唐麗娟，陳 勇，楊 拯，李 曉，張 曉(成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，成都 610500;通訊作者，E-mail:yzixjj@163.com)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)所造成的外傷性截癱是最嚴(yán)重的外傷之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)SCI的發(fā)病率大約每年(20-40)/100萬人。隨著現(xiàn)代交通工具使用的增加，臨床上脊柱外傷合并SCI的病例有逐漸增多的趨勢。因此，SCI的病理生理的實(shí)驗(yàn)研究及治療方法的探索受到了更廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)［1］，繼發(fā)性脊髓損傷的機(jī)制可能是SCI后免疫炎癥反應(yīng)，其他各種損傷機(jī)制均由免疫炎癥反應(yīng)引起，并有發(fā)現(xiàn)減輕SCI后早期炎癥反應(yīng)可以起到神經(jīng)保護(hù)和功能恢復(fù)的作用［2］。因此，在脊髓損傷早期，有效地控制脊髓的繼發(fā)性損傷是一個(gè)重要的研究方向。

番茄紅素(lycopene，LP)是一種開鏈?zhǔn)降牟伙柡皖惡}卜素，具有多種優(yōu)越的生理功能，有著廣泛的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)［3］，番茄紅素可通過其高效猝滅單線氧態(tài)和清除自由基的能力，減輕大鼠脊髓損傷后的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，還可通過多種途徑發(fā)揮抗免疫炎癥反應(yīng)的作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色檢測脊髓損傷模型脊髓組織中NF-κB的表達(dá)，以及后肢功能BBB評分，探討番茄紅素治療脊髓損傷后NF-κB表達(dá)對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康、清潔級成年SD大鼠36只，雌性(雌性大鼠尿道短，尿道感染、水腫發(fā)生概率低，不易形成尿道阻塞，有利于脊髓損傷術(shù)后護(hù)理，可提高術(shù)后大鼠生存率)，體重(230±20)g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(川)-10-2006。將36只大鼠按Allen法［4］造脊髓損傷模型后采用隨機(jī)數(shù)據(jù)表法分為3組:對照組、甲潑尼龍琥珀酸鈉治療組(MP組)和番茄紅素組，每組12只。每組再隨機(jī)按1，3，7 d分成3個(gè)亞組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只。

1.2 主要試劑和儀器

6%番茄紅素油樹脂(新疆瑞德萊福生物科技有限公司)，批號(hào):HY1007261;注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(天津藥業(yè)焦作有限公司)，批號(hào):10031501;戊巴比妥鈉(德國進(jìn)口分裝，北京化學(xué)試劑公司)，批號(hào):100808;注射用青霉素鈉(瑞陽制藥有限公司)，批號(hào):10013101;NF-κB一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，批號(hào):D-C1-07C14B;兔抗大鼠二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);批號(hào):07E04AJ;自制數(shù)字式脊髓損傷動(dòng)物模型制備儀。

1.3 模型制備

選取正常SD大鼠，采用腹腔注射麻醉1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，首先剪除大鼠胸椎區(qū)域毛，而后均勻噴灑碘伏溶液兩倍備皮區(qū)域。以T9棘突為中心做背部正中切口，長約2 cm，逐步暴露淺筋膜、肌肉直到椎骨，再用手術(shù)刀小心去除T9椎骨上的肌肉。隨后進(jìn)行椎板切除術(shù)，用有齒鑷剝離T9棘突和椎間軟組織，然后用持針器慢慢剝開錐板(切勿損傷硬脊膜)，暴露脊髓，并適當(dāng)修剪兩側(cè)錐板以獲得良好顯露，用自制數(shù)字式脊髓損傷動(dòng)物模型制備儀打擊器制成脊髓損傷模型，打擊強(qiáng)度為10 g×25 mm，打擊后即刻見大鼠雙后肢發(fā)生不同程度抽搐，尾巴甩動(dòng)，隨后完全松弛，標(biāo)志模型制備成功，然后逐層縫合手術(shù)創(chuàng)口。術(shù)后立即腹腔注射9 ml/kg氯化鈉溶液，以減輕手術(shù)過程中出血導(dǎo)致的血容量減少。為了避免感染，還要進(jìn)行青霉素腹腔注射，并在此后3 d每天腹腔注射8×104U青霉素。術(shù)后保持大鼠籠具清潔，身體干凈，使其自由進(jìn)食、飲水。并每天在相應(yīng)時(shí)刻對大鼠進(jìn)行排尿，直至其恢復(fù)自主排尿。

1.4 治療方法

對照組造模成功后不給予治療。MP組造模成功后30 min采用腹腔注射首次給藥，其劑量為30 mg/kg甲潑尼龍琥珀酸鈉，此后24 h注射4次甲潑尼龍琥珀酸鈉，每6 h注射5.4 mg/(kg·h)進(jìn)行。番茄紅素組造模成功后30 min灌胃溶有番茄紅素油樹脂的玉米油2 ml(按20 mg/kg番茄紅素配制)，此后每天灌胃1次。

1.5 評定方法

每組大鼠按1 d、3 d和7 d亞組進(jìn)行評定。

1.5.1 BBB 評分 于術(shù)后1，3，7 d采用 Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分［5］法評估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。觀察者為非本實(shí)驗(yàn)人員，并且對評分標(biāo)準(zhǔn)十分熟悉。評分前應(yīng)檢查所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膀胱是否充盈，以免因膀胱肌充盈而影響活動(dòng)。動(dòng)物應(yīng)盡量保持在活動(dòng)范圍的中心區(qū)域活動(dòng)。采用雙人雙盲法觀察其后肢運(yùn)動(dòng)情況，聯(lián)合考察大鼠后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)、后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能、運(yùn)動(dòng)時(shí)爪子的精細(xì)運(yùn)動(dòng)。取左右兩側(cè)肢體評分平均值作為最后得分。

1.5.2 組織學(xué)分析 術(shù)后1，3，7 d，各組分別取7只大鼠，以1.5%戊巴比妥鈉麻醉后，開胸暴露心臟和升主動(dòng)脈，將灌注插管經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，固定插管剪開右心房?？焖俟嘧⒈睇}水沖凈血液至肝臟及鞏膜蒼白為止，立即轉(zhuǎn)換4%多聚甲醛灌注150-200 ml，其中前1/3快速灌注，后2/3緩慢灌注，至鼠體變硬時(shí)停止。原路顯露并仔細(xì)咬除T7-T10棘突和椎板，切取1 cm損傷區(qū)域脊髓組織，然后進(jìn)行石蠟包埋，損傷段做橫行切片，片厚5 μm(20 μm)，用于免疫組織化學(xué)檢測 NF-κB。

1.5.3 圖像采集與分析 每個(gè)免疫組化標(biāo)本取一張切片，在同等亮度、像素、曝光、對比度等條件下使用Olympus拍照系統(tǒng)用10×40放大倍數(shù)，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，對每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)一圖像拍照。最后用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)視野的平均光密度值，光密度值越大表示NF-κB表達(dá)越高。

1.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素ANOVA進(jìn)行分析，顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

大鼠術(shù)后蘇醒，靜臥少動(dòng)，氣息較微，雙后肢運(yùn)動(dòng)功能喪失，肌張力降為零，無食欲，不進(jìn)水，尿失禁或下腹部膨隆，膀胱發(fā)生尿潴留，呈現(xiàn)不完全脊髓損傷的表現(xiàn)。術(shù)后前3 d，大鼠活動(dòng)、進(jìn)食較少，尿潴留比較嚴(yán)重，部分伴血尿及腹部脹氣，此后飲食逐漸增加活動(dòng)逐漸增多。由于實(shí)驗(yàn)期間護(hù)理良好，5-7 d后，大部分大鼠能夠基本恢復(fù)自主排尿，且傷口未見感染，身體未出現(xiàn)褥瘡，36只大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 BBB 評分

術(shù)前所有大鼠評分均為21分。術(shù)后1，3，7 d，番茄紅素組與對照組相比，BBB評分均明顯增高(P＜0.05)，MP組術(shù)后1，7 d評分顯著高于對照組(P＜0.05，見表1)，3 d雖也高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 大鼠造模后1 d，3 d和7 d NF-κB核轉(zhuǎn)移情況 (免疫組化染色，×400)Figure 1 NF-κB nuclear transfer at 1 d，3 d and 7 d after SCI (immunohistochemical staining，× 400)

表1 脊髓損傷大鼠BBB評分結(jié)果 (分)Table 1 Com parison of BBB scores of rats after spinal cord injury (scores)

2.3 NF-κB 檢測結(jié)果

術(shù)后1 d番茄紅素組的NF-κB表達(dá)與對照組NF-κB表達(dá)比較(P＜0.001)。術(shù)后3 d和7 d MP組和番茄紅素組NF-κB的表達(dá)均明顯低于對照組(P ＜0.001，見表2)。對照組 NF-κB 的表達(dá)隨時(shí)間而增多，7 d最多;MP組和番茄紅素組NF-κB的表達(dá)隨時(shí)間而減少，7 d最少。對照組可見大量NF-κB陽性表達(dá)顆粒，顆粒著色深。MP組和番茄紅素組NF-κB陽性表達(dá)顆粒較模型組少，著色較淺(圖1，見第608頁)。

表2 脊髓損傷大鼠NF-κB的變化Table 2 Com parison of expression of NF-κB after spinal cord injury

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，免疫炎癥反應(yīng)對繼發(fā)性脊髓損傷有著直接的影響［6］，而炎性細(xì)胞因子的表達(dá)更是貫穿炎癥反應(yīng)的始終。炎性細(xì)胞因子主要是由機(jī)體的免疫細(xì)胞分泌，正常情況下，炎癥細(xì)胞因子含量極低，但在各種因素刺激如感染、外傷、缺血后其表達(dá)可急劇增加，過度表達(dá)可導(dǎo)致或加重組織損傷［7］。因此，減輕SCI后的早期炎癥反應(yīng)是治療脊髓損傷的有效途徑之一。

NF-κB被認(rèn)為是調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的總源頭［8］。正常情況下，NF-κB是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下與抑制性蛋白IκB結(jié)合并以非活性狀態(tài)存在于胞質(zhì)內(nèi)。經(jīng)一定的刺激后，IκB磷酸化和隨后的泛素化降解。NF-κB自由易位到細(xì)胞核內(nèi)，與DNA結(jié)合，激活反應(yīng)的靶基因?qū)е赂鞣N各樣的炎癥反應(yīng)，活化后并上調(diào)各種炎癥介質(zhì)，如:TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 及氧自由基等一系列物質(zhì)［9］。近年來許多研究表明，SCI后產(chǎn)生一些氧自由基和細(xì)胞因子可刺激神經(jīng)細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB激活進(jìn)入胞核并與靶序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，如ICAM-1、TNF-a、IL-1、IL-6 等，其基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子中均含有與NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，形成一種正反饋增加損傷區(qū)的炎癥反應(yīng)，增加組織損害程度。因此，在脊髓損傷的早期抑制NF-κB的激活可以減輕免疫炎癥反應(yīng)，促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的再生與修復(fù)，加快脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

番茄紅素(lycopene，LP)是一種開鏈?zhǔn)降牟伙柡皖惡}卜素，抗氧化性能是天然類胡蘿卜素中最強(qiáng)的，其抗氧化能力是β-胡蘿卜素的2倍，維生素E的100倍［10］。最早的有關(guān)番茄紅素生物活性的報(bào)道是在1959年，Ernster和他的同事們發(fā)現(xiàn)在輻射后的小鼠腹腔內(nèi)注射番茄紅素后生存率提高了，并能抵抗細(xì)菌的感染。我們在前期的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，番茄紅素通過其高效猝滅單線氧態(tài)和清除自由基的能力，減輕了大鼠脊髓損傷后的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［2］。大量研究還顯示，番茄紅素還能通過多種途徑發(fā)揮其抗免疫炎癥反應(yīng)的作用［11，12］。Feng 等［13］發(fā)現(xiàn)番茄紅素通過抑制巨噬細(xì)胞中ERK，p38MAPK和NF-κB激活來抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)NO和IL-6的產(chǎn)生，從而減少免疫炎癥反應(yīng)。研究報(bào)道［14］番茄紅素能抑制脂肪組織中 TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6和 MCP-1等致炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，以預(yù)防和限制與肥胖有關(guān)的疾病。番茄紅素還可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，抑制人大腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞的細(xì)胞增殖，發(fā)揮其抗癌活性［15］。綜上所述，番茄紅素可以通過清除自由基、抑制氧自由基的產(chǎn)生，抑制 IL-1、TNF-α、IL-6等炎性因子的產(chǎn)生和NF-κB的激活，減輕炎癥反應(yīng)對組織細(xì)胞的傷害。

本研究結(jié)果顯示，番茄紅素能有效促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，番茄紅素組的BBB評分在造模后各時(shí)間點(diǎn)均高于同時(shí)間點(diǎn)SCI模型組，且差異有顯著性。同時(shí)，番茄紅素組NF-κB核轉(zhuǎn)運(yùn)在各時(shí)間點(diǎn)均明顯少于SCI模型組，在損傷后3 d，各組NF-κB表達(dá)量最多。隨著時(shí)間的延長，甲潑尼龍琥珀酸鈉治療組和番茄紅素治療組NF-κB的表達(dá)明顯降低，且番茄紅素組比表達(dá)最少，這表明番茄紅素可通過在SCI后抑制NF-κB激活，減輕炎癥反應(yīng)脊髓血管及神經(jīng)細(xì)胞等的繼發(fā)損傷，起到對神經(jīng)組織的保護(hù)作用，從而有效促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)為番茄紅素臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，它作為新型功能性天然營養(yǎng)素，具有抗氧化和抗炎等多種生物學(xué)功能，用于治療脊髓損傷安全、副作用小，有望成為臨床治療SCI的備選藥物之一，但其保護(hù)作用的具體機(jī)制還不清楚，有必要進(jìn)一步深入探討和研究。

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