陳玲群，王練紅，周 金，王 林(懷化市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，懷化 48000;湖南醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)系)

速激肽受體(neutokinin receptor，NKR1-3)屬于G蛋白偶聯(lián)跨膜受體家族，主要表達(dá)在中樞神經(jīng)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)和乳腺細(xì)胞等組織［1］，其中NK1R基因轉(zhuǎn)錄成兩種mRNA，分別翻譯成全長(zhǎng)型(NK1R-Fl)和截?cái)嘈?NK1R-Tr)受體，兩型受體翻譯起始點(diǎn)一樣，mRNA前1 520 nt序列相同，二者所不同的是表達(dá)產(chǎn)物C端不一樣，而C末端在細(xì)胞內(nèi)，不同的C末端直接造成了兩類受體截然不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路［2］。NK1R受體基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游調(diào)控區(qū)存在E盒結(jié)構(gòu)。我們初步對(duì)NK1R基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游近段E盒結(jié)構(gòu)進(jìn)行點(diǎn)突變，通過熒光素酶報(bào)告基因載體［3］，研究E盒結(jié)構(gòu)的突變是否會(huì)影響下游基因的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 材料

胎牛血清(Fetal bovine serum.FBS)與 DMEM/F12培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胰酶消化液購(gòu)自北京天潤(rùn)善達(dá)生物制品有限公司;Promega限制性核酸內(nèi)切酶:mluⅠ、HxoⅠ，LB 液體培養(yǎng)基(pH7.4)與動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(D1700)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Biospin膠回收試劑盒BSC02M1、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN)、Roche FuGene轉(zhuǎn)染試劑、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒、PGL4.74 hluc內(nèi)參質(zhì)粒購(gòu)自 Promega公司;PGL3-basic熒光素酶報(bào)告基因載體系列;HBL-100、MCF-7細(xì)胞系來自湖南醫(yī)藥學(xué)院。

1.2 克隆含近端E盒結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子

1.2.1 野生型NK1R啟動(dòng)子的克隆 定位近端E盒“CACATG”結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，根據(jù)近端E盒位置利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增含一個(gè)近端E盒結(jié)構(gòu)的DNA序列。

HBL-100細(xì)胞用含100 ml/L胎牛血清的DMEM，置于37℃、50 ml/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，提取基因組DNA，作為擴(kuò)增模板。巢式PCR擴(kuò)增目的DNA片段，外向引物(nkw1上游引物:CAGGATTCTGGAGCTTCGTAT，nkw1下游引物:CTACCGTTTGAAATGGTCTTG)。擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性120 s，然后以94℃ 30 s，52℃ 復(fù)性30 s，68℃ 延伸70 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，68℃ 延伸10 min，4℃保存。以外向擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用內(nèi)向引物(NK1R上游引物:CGCCCTCGAGAGTTTCGCGGGCACCTCT，NK1R下游引物:AGCCACGCGTCTGAGCGACAAGCTGCCTA)擴(kuò)增，具體程序同前，延伸時(shí)間設(shè)為60 s。對(duì)第二輪PCR產(chǎn)物純化回收，得到NK1R野生型啟動(dòng)子，產(chǎn)物長(zhǎng)度為827 bp。

1.2.2 重疊延伸PCR對(duì)NK1R啟動(dòng)子近端E盒點(diǎn)突變 將巢式PCR產(chǎn)物純化回收后作為模板，進(jìn)行重疊延伸PCR，引入點(diǎn)突變CACAT G→CACAC G。第 一 輪 PCR 用 p1，p2引 物(p1:CGCCCTCGAGAGTTTCGCGGG CACCTCT，p2:CATCGCCCCCACACACGACCGTTTCCCATTG)擴(kuò)增短片段，p3，p4 引物 (p3:CAATGGGAAACGGTCGTGTGTGGGGGCGATG，p4:CACAACGCGTACCTCTTGTGCAGCCGCTCTA)擴(kuò)增長(zhǎng)片段;完成擴(kuò)增后，純化回收。第二輪PCR:把純化后的長(zhǎng)、短片段放到同一個(gè)反應(yīng)管中，相互作為模板和引物，反應(yīng)4個(gè)循環(huán)。第三輪PCR:以第二輪全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用p1，p4引物，即擴(kuò)增出帶有點(diǎn)突變的啟動(dòng)子。將PCR最后產(chǎn)物電泳，純化回收。

1.2.3 野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建把純化的野生型和突變型NK1R啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物以及PGL3-basic分別進(jìn)行mluⅠ和HxoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收。然后用T4 Ligase對(duì)PGL3-basic分別與NK1R野生型和突變型啟動(dòng)子進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為:T4 Ligase(Trans)3.5 μl，NK1R 8 μl，ddH2O 7 μl，5 ×buffer(Trans)5 μl，PGL3-basic 6 μl，16 ℃ 連接過夜，另設(shè)PGL3-basic自連反應(yīng)體系，確保酶切后的PGL3-basic不自連。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，用滅菌玻璃棒把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布到100 μg/ml氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16 h。每個(gè)平板挑取4個(gè)菌落，分別置入100 μg/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。每支LB菌液取1 ml送北京奧科生物公司測(cè)序，序列比對(duì)合格的菌落再進(jìn)行培養(yǎng)。提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒。用測(cè)序和XhoⅠ/mluⅠ 雙酶切電泳對(duì)啟動(dòng)子片段進(jìn)行鑒定，測(cè)得濃度為 360 μg/ml，A260/280=1.847。

1.3 雙熒光素酶檢測(cè)試劑檢測(cè)啟動(dòng)子活性

復(fù)蘇MCF-7乳腺癌細(xì)胞，為了確保細(xì)胞良好狀態(tài)接受轉(zhuǎn)染，從復(fù)蘇到細(xì)胞轉(zhuǎn)染至少傳至兩代。設(shè)定MCF-7組，MCF-7-NK1R野生組，MCF-7-NK1R突變組;質(zhì)粒為 PGL3-basic-NK1R+PGL4.74 hluc，PGL4.74 hluc作為內(nèi)參加入到所有試驗(yàn)組，PGL3-basic空載體轉(zhuǎn)染 MCF-7作為對(duì)照，PGL3-basic-NK1R野生型轉(zhuǎn)染野生組，PGL3-basic-NK1R突變型轉(zhuǎn)染突變組。把消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板，每組5孔，細(xì)胞培養(yǎng)至70%-80%融合時(shí)即開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h，把每孔培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至100 μl。FuGene Reagent和質(zhì)粒DNA平衡至室溫，用前混勻。吸取85 μl Opti-MEM1 Reduced Serum Medium 至各個(gè)稀釋孔中，按質(zhì)粒(μg):FuGene Reagent(μl)=2∶7 的比例配制質(zhì)粒DNA(包括內(nèi)參質(zhì)粒)和FuGene Reagent混合物，室溫放置15 min。每孔加7 μl FuGene Reagent和質(zhì)粒DNA混合物，培養(yǎng)板水平充分混勻后置入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)30 h檢測(cè)熒光素酶表達(dá)情況。檢測(cè)試劑Dual-Glo Luciferase Buffer與Luciferase Substrate混勻;Stop Glo Substrate與Stop Glo Buffer按1∶100混合混勻。檢測(cè)前把待測(cè)細(xì)胞孔內(nèi)的培養(yǎng)基調(diào)至75 μl，平衡至室溫，每孔加 75 μl Dual-Glo Luciferase Buffer＆ Luciferase Substrate混合液，混勻后室溫靜置10 min，檢測(cè)OD值，作為數(shù)據(jù)1。每孔再加75 μl Stop Glo Substrate＆Stop Glo Buffer混合液，混勻后室溫靜置10 min，檢測(cè)OD值，作為數(shù)據(jù)2。數(shù)據(jù)整理按以下公式(Rate表示相對(duì)熒光素酶活性):

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比率值采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U)，以P＜0.05為有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各類熒光素酶報(bào)告基因載體酶切電泳和測(cè)序圖

圖1 NK1R巢式PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子電泳圖Figure 1 NK1R promoters amplified by nested PCR

各類PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒通過1%瓊脂糖凝膠電泳，各條帶均出現(xiàn)在目的位置(見圖1);各類載體及PCR純化產(chǎn)物A260/280均在1.8-2.0。野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建完成后，經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定顯示兩類載體構(gòu)建成功(見圖2 -4)。

2.2 熒光素酶活性檢測(cè)

PGL3野生型組和PGL3突變型組熒光素酶相對(duì)活性明顯高于PGL3-basic組(P＜0.01);PGL3突變型組低于PGL3野生型組(P＜0.05，見表1)。結(jié)果 說明克隆的NK1R基因部分啟動(dòng)子DNA序列能夠啟動(dòng)下游基因表達(dá)，E-box序列點(diǎn)突變能夠影響該DNA序列的轉(zhuǎn)錄活性。

圖2 NK1R熒光素酶報(bào)告基因載體酶切Figure 2 NK1R luciferase report gene vectors digested by restriction enzyme

圖3 PGL3-basic-NK1R 826 bp熒光素酶報(bào)告基因載體部分序列Figure 3 The partial sequences of PGL3-basic-NK1R 826 bp luciferase report gene vector

圖4 點(diǎn)突變型NK1R熒光素酶報(bào)告基因載體測(cè)序Figure 4 The partial sequences of pGL3-basic-NK1R promoter point-mutated luciferase report gene vector

表1 野生型和突變型報(bào)告基因載體相對(duì)熒光素酶活性(±s)Table 1 The luciferase activity of wild and mutated report gene vectors(±s)

表1 野生型和突變型報(bào)告基因載體相對(duì)熒光素酶活性(±s)Table 1 The luciferase activity of wild and mutated report gene vectors(±s)

組別 相對(duì)熒光素活性PGL3空載組0.38 ±0.05 PGL3 野生型組 0.75 ±0.05 PGL3突變型組0.60 ±0.07

3 討論

在正常乳腺細(xì)胞膜提取物中，NK1R-Tr水平非常低，有時(shí)甚至難以檢出，有研究表明，乳腺癌細(xì)胞P物質(zhì)過量表達(dá)，導(dǎo)致了NK1R-Tr表達(dá)水平也上調(diào)，具體的中間過程，有可能P物質(zhì)直接作用，也有可能P物質(zhì)通過其他細(xì)胞因子激活NK1R-Fl表達(dá)，總之P物質(zhì)和NK1R，尤其是NK1R-Tr在乳腺上皮細(xì)胞共同高水平表達(dá)，暗示細(xì)胞惡變［4-6］。通過對(duì)NK1R轉(zhuǎn)錄起始上游序列的分析，發(fā)現(xiàn)有幾處E盒結(jié)構(gòu)，鑒于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游第一和第二個(gè)E盒相距較遠(yuǎn)，我們選擇性克隆了只含第一個(gè)E盒結(jié)構(gòu)的DNA序列，片段大小為826 bp，通過對(duì)E盒第5個(gè)堿基T置換為C，我們發(fā)現(xiàn)含突變E盒的DNA序列對(duì)下游熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄活性有所下降，我們的研究揭示近段第一個(gè)E盒結(jié)構(gòu)的完整對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性有一定的影響。

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