李冰潔(撫順市衛(wèi)生學(xué)校檢驗教研室，撫順 113008)

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是世界范圍內(nèi)流行的兒童常見病，可由多種病毒感染引起，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皮疹或皰疹為主要特征。絕大多數(shù)HFMD患者預(yù)后良好，一般可在發(fā)病后5-7 d內(nèi)痊愈，屬于自限性疾病，但有時候，尤其是人腸道病毒71型(human enterovirus 71，HEV71)感染5歲以下的兒童導(dǎo)致HFMD時，會出現(xiàn)比較嚴重的并發(fā)癥，包括心肺并發(fā)癥(如急性神經(jīng)源性肺水腫、肺出血和心肌炎等)和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥(如腦干腦炎、無菌性腦膜炎和類脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等)［1，2］，所以選擇一種敏感的細胞系對腸道病毒EV71型進行快速準確分離及鑒定，不僅能為臨床診斷提供輔助依據(jù)，同時能為制定降低兒童的重癥和死亡率的防控措施提供有力的科學(xué)依據(jù)。

本研究采用三種不同的細胞對EV71核酸檢測陽性的標本進行病毒分離，通過對比不同細胞的分離率來比較細胞的敏感性，從而確定腸道病毒EV71的敏感細胞，建立快速準確的病毒分離方法，為進一步對腸道病毒EV71進行變異分析打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒采樣管:友康恒業(yè)生物科技(北京)有限公司生產(chǎn)。

細胞株:人喉癌上皮細胞(HEP-2)、非洲綠猴腎細胞(VERO)、人橫紋肌肉瘤細胞(RD)三種細胞進行病毒分離，細胞均為本單位細胞庫保存。

細胞培養(yǎng)液 MEM、胎牛血清:美國Gibco/BRL公司生產(chǎn);青霉素、鏈霉素為東北制藥廠生產(chǎn)。

核酸提取儀器:QIAGEN公司的EZ1 Advanced XL全自動核酸提取儀。核酸提取試劑盒:QIAGEN公司的 EZ1 Virus Mini Kit V2.0(Cat.No.955134)試劑盒。核酸檢測試劑盒:江蘇碩世公司腸道病毒EV71型檢測試劑盒。熒光定量PCR儀:美國AB公司的ABl7500型熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集和處理 在2014-07～2014-08期間于撫順市中醫(yī)院內(nèi)科門診采集20名癥狀典型、發(fā)病7 d內(nèi)的臨床診斷為HFMD的患者咽拭子標本，采集后立即投入裝有病毒采樣液的小試管中冷藏運輸至實驗室。標本一部分用于核酸提取并進行PCR檢測，另一部分-70℃冰箱凍存用于病毒分離。

1.2.2 病毒分離鑒定 使用 HEP-2、VERO、RD三種細胞進行病毒分離，每種細胞接種500 μl標本，在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每份標本在三種細胞上至少傳三代，如果不出現(xiàn)致細胞病變效應(yīng)(CPE)，則判為陰性;如果出現(xiàn)CPE，則使用熒光定量PCR(real time-PCR)方法進行腸道病毒EV71型型別鑒定。

1.2.3 病毒核酸提取 將HFMD患者的咽拭子標本及經(jīng)過細胞培養(yǎng)的有CPE的病毒液提取核酸，所提取的核酸為 RNA。實驗采用 QIAGEN公司的EZ1 Advanced XL全自動核酸提取儀，使用EZ1 Vi-rus Mini Kit V2.0(Cat.No.955134)進行核酸提取，具體步驟參考說明書。

1.2.4 病毒核酸檢測 將所提取的核酸應(yīng)用real time-PCR檢測方法進行檢測，使用的試劑盒是江蘇碩世公司腸道病毒EV71型檢測試劑盒，擴增反應(yīng)體系和條件按照說明書操作和設(shè)置，在ABl7500型熒光定量PCR儀上進行操作。

2 結(jié)果

2.1 標本的核酸檢測結(jié)果

對所采集的20份標本進行腸道病毒EV71型檢測，檢測結(jié)果見圖1。

圖1 20份標本的real time-PCR檢測結(jié)果Figure 1 Real-time PCR amplification results of 20 cases of hand，foot and mouth disease

如圖1 所示，共有10條典型的陽性曲線，其中1條為陽性對照，其余9條為陽性標本，這9份標本的CT值小于35，可以確定為EV71陽性。通過核酸檢測，在所收集的20份標本中，有9份標本核酸檢測陽性，可以認為其陽性檢出率為45%(9/20)。

2.2 病毒分離

選用人喉癌上皮細胞(HEP-2)、非洲綠猴腎細胞(VERO)、人橫紋肌肉瘤細胞(RD)三種細胞進行病毒分離，將所采集的9份陽性標本分別加入細胞中，每份標本在三種細胞上至少傳三代，其中VERO細胞和RD細胞出現(xiàn)了細胞病變(CPE)，HEP-2沒出現(xiàn)CPE。

9份陽性標本接種VERO細胞第二代后，其中8瓶細胞于48 h左右出現(xiàn)了明顯的CPE，病變表現(xiàn)為細胞腫脹、變圓、聚集成葡萄串狀(圖2，見封3)。

9份陽性標本接種RD細胞第二代后，其中5瓶細胞于48 h左右出現(xiàn)了明顯的CPE，病變表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓脫落(圖3，見封3)。

2.3 病毒培養(yǎng)液的核酸檢測結(jié)果

我們在組織培養(yǎng)第三代時分別抽取Vero細胞和RD細胞的病毒培養(yǎng)液，進行real-time PCR實驗，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，共有15條典型的陽性曲線，其中1條為陽性對照，其余14條為陽性病毒培養(yǎng)液，這14份標本的CT值小于35，均在20左右，可以確定為EV71陽性病毒液。經(jīng)檢測，HEP-2細胞的病毒培養(yǎng)液，9份標本結(jié)果全部為陰性;RD細胞的病毒培養(yǎng)液，6份標本結(jié)果為陽性，3份標本結(jié)果為陰性;VERO細胞的病毒培養(yǎng)液，8份標本結(jié)果為陽性，1份標本結(jié)果為陰性。

3 討論

腸道病毒是引起嬰幼兒HFMD的病原，人類是其已知的唯一自然宿主，其中最主要的病原是EV71和CA16。與CA16相比，EV71感染更易侵犯神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致中樞神經(jīng)性心肺衰竭而導(dǎo)致死亡［3］。我國于2008年5月把手足口病納入法定傳染病，從法律上嚴格規(guī)定了該病的報告與管理［4］。衛(wèi)生部2010年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在丙類傳染病中，2009年HFMD報告發(fā)病數(shù)和報告死亡數(shù)均躍居第一位。HFMD已成為危害我國兒童健康的重要公共衛(wèi)生問題。遼寧省與其他各省的情況一樣，在2008年手足口病發(fā)病率是33.70/10萬、2009年的發(fā)病率是84.79/10萬，到2012年發(fā)病率為99.95/10萬，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。在病原構(gòu)成上，基本上EV71、CA16和其他腸道病毒各占三分之一，但在重癥及死亡病例的病原構(gòu)成上，EV71占有絕對優(yōu)勢，所以由腸道病毒EV71引起的手足口病造成的危害是不容小覷的［5］。

圖4 病毒培養(yǎng)液的real time PCR檢測結(jié)果Figure 4 Real-time PCR amplification results of the cultured viruses fluid

盡管我們現(xiàn)在有許多快速診斷的方法，諸如熒光定量PCR、膠體金等等，但是細胞培養(yǎng)進行病毒分離是病原檢測的金標準，可進行病毒分型和抗原變異分析［6］，所以在手足口病的疫情監(jiān)測和研究中依然是不可替代的方法。本實驗使用人喉癌上皮細胞(HEP-2)、非洲綠猴腎細胞(VERO)、人橫紋肌肉瘤細胞(RD)三種細胞對腸道病毒EV71型進行分離，結(jié)果表明腸道病毒EV71型對VERO細胞的敏感性最高，其次是RD細胞，對HEP-2細胞不敏感，因此我們認為分離腸道病毒EV71型首選的細胞是VERO細胞。VERO細胞是一種傳代細胞，其易培養(yǎng)、生長快，而且在有限的代次內(nèi)無致腫瘤性，在國內(nèi)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)［7］;而腸道病毒EV71型在VERO細胞上病變明顯，容易觀察，這就為用VERO細胞生產(chǎn)腸道病毒EV71型疫苗提供了一種可能性。

近幾年EV71疫苗研究取得了快速進展。從疫苗的緊急需求性、安全性等方面而言，滅活EV71疫苗是目前疫苗發(fā)展的主要類型，全球已有5株EV71滅活疫苗進入臨床試驗［8］，其中3株來自中國大陸的疫苗于2010年12月先后進入臨床試驗，目前均進入Ⅲ期臨床試驗。雖然臨床試驗顯示滅活EV71疫苗有較好的免疫原性及安全性，但其保護效果仍有待繼續(xù)評價。不僅如此，由其他腸道病毒引起的手足口病疫情也不容小覷，從全面控制手足口病的角度看，研制包括多種腸道病毒的聯(lián)合疫苗將是手足口病疫苗的發(fā)展方向。

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［4］于偉，姚文清，陳靜乙.遼寧省2008年 -2009年腸道病毒EV71型VP1區(qū)基因特征分析［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21(4):987-992.

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［6］陳健，李燕婷，王曄，等.膠體金法與病毒分離鑒定在流感診斷中的比較［J］.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，20(12):573-574.

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［8］唐培，余楠，車小燕，等.腸道病毒71型疫苗研究的新進展［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2014，35(8):1272-1274.