劉 昀，孫秀珍，徐 晶，吳媛媛，史紅陽，方 萍(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710004)

變態(tài)反應(yīng)疾病如過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮膚病等是嚴(yán)重危害人類健康的一大類疾病。應(yīng)用基因重組技術(shù)制備重組變應(yīng)原疫苗應(yīng)用于變態(tài)反應(yīng)疾病的診斷和治療，不僅能提高診斷的特異性和敏感性，而且還能顯著降低粗制變應(yīng)原疫苗用于特異性免疫治療(SIT)的副作用，成為國內(nèi)外變態(tài)反應(yīng)領(lǐng)域研究的主要方向。法國梧桐是城市主要綠化樹木，主要種植在美國西南部、南美、非洲、亞洲南部、澳大利亞和新西蘭［1］，在我國大多數(shù)城市可見到。國內(nèi)外許多研究提示法國梧桐花粉是變態(tài)反應(yīng)病重要的吸入性致敏原［2-5］。我們既往研究也發(fā)現(xiàn)法國梧桐花粉是西安地區(qū)主要的氣傳吸入致敏原［6］。本課題主要目的是構(gòu)建法國梧桐花粉變應(yīng)原cDNA表達(dá)文庫，為篩選法國梧桐花粉主要變應(yīng)原陽性克隆及基因重組變應(yīng)原疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

法國梧桐花粉的采集:于2012年3-4月份法國梧桐花粉季節(jié)，在西安市區(qū)采集法國梧桐花粉，9號分樣篩過濾后立即裝入瓶中，投入液氮罐內(nèi)，-180℃冷凍保存。

1.2 試劑

TRIZOL Reagent購自 Invitrogen公司(美國)，Oligotex mRNA Spin-Column Kit購自QIAGEN公司(德國)，Uni-ZAP XR 載體、XL1-Blue MRF’、ZAP-cDNA Synthesis Kit及 ZAP-cDNA GigapackⅢ Gold Cloning Kit購自Stratagene公司(美國)，異丙醇、氯仿、乙醇、酚，12 mg/ml四環(huán)素、MgSO4、20% 麥芽糖均為分析純，由我校采供中心提供。

1.3 方法

1.3.1 總RNA抽提及質(zhì)檢 法國梧桐花粉超聲粉碎破殼，液氮研磨成組織勻漿，分別加入氯仿、異丙醇、乙醇及適量無RNA酶的水，充分溶解沉淀，經(jīng)分光光度計(jì)測定A260nm和A280nm值，并電泳檢測總RNA質(zhì)量。

1.3.2 mRNA 的提取 按 Oligotex mRNA Spin-Column Kit試劑盒操作步驟進(jìn)行，經(jīng)過Oligo(dT)纖維素柱純化提取mRNA，電泳檢測mRNA分布及mRNA的A260nm和A280nm的比值。

1.3.3 dsDNA的合成 以mRNA為模板，以oligodt50為逆轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(ss cDNA)，在RNaseH及DNA polymeraseⅠ的作用下，合成cDNA第二鏈(ds cDNA)。取5 μl合成的 ds DNA產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測ds cDNA分子量分布情況。

1.3.4 cDNA片段的加工及分離 首先使用DNA polymerase補(bǔ)平cDNA缺口，連接Eco RⅠ適配子，Eco RⅠ末端磷酸化，XhoⅠ消化，使合成的ds cDNA成為Eco RⅠ/XhoⅠ雙黏性末端，以便定向克隆。按分子克隆的方法［7］低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳去掉多余接頭和500 bp以下的片段，凝膠回收大于500 bp的片段，將cDNA沉淀純化后用于連接。

1.3.5 cDNA與載體連接及滴度測定 cDNA與Uni-ZAP XR載體連接，使用GigapackⅢ Gold Packaging Extract對連接產(chǎn)物進(jìn)行體外包裝，梯度稀釋后感染宿主菌XL1-Blue MRF’，37℃培養(yǎng)過夜，計(jì)數(shù)噬菌斑，計(jì)算滴度(噬菌斑數(shù)/ml噬菌體)。

1.3.6 cDNA重組率及插入片段大小的PCR鑒定 包裝后噬菌體和輔助噬菌體加入到XL1-Blue-MRF’細(xì)胞，體外切割，釋放pBluescript SK噬粒，感染SOLR細(xì)胞，涂布LB-ampicillin瓊脂平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。根據(jù)平板上生長菌落數(shù)及白斑數(shù)，計(jì)算插入率及有效噬粒滴度，從平板上挑選16個(gè)白斑，以噬粒多克隆切割位點(diǎn)兩側(cè)序列T3和T7作為引物，PCR擴(kuò)增，35個(gè)循環(huán)后電泳檢測，計(jì)算平均插入片段的大小。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的抽提

法國梧桐花粉總RNA A260nm/A280nm的比值為1.904，終濃度為 0.693 μg/μl，提示產(chǎn)物純度較高，電泳結(jié)果有明顯的28S和18S條帶(見圖1)，無拖尾現(xiàn)象發(fā)生，提示RNA無降解，質(zhì)量合格，可以進(jìn)行mRNA分離的實(shí)驗(yàn)。

圖1 法國梧桐花粉總RNA電泳圖Figure 1 Electrophoresis of total RNA from Platanus acerifolia pollen

2.2 mRNA 分離

總RNA純化后所得的mRNA電泳結(jié)果顯示，mRNA的A260nm與 A280nm的比值為1.921(見圖2)，終濃度 0.203 μg/μl，說明 mRNA 足夠純凈，完全符合逆轉(zhuǎn)錄要求。

圖2 法國梧桐花粉mRNA電泳圖Figure 2 Electrophoresis of mRNA from Platanus acerifolia pollen

2.3 雙鏈cDNA合成

以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成ds cDNA，然后瓊脂糖凝膠電泳檢測，ds cDNA呈彌散分布(見圖3)，條帶正常，且量足。

2.4 文庫滴度的測定

雙鏈cDNA與Uni-ZAP XR Vector連接包裝后，測得的文庫滴度為3.5×106pfu/ml，文庫噬菌體的滴度符合文庫保存和篩選實(shí)驗(yàn)的要求。隨機(jī)挑選該cDNA文庫的陽性單克隆噬菌斑進(jìn)行PCR鑒定后，擴(kuò)增出的片段主要集中在0.25-2 kb之間，經(jīng)凝膠成像及分析系統(tǒng)(UVP公司)分析，平均插入片段長度約為0.7 kb，插入達(dá)到94%(見圖4)，結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的cDNA文庫質(zhì)量合格。

圖3 法國梧桐花粉雙鏈cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 3 Agarose gel electrophoresis of ds cDNA from Platanus acerifolia pollen

圖4 法國梧桐花粉文庫cDNA插入片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 4 PCR results of inserted cDNA fragments of Platanus acerifolia pollen library

3 討論

由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病如過敏性哮喘、過敏性鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、過敏性皮膚病等影響了世界25%的人群［8］。變應(yīng)原SIT是唯一針對病因治療的有效方法，但傳統(tǒng)SIT用天然變應(yīng)原提取液的成分非常繁雜，包括致敏蛋白組分，非致敏蛋白組分及雜質(zhì)等，影響其安全性和療效。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，重組變應(yīng)原是目前國內(nèi)外變應(yīng)原研究的熱點(diǎn)［9］。重組變應(yīng)原不僅可以提高診斷的敏感性與特異性，而且還可以確保SIT的療效及安全性［11］。國內(nèi)學(xué)者對螨蟲重組變應(yīng)原開展了深入的研究［12，13］，我們課題組一直從事重組花粉變應(yīng)原的相關(guān)研究，本研究構(gòu)建法國梧桐花粉變應(yīng)原cDNA表達(dá)文庫，為進(jìn)一步制備重組法國梧桐變應(yīng)原疫苗奠定了基礎(chǔ)。

法國梧桐又稱二球懸鈴木，為落葉喬木，屬懸鈴木屬，原產(chǎn)于歐洲，我國于20世紀(jì)60年代后大量栽培行道、公園、庭院等綠化樹種，目前廣布各地，花期為4月中旬至5月上旬，花粉產(chǎn)量很大，風(fēng)媒傳播，在花期空氣中花粉含量很高，是大部分地區(qū)重要的吸入性花粉變應(yīng)原。在西班牙，法國梧桐花粉的花期可檢測到大量法國梧桐花粉，幾乎占到花粉總量的14%;1997年Varela等［10］根據(jù)懸鈴木屬花粉變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)、sIgE測定及免疫印跡等資料提出懸鈴木屬是馬德里地區(qū)花粉過敏的重要致敏原;官玲燕［4］等檢測汕頭地區(qū)兒童哮喘患者的變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)法國梧桐花粉的陽性率僅次于屋塵螨及粉塵螨，是當(dāng)?shù)貎和颊咦钪饕幕ǚ壑旅粼?我們的研究［6］也發(fā)現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)疾病患者法國梧桐花粉的皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)的陽性率僅次于蒿屬花粉，是西安地區(qū)主要的氣傳花粉變應(yīng)原。因此，研究法國梧桐花粉變應(yīng)原基因序列，尋找適合用于脫敏治療的變應(yīng)原基因克隆，制備重組變應(yīng)原疫苗用于法國梧桐花粉過敏患者的脫敏治療，具有重要意義。

構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA表達(dá)文庫的首要條件就是獲得完整、不被降解的總RNA。我們利用Trizol法抽提法國梧桐花粉總RNA，經(jīng)分光光度計(jì)測定A260nm和 A280nm的比值為 1.904，提示產(chǎn)物純度較高，電泳結(jié)果有明顯的28S和18S條帶，無拖尾現(xiàn)象發(fā)生，提示RNA無降解，質(zhì)量合格。高質(zhì)量的mRNA也是構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫的前提。本實(shí)驗(yàn)的總RNA經(jīng)過Oligo(dT)纖維素柱純化后，得到mRNA，純化后所得的mRNA的A260nm和A280nm的比值為1.921，說明mRNA足夠純凈，完全符合逆轉(zhuǎn)錄要求。

重組子插入片段的大小是評價(jià)文庫質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。我們采用凝膠過濾對cDNA進(jìn)行分離，除去未被利用的接頭-銜接子以及由限制性內(nèi)切核酸酶消化接頭多聚物所生成的低分子量產(chǎn)物，及一些長度小于500 bp的短片段。從文庫中除去這些片段不僅減少了必須篩選的重組子的數(shù)目，同時(shí)還增加了文庫中全長目的mRNA的數(shù)量，保證了文庫的質(zhì)量。我們隨機(jī)挑選文庫的陽性單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)分析平均插入片段長度約為0.7 kb，符合建庫要求，為篩選出全長目的基因提供保證。

足夠大的庫容量是保證篩選目的基因的關(guān)鍵。低豐度mRNA在cDNA文庫中出現(xiàn)的某一給定概率所需克隆數(shù)為N=ln(1-P)/ln(1-1/n)(N為所需克隆數(shù)，P為要求的概率，1/n為低豐度mRNA在總mRNA中所占的比例)，若要以99%的概率獲得這些低豐度的克隆，則要求的文庫克隆數(shù)為1.7×105，我們所建的表達(dá)文庫滴度為3.5 ×106pfu/ml，已超過了這一標(biāo)準(zhǔn)，適合用于目的克隆的篩選。

總之，我們構(gòu)建的法國梧桐花粉變應(yīng)原cDNA表達(dá)文庫達(dá)到設(shè)計(jì)要求，適用于進(jìn)一步進(jìn)行法國梧桐花粉主要變應(yīng)原目的克隆的篩選，為制備重組法國梧桐花粉變應(yīng)原疫苗奠定了基礎(chǔ)，也為提高變態(tài)反應(yīng)疾病診斷的特異性和敏感性以及特異性免疫治療的療效和安全性奠定了基礎(chǔ)。

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