術前1周、術后4周行超聲心動圖(SIEMENS SEQUOIA 512)檢查(探頭15L8)，清晰顯示胸骨旁左室長軸切面，M型二尖瓣腱索水平測量舒張末期左室內徑(LVDd)、收縮末期左室內徑(LVDs)、室間隔(IVSd)、左室后壁(LVPW)、左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)及速率矯正的纖維縮短率(Vcfc)。超聲儀所用技術參數對所有的測試對象相同，并至少測量3個連續(xù)周期，取其平均值。

1.4 小鼠心肌Masson染色

心肌組織常規(guī)切片脫蠟后水化，先后蘇木素染色，麗春紅酸性品紅液中染;1%磷鋁酸中染，滴加苯胺藍液后烘干，二甲苯透明樹膠封片。進行心臟間質纖維化的分析與評價。陽性結果判定標準:膠原纖維呈藍色，胞核呈藍色，肌纖維胞質呈紅色。

1.5 免疫組織化學染色

按照Dako REAL EnVision免疫組織化學試劑盒說明書操作:常規(guī)脫蠟水化，滴加3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，滴加抗Beclin1抗體，室溫孵育30 min，滴加ChemMate EnVision+/HRP，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染、酒精脫水、二甲苯透明、樹膠封片。用 PBS代替一抗作陰性對照。Beclin1免疫組化檢測結果按照胞質型分子判讀標準進行判讀:胞質型 0(陰性):無著色;弱陽性(+):≤10%的細胞呈現不同程度的細胞質著色;陽性(++):10%-30%的細胞呈現強的棕褐著色的細胞質著色或≤70%的細胞呈現弱或中等強度的細胞質著色;強陽性(+++):＞30%的細胞呈現強的棕褐著色的細胞質著色或＞70%的細胞呈現中等強度細胞質著色［5］。

1.6 統(tǒng)計學分析

用SPSS14.0進行統(tǒng)計分析。兩組間差異分析采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌肥厚模型的建立

ISO皮下泵入4周后，小鼠的組織重量的檢測結果顯示，心臟/體重、肺臟/體重ISO組較對照組升高，而且差異存在統(tǒng)計學意義(P＜0.005，見表1)。然而，兩組間肝臟/體重、腎臟/體重以及脾臟/體重未見明顯的統(tǒng)計學差異。結果 提示心臟重量增加，心肌肥厚發(fā)生;肺臟重量增加，提示可能存在肺臟的輕度淤血。

2.2 超聲心動圖檢測結果顯示

LVPWs、LVEF、FS、Vcfc 兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.005，見表2)。組織重量和超聲結果均提示，ISO持續(xù)皮下微量泵入4周后，小鼠心臟組織出現了心肌肥厚。

表1 兩組間小鼠的組織重量與體重比值的比較(±s)Table 1 Com parison of tissue/body weight between ISO group and control group(±s)

表1 兩組間小鼠的組織重量與體重比值的比較(±s)Table 1 Com parison of tissue/body weight between ISO group and control group(±s)

組別 n 心臟/體重 左心室/心臟 肺臟/體重 脾臟/體重 腎臟/體重 肝臟/體重ISO 組 9 0.51 ±0.03* 0.71 ±0.02 0.55 ±0.04*0.28 ±0.02 1.28 ±0.12 4.13 ±0.29對照組 10 0.43 ±0.03* 0.71 ±0.03 0.49 ±0.02* 0.27 ±0.03 1.40 ±0.12 4.42 ±0.59 t-5.217 0.545 -3.163 -0.350 2.095 1.326 P 0.000 0.593 0.006 0.731 0.051 0.202

表2 兩組間小鼠超聲心動圖的相關指標的比較(±s)Table 2 Comparison of echocardiography between ISO group and control group(±s)

表2 兩組間小鼠超聲心動圖的相關指標的比較(±s)Table 2 Comparison of echocardiography between ISO group and control group(±s)

組別 n IVSd LVPWd LVPWs FS LVEF Vcfc ISO 組 9 0.07 ±0.01* 0.13 ±0.02 0.10 ±0.02* 69.73 ±7.44＊＊ 94.12 ±2.40＊＊ 16.05 ±4.50＊＊對照組 10 0.06 ±0.01* 0.08 ±0.01 0.08 ±0.01* 34.30 ±3.90＊＊ 70.18 ±5.06＊＊ 5.91 ±0.85＊＊t-3.091 -0.352 -3.085 -13.332 -14.643 -10.132 P 0.006 0.005 0.006 0.000 0.000 0.000

2.3 小鼠心肌膠原纖維Masson三色染色

小鼠左室心肌組織Masson三色染色的結果顯示:對照組小鼠心肌組織呈橘紅色、排列規(guī)則，其間散在少量膠原纖維(圖1A見第501頁);ISO組小鼠橘紅色心肌纖維細胞可見小灶狀脂肪變性及壞死，并伴以星網狀藍色膠原纖維增生(圖1B見第501頁)。

2.4 自噬相關蛋白Beclin1在ISO小鼠心肌組織中表達的意義

自噬相關蛋白Beclin1在ISO小鼠心肌組織較陰性對照組表達明顯減弱，而且結果還顯示，心肌纖維化越重，自噬相關蛋白Beclin1在心肌組織中的表達越弱(圖2，見第501頁)。因此，實驗結果提示，自噬相關蛋白Beclin1參與了心肌纖維化的進程，在心肌重塑中起著重要的作用。

3 討論

心肌肥厚是心力衰竭的前驅病變，而心臟后負荷增加導致的心肌細胞肥大、心肌肥厚及心臟功能異常是常見心臟病及相關疾病的病因。因此，探明心肌肥厚發(fā)生和發(fā)展機制一直是心血管領域最為重要的研究內容之一。采用異丙腎上腺素制備的心肌肥厚模型，因其小劑量持續(xù)給予ISO可興奮心肌細胞腎上腺素β1受體，使心肌收縮力增強、心率加快、收縮期和舒張期縮短，還可引起的整合素連接激酶(絲氨酸/酪氨酸的蛋白激酶，ILK)、p-PI3K和p-Akt蛋白表達上調、PI3K/Akt信號通路激活［6，7］，可進一步激活細胞抗凋亡機制、葡萄糖代謝及蛋白合成等過程，同時，通過激活蛋白激酶PKC和PKA途徑共同激活Raf和ERKI/2，促進環(huán)磷腺苷生成和糖原合成，促進心肌組織成纖維細胞的存活、增殖和心肌細胞內總蛋白和非收縮蛋白合成增加，最后導致不依賴于后負荷的促心肌肥大效應和心肌肥厚的發(fā)生，而發(fā)展成為病理性心肌肥厚［8］。還有學者證實采用磷脂酰肌醇3-激酶C(PI3KC)小分子抑制劑AS605240對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌肥厚和纖維化具有一定的改善作用［9］。因此，PI3K/Akt信號通路激活，被認為可能是導致心肌肥厚的機制之一。

正因如此，本研究采用ISO小鼠心肌肥厚模型以探討自噬在心肌肥厚中的作用和意義。結果 顯示，采用皮下包埋微量泵連續(xù)輸注ISO 4周后，ISO實驗組小鼠心臟指數明顯高于對照組，同時，超聲結果顯示:ISO實驗組小鼠盡管LVPW明顯增厚，但FS亦未見明顯降低。同時采用了與負荷相關性較小的LV功能指標，比如:人體速率矯正的纖維縮短率(rate-corrected velocity of fiber shortening，Vcfc)，應用于與負荷不相關的收縮功能狀態(tài)的描述［10］。與短軸縮短率相比，Vcfc能更好地反映前負荷與心率無關的生理變化。結果 顯示，實驗組的Vcfc明顯高于對照組，提示其收縮功能正常。同時，還發(fā)現其肺臟/體重的比值明顯高于對照組，但尚未表現出明顯的氣短、氣促、雙下肢浮腫等癥狀，說明ISO誘導的心肌肥厚模型成功建立，其實驗小鼠心功能狀態(tài)仍處于代償期。說明，采用微量泵持續(xù)輸注ISO是短期內建立小鼠心肌肥厚模型的可靠方法。

心肌細胞自噬不僅是心肌細胞正常生理的反應，更是對各種心血管刺激的適應性調節(jié)反應，同時還參與心肌肥厚、心肌梗死、心力衰竭等各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。Beclin1是一個非常保守的自噬相關蛋白，與Vps30/Atg6同源，既是Bcl-2結合蛋白，也是三型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KC)復合物1(Vps34、Vps15 Vps30/Atg6和 Atg14)、復合物 2(Vps34、Vps15 Vps30/Atg6和Vps38)的重要組分之一［11，12］。PI3KC 是唯一高度保守的 PI3K 亞型，在自噬調節(jié)中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。Beclin1通過其BH3結構域與Bcl-2和Bcl-2家庭其他成員(Bcl-XL，Bcl-w Mcl-1)結合，其中Bcl-2/Beclin1被認為是自噬調解的一個關鍵的調節(jié)機制［13-15］。Mst1通過對Beclin1蛋白BH3域的thr108蘇氨酸的磷酸化增強Beclin1和Bcl-2/Bcl-xL結合的穩(wěn)定性［16］。還有學者證實機體可通過Beclin1依賴性和非依賴性機制調控自噬細胞死亡［17，18］。

該研究結果也表明，ISO組小鼠肥厚的心肌組織中自噬相關蛋白Beclin1表達實驗組較對照組表達明顯減弱，同時，心肌組織Masson三色染色結果也提示肥厚的心肌組織發(fā)生了纖維化改變。顯然，在連續(xù)小劑量輸注ISO引起小鼠心肌肥厚病程的進展和纖維化程度與Beclin1的表達呈負相關。這一現象也被其他學者所證實［19］。例如，有學者發(fā)現在心臟壓力過負荷時心肌蛋白合成及心臟肥厚的概率增加，但自噬活性卻降低［20］。Yamaguchi等［21］發(fā)現，主動脈縮窄(TAC)所引起的壓力過負荷可導致野生型鼠功能正常的心臟肥厚的同時自噬活性降低。此外，特異性抑制心臟自噬相關蛋白ATG5及ATG7或心臟細胞自噬基因Atg5缺失小鼠，可在抑制心肌自噬、損傷蛋白積累的同時，導致左側心室擴張和收縮功能障礙及典型心肌肥厚，繼而引起擴張型心肌病及HF。

如前所述，小劑量持續(xù)給予ISO引起的PI3K/Akt信號通路活化，被認為可能是導致心肌肥厚的機制之一。PI3K/Akt/mTOR and AMPK信號通路是自噬和凋亡調節(jié)的重要因子。同時，抗凋亡信號如PI3K/Akt/mTOR信號通路和Bcl-2可抑制自噬。而促凋亡信號，如AMPK信號通路和Bax可活化自噬PI3KC抑制劑3-methyladenine(3-MA)抑制 PI3KPTEN-Akt-mTOR 信號通路誘導自噬［12，22］?？梢?，PI3K/AKT/mTOR通路還可通過負反饋調解機制精確調節(jié)細胞自噬活性，以應對不良環(huán)境刺激，維持細胞生存能力［20，23，24］。

由此，本課題組推測在ISO誘導的心肌肥厚中，心肌肥厚時自噬相關蛋白表達下調可能與PI3K/Akt信號通路的活化有關，同時也是心肌細胞應對持續(xù)小劑量輸注ISO輸注引起的不良血流動力學反應的保護性反應，利于心肌細胞的存活，但是其詳細機制仍有待進一步研究。

［1］Heineke J，Molkentin JD.Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7(8):589-600.

［2］Delcayre C，Swynghedauw B.Molecular mechanisms of myocardial remodeling.The role of aldosterone［J］.J Mol Cell Cardiol，2002，34(12):1577-1584.

［3］Gustafsson AB，Gottlieb RA.Autophagy in Ischemic Heart Disease［J］.Circ Res，2009，104(2):150-158.

［4］Nirmala C，Puvanakrishman R.Protective role of curcumin against isoproterenol induced myocardial infarction in rats［J］.Mol Cell Biochem，1996，159(2):85-86.

［5］楊軍，康安靜，蘇寶山，等.免疫組織化學檢測結果判讀進展［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2014，8(20):3699-3703.

［6］高建輝，武俊芳，郭康，等.ILK在異丙腎上腺素誘導大鼠心肌肥厚組織中的表達［J］.解剖學研究，2013，35(1):25-28.

［7］Shimamura H，Terada Y，Okado T，et al.The PI3-kinase-Akt pathway promotes mesangial cell survival and inhibits apoptosis in vitrovia NF-kappa B and Bad［J］.J Am Soc Nephrol，2003，14(6):1427-1434.

［8］尹峰，朱晌，李平，等.異丙腎上腺素對小鼠心肌MAPK、NF心和JAK/STAT信號轉導途徑的激活效應［J］.生理學報，2003，55(4):449-453.

［9］宋麗芳，蔣維，卿勇，等.PI3KC抑制劑AS605240對異丙腎上腺素誘導大鼠心肌肥厚和纖維化的拮抗效應［J］.四川大學學報:醫(yī)學版，2011，42(4):471-474.

［10］Collins KA，Korcarz CE，Lang RM.Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice［J］.Physiol Genomics，2003，13(3):227-239.

［11］Oberstein A，Jeffrey PD，Shi Y.Crystal structure of the Bcl-XLBeclin1 peptide complex:Beclin1 is a novel BH3-only protein［J］.J Biol Chem，2007，82:13123-13132.

［12］Zeng KW，Fu H，Liu GX，et al.Aluminum maltolate induces primary rat astrocyte apoptosis via overactivation of the classⅢPI3K/Beclin1-dependent autophagy signal［J］.Toxicol in Vitro，2012，26:215-220.

［13］Sun Q，Fan W，Zhong Q.Regulation of Beclin1 in autophagy［J］.Autophagy，2009，5(5):713-716.

［14］Funderburk SF，Wang QJ，Yue Z.The Beclin1-VPS34 complex-at the crossroads of autophagy and beyond［J］.Trends Cell Biol，2010，20:355-362.

［15］Oberstein A，Jeffrey PD，Shi Y.Crystal structure of the Bcl-XLBeclin1 peptide complex:Beclin1 is a novel BH3-only protein［J］.J Biol Chem，2007，282:13123-13132.

［16］Maejima Y，Kyoi S，Zhai P，et al.Mst1 inhibits autophagy by promoting Beclin1-Bcl-2 interaction［J］.Nat Med，2013，19(11):1477-1488.

［17］Decuypere JP，Parys JB，Bultynck G.Regulation of the Autophagic Bcl-2/Beclin1 Interaction［J］.Cells，2012，1(3):284-312.

［18］Tian S，Lin J，Zhou J，et al.Beclin1-independent autophagy induced by a Bcl-xL/Bcl-2 targeting compound，Z18［J］.Autophagy，2010，6(8):1032-1041.

［19］Nakai A，Yamaguchi O，Takeda T，et al.The role of autophagy in cardiomyocytes in the basal state and in response to hemodynamic stress［J］.Nat Med，2007，13:619-624.

［20］Hill JA.Autophagy in cardiac plasticity and disease［J］.Pediatr Cardiol，2011，32(3):282-289.

［21］Yamaguchi O，Higuchi Y，Hirotani S，et al.Targeted deletion of apoptosis signal-regulating kinase 1 attenuates left ventricular remodeling［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(26):15883-15888.

［22］Kandala PK，Srivastava SK.Regulation of macroautophagy in ovarian cancer cells in vitro and in vivo by controlling glucose regulatory protein 78 and AMPK［J］.Oncotarget，2012，3:435-449.

［23］Zou M，Lu N，Hu C，et al.Beclin1-mediated autophagy in hepatocellular carcinoma cells:Implication in anticancer efficiency of oroxylin A via inhibition of mTOR signaling［J］.Cell Signal，2012，24:1722-1732.

［24］Luo T，Liu G，Ma H，et al.Inhibition of Autophagy via Activation of PI3K/Akt Pathway Contributes to the Protection of Ginsenoside Rb1 against Neuronal Death Caused by Ischemic Insults［J］.Int J Mol Sci，2014，15(9):15426-15442.