馬力天，李 潔，張 毅，任秦有，丁井永，趙參軍，杜江河，李 佩，毛立挺，鄭 瑾(解放軍68部隊(duì)營(yíng)衛(wèi)生所，隴西 78000;第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院中醫(yī)科暨中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科;解放軍醫(yī)院內(nèi)分泌科;解放軍68部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì);解放軍68部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì);通訊作者，E-mail:zjddln@6.com)

肝纖維化(liver fibrosis，LF)是肝內(nèi)結(jié)締組織的異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程，是許多慢性肝病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要特征，如肝細(xì)胞癌［1］和肝硬化［2］。多種原因可以導(dǎo)致LF的發(fā)生，如病毒感染、乙醇攝入、肝內(nèi)脂肪沉積、糖尿病、毒物等［3，4］。肝纖維化的特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過(guò)度沉積。肝纖維化的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前主要認(rèn)為肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活，轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞［5-8］，合成分泌大量ECM在LF的發(fā)病過(guò)程中起了主要作用。肝纖維化是一種可逆的損傷修復(fù)反應(yīng)［9］。HSC的激活是本病發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，因此，主要在以下幾個(gè)方面進(jìn)行肝纖維化的治療:①去除原發(fā)病因;②圍繞HSC進(jìn)行治療，如通過(guò)抑制PDGF和TGF-β來(lái)抑制HSC的活化、直接抑制HSCs的活性和抑制ECM的合成和分泌等。但是由于肝纖維化發(fā)病原因極其復(fù)雜，西藥在治療方面效果并不理想且費(fèi)用昂貴。而祖國(guó)醫(yī)學(xué)在這方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，不僅有價(jià)格優(yōu)勢(shì)，而且不良反應(yīng)較少。

根據(jù)其臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)“積聚”等病癥范疇，大量的研究表明［10-12］，中藥在治療本病方面有療效好，且毒副作用小的優(yōu)勢(shì)。因此，我們選擇中藥復(fù)方益氣活血方(Yiqihuoxue prescription)，以人肝星狀細(xì)胞LX-2為靶細(xì)胞，用MTT法觀察不同劑量藥物對(duì)其增殖的影響，用流式細(xì)胞術(shù)觀察藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，體外研究其對(duì)LX-2細(xì)胞的抑制作用，為進(jìn)一步研究其導(dǎo)致LX-2細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MTT試劑(晶彩生物有限公司)、Bio-rad酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))、四季青胎牛血清。LX-2細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程學(xué)研究中心邊惠潔教授贈(zèng)予，美國(guó) Bection Dickinson公司流式細(xì)胞儀，750 g多功能粉碎機(jī)、滲濾柱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 LX-2細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代

將LX-2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞孵箱中，每天換液1次。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度為80%-90%時(shí)，以胰酶37℃消化2-3 min傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物的制備

精選黃芪15 g、人參10 g等益氣藥物，莪術(shù)15 g、當(dāng)歸10 g等活血藥物共17味中藥組成復(fù)方益氣活血方(購(gòu)自西安市誠(chéng)信藥材行)。

制備過(guò)程:(1)提揮發(fā)油:①用750 g多功能粉碎機(jī)將益氣血活血方中當(dāng)歸、莪術(shù)，過(guò)1號(hào)篩，直至全部粉碎完畢。②先將益氣活血方中當(dāng)歸、莪術(shù)按1∶1的比例加入滲濾柱中，第1次加入1 500 ml的石油醚，以60滴/min的速度開(kāi)始滴，直至滴完，然后再加入2次石油醚，每次500 ml，以同樣的滴速滴完;③將滲濾出的石油醚+藥油裝入1 000 ml的燒瓶中，每次500 ml，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)，直至石油醚全部回收完成，將留下的揮發(fā)油裝入玻璃瓶中，密閉備用;④將滲濾柱中的藥粉倒出，使石油醚揮發(fā)完畢，干藥粉保存?zhèn)溆谩?2)熬藥:每劑250 g加水500 ml，按傳統(tǒng)煎藥法文火煎煮30 min取藥液，以恒溫水浴鍋濃縮成含生藥1.25 g/ml的湯劑，真空包裝，4℃冰箱保存。以上工作由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科中藥制作車間完成。

1.4 藥物濃度的選擇及稀釋

一個(gè)60 kg的病人，其體液量占總重量的20%，即12 L，熬成的藥物濃度為:1.25 g/ml，按照成年人每天服用50 ml計(jì)算，假定全部吸收，則其體內(nèi)藥物濃度為:(50 × 1.25)/12 000=5.21 mg/ml，但是藥物不可能被全部吸收，所以在我們進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇藥物濃度略低于5.21 mg/ml，因此選擇的藥物濃度為 1.125，2.228，3.31，4.37，5.41 mg/ml。在用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)，選擇藥物濃度為1.125，2.228，6.432 mg/ml。

由于1.25 g/ml的藥物很黏稠，所以在加藥時(shí)要進(jìn)行稀釋，其稀釋方法為:將100 μl的益氣活血藥物溶于1 000 μl的培養(yǎng)基中(含10%FBS和雙抗)，稀釋后藥物濃度為113.63 mg/ml。藥物稀釋后，用0.22 μm孔徑的濾器對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾除菌。

1.5 MTT法檢測(cè)LX-2細(xì)胞的增殖情況

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞，胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)將細(xì)胞濃度調(diào)為5×104cell/ml細(xì)胞懸液后，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液100 μl(即每孔5 000個(gè)細(xì)胞)，放在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至底面積的50%后，更換培養(yǎng)基，并且每孔分別加入過(guò)濾后的益氣活血藥物，使終濃度達(dá)到1.125，2.228，3.31，4.37，5.41 mg/ml;每一濃度設(shè) 4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照組，此外，設(shè)立單加藥物和培養(yǎng)基，不加細(xì)胞的對(duì)照組(觀察藥物是否會(huì)與MTT反應(yīng))。單獨(dú)作用24，48 h后，去除培養(yǎng)基，每孔加20 μl，5 mg/ml MTT 溶液，孵育 4 h，每孔加入二甲基亞砜150 μl，在微型混合器上振蕩10 min后于全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=(1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞，胰酶消化后，常規(guī)離心，用高糖DMEM(含10%胎牛血清)將細(xì)胞濃度調(diào)為5×104cell/ml細(xì)胞懸液后，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液2 000 μl，放在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待其長(zhǎng)到80%后，更換培養(yǎng)基，并且每孔分別加入益氣活血藥，使終濃度達(dá)到1.125，2.228，6.432 mg/ml。藥物作用 24 h 后，收集細(xì)胞(貼壁細(xì)胞用胰酶消化，懸浮細(xì)胞離心收集)，收集細(xì)胞后用PBS洗2次，根據(jù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記試劑盒說(shuō)明，取195 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC混勻，室溫反應(yīng)10 min，PBS洗細(xì)胞一次，在以190 μl稀釋的結(jié)合緩沖液重懸，加10 μl的PI，用流式細(xì)胞儀分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 益氣活血方對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of Yiqihuoxue prescription on the proliferation of LX-2 cells

2 結(jié)果

2.1 益氣活血方對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響

各時(shí)間點(diǎn)各濃度藥物對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖均有抑制作用(P＜0.05，見(jiàn)圖1)，24 h時(shí)隨藥物濃度增加，其抑制作用也逐漸增強(qiáng)(P＜0.05)，48 h時(shí)當(dāng)藥物濃度達(dá)到3.31 mg/ml時(shí)，其抑制作用不隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)(P ＞0.05)。除 4.37，5.41 mg/ml外，其余組隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制率也增高(P ＜0.05)。

2.2 益氣活血方對(duì)LX-2細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞在接受到相應(yīng)的信號(hào)刺激時(shí)會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)在細(xì)胞凋亡早期會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，AnnexinⅤ與PS高親和力特異性結(jié)合，檢測(cè)標(biāo)記熒光的AnnexinⅤ可以識(shí)別細(xì)胞的早期凋亡。在細(xì)胞凋亡的中晚期和死細(xì)胞，碘化丙啶(propidine iodide，PI)能透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此，聯(lián)合使用AnnexinⅤ與PI，可以將早晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。

凋亡結(jié)果顯示:細(xì)胞凋亡率(B2+B4)隨藥物濃度增加逐漸增加(見(jiàn)圖2)，其中B4為早期凋亡，B2為晚期凋亡，即，益氣活血方可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖2 益氣活血方作用24 h對(duì)LX-2細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Apoptosis of LX-2 cells after treated with Yiqihuoxue prescription for 24 h

3 討論

肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活、增殖在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［13，14］。西方醫(yī)學(xué)針對(duì)本病無(wú)特效藥，祖國(guó)醫(yī)學(xué)卻日益發(fā)揮出獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)。雖然在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中并無(wú)本病的具體病名，但可依據(jù)其臨床表現(xiàn)將其病機(jī)歸納為“氣滯血瘀”和“正氣虛弱”，在治療上當(dāng)強(qiáng)調(diào)“活血化瘀”與“扶正補(bǔ)虛”并用［15，16］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝體陰用陽(yáng)，性喜調(diào)達(dá)，惡抑郁，主藏血，各種原因?qū)е碌母螝庹{(diào)達(dá)不暢，日久則必生淤血?！把獮闅庵浮?，“淤血不去則新血不生”，血瘀日久，會(huì)導(dǎo)致氣生發(fā)無(wú)源，因此臨床上，此類病人往往伴有低熱、心煩等陰虛癥狀和少氣懶言、乏力等氣虛癥狀。目前，已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)中藥對(duì)肝纖維化有著較好的療效［17-20］。在本文中，我們使用益氣活血方(黃芪、人參、莪術(shù)、當(dāng)歸、熟地、三棱、紅景天等)，以人肝星狀細(xì)胞LX-2為靶細(xì)胞，來(lái)觀察該方劑對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的影響。當(dāng)歸，歸肝經(jīng)，重在引藥至肝所。黃芪、人參能夠大補(bǔ)元?dú)?，起到補(bǔ)氣行血的功效，熟地、三棱、莪術(shù)、紅景天連用，起到補(bǔ)血活血之功，余藥與此配伍，能起到益氣活血、涼血養(yǎng)陰之用，眾藥合用，共奏補(bǔ)肝之虛，養(yǎng)肝之陰，活肝之淤之功。

在藥物制備方面，我們將熬好的藥材稀釋后經(jīng)0.22 μm孔徑的濾器對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾除菌直接作用于細(xì)胞，與含藥血清的制備法相比，這樣可以排除其他一些成分對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，另外，這樣可以為后期制備給方劑的注射液提供參考。

從MTT的結(jié)果(圖1)中發(fā)現(xiàn)，益氣活血方可明顯抑制肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞的增殖，當(dāng)藥物作用48 h時(shí)，濃度達(dá)到3.31 mg/ml以上時(shí)，其抑制作用不隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，這可能與加藥時(shí)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)，我們?cè)谄渌膶?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未在文中體現(xiàn)):初始細(xì)胞數(shù)量較多時(shí)，藥物作用24 h和48 h后，其抑制率依然會(huì)隨著藥物濃度的增加而增加。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始細(xì)胞數(shù)目較多時(shí)，低濃度(1.125，2.228 mg/ml)的MTT檢測(cè)結(jié)果要高于空白對(duì)照組，但是隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其OD值逐漸降低。這可能是因?yàn)?，我們的?fù)方中黃芪、人參的含量較高，這種益氣藥本身可以增強(qiáng)人體抵御外邪的能力，根據(jù)中醫(yī)“正邪相抗”的理論，當(dāng)“正盛而邪不衰時(shí)”，正邪之間抗?fàn)巹×遥虼水?dāng)?shù)蜐舛鹊囊鏆饣钛阶饔糜诩?xì)胞時(shí)，會(huì)使細(xì)胞因受到刺激產(chǎn)生某種方式的代償，細(xì)胞代謝增強(qiáng)，線粒體活性增加，產(chǎn)生較多的琥珀酸脫氫酶使外源性的MTT還原生成較多的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，但隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，“正邪相抗”的平衡被打破，正氣漸強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞活性最終受到抑制。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，益氣活血方能促進(jìn)其凋亡。因此，我們的研究表明，益氣活血方可以有效地抑制LX-2細(xì)胞增殖，促進(jìn)LX-2細(xì)胞凋亡，為將來(lái)更進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

致謝：真誠(chéng)感謝第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系放射醫(yī)學(xué)教研室郭國(guó)禎主任、王晉副教授，感謝他們?cè)趯?shí)驗(yàn)平臺(tái)、技術(shù)等多方面給予的指導(dǎo)和幫助，感謝第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程學(xué)研究中心邊惠潔教授給予LX-2細(xì)胞系。

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