魏亦寒，鄭斯竹，蔡 平，詹國(guó)輝，高 淵

(1.蘇州大學(xué)金螳螂建筑與城市環(huán)境學(xué)院，江蘇蘇州，215123;2.蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇蘇州， 215000)

蚧蟲又稱介殼蟲，屬于昆蟲綱Insecta 半翅目Hemiptera 蚧總科Coccoidea。據(jù)ScaleNet 統(tǒng)計(jì)，除化石昆蟲14個(gè)科之外，全世界共記錄48 科1050 屬7500 余種，我國(guó)已知116 科249 屬830種，是一類分布廣、寄主多的植食性昆蟲，除少部分為資源昆蟲外，多為農(nóng)林業(yè)中發(fā)生普遍且為害嚴(yán)重的害蟲(汪永慶，2001;Kozar，2008;武三安，2009;Ben-Dov et al.，2012;羅梅等，2012)。該類群的成蟲和若蟲主要在寄主植物的幼嫩部位取食危害，導(dǎo)致樹勢(shì)衰弱;亦可傳播病原微生物導(dǎo)致植物病害大面積的發(fā)生;另外蟲體排出的蜜露常誘致煤煙病的產(chǎn)生，影響光合作用，對(duì)松林資源、自然景觀等的生態(tài)影響巨大。

長(zhǎng)期以來，基于介殼蟲形態(tài)特征的分類研究具有局限性:首先，介殼蟲體形較小或微小，有些種類鮮見雄蟲，可供比較的形態(tài)學(xué)特征有限;其次，形態(tài)分類特征不穩(wěn)定，如有些粉蚧的個(gè)體大小、剛毛的長(zhǎng)短、透明孔的有無等都可能受外部環(huán)境的影響(齊曉豐，2008);再者，傳統(tǒng)形態(tài)分類通常對(duì)專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，只有分類專家或者經(jīng)過專門培訓(xùn)的人員才能開展此項(xiàng)工作;此外，口岸檢疫部門在實(shí)際工作中，截獲的入境蚧蟲不一定為成蟲，有時(shí)是若蟲，甚至是不完整的蟲體殘?bào)w、蛻皮等(Kondo et al.，2008;Utsugi，2011)，無法通過形態(tài)特征進(jìn)行快速有效地鑒定。

近年來，昆蟲分子生物學(xué)迅速發(fā)展起來，在分子鑒定和系統(tǒng)演化兩個(gè)方面的應(yīng)用較為廣泛，通過研究昆蟲核酸分子結(jié)構(gòu)探求各類群之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系(唐克軒等，2002;Robertson，2003;晏慧君等，2006)。利用分子生物學(xué)技術(shù)，可以有效地揭示自然種群中遺傳結(jié)構(gòu)、基因流動(dòng)和選擇作用等問題，為昆蟲的分類鑒定提供新的技術(shù)和方法(Downie et al.，2004;Frézal and Leblois，2008;劉明輝等，2009)。本文針對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)在蚧蟲系統(tǒng)發(fā)育以及種類鑒定的應(yīng)用予以綜述，并對(duì)其存在的問題進(jìn)行討論，以期為蚧蟲類昆蟲的分類鑒定提供幫助。

1 蚧蟲分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)

目前蚧蟲類昆蟲分子生物學(xué)的研究，以粉蚧科Pseudococcidae 和盾蚧科Diaspididae 居多，研究?jī)?nèi)容主要是對(duì)整個(gè)基因組DNA(genome DNA)，mtDNA(mitochondrial DNA，線粒體DNA)、rDNA(ribosomal DNA，核糖體 DNA)及satDNA(satellite DNA，衛(wèi)星DNA)等特定部分DNA 的研究(Aljanabi and Martinez，1997;Ashfaq et al.，2010;Hosseini and Hajizadeh，2011)，其中以rDNA 和mtDNA 應(yīng)用居多。

核糖體DNA 是核DNA 基因組中度重復(fù)簇的一個(gè)組分，18S 基因是rDNA 中保守性最好的部分，ETS、ITS 和IGS 等非編碼區(qū)有高度的多態(tài)性，這些特征使rDNA 常用來鑒別蚧蟲種下至高級(jí)分類階元的分析(Park et al.，2010)，已有研究證明，18S、28S、EF-lα 基因是盾蚧亞科下屬級(jí)分類單元分子系統(tǒng)發(fā)育的有效基因標(biāo)記之一，適于遠(yuǎn)緣物種關(guān)系，也可用于推斷早期的進(jìn)化事件(Annstrong et al.，1997;Cook et al.，2002;鐘濤，2002;Downie et al.，2004;魏久鋒等，2009;何衍彪，2012)，5.8S 基因包含的信息量最少，目前極少應(yīng)用。

線粒體DNA 是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA 分子，廣泛存在于昆蟲體內(nèi)富含線粒體的飛行肌和卵等組織細(xì)胞中，大小一般為15.4-16.3 kb，以高拷貝數(shù)目存在于線粒體內(nèi)，因其屬于細(xì)胞器基因組，缺乏細(xì)胞核基因組中的保護(hù)機(jī)制，因而變異較為明顯，能夠反映較短時(shí)間內(nèi)的進(jìn)化事件，被廣泛應(yīng)用于蚧蟲種間及種下的鑒別。蚧蟲分子研究最多的線粒體基因有12S rRNA、16S rRNA、COI(cytochrome coxidase subunit I，線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I)和COII，而COIII、cytb(Cytochrome b)、ND4(NADHdehydroge-nase4)和ND 5 研究報(bào)道較少，ND1 和ND 2 則甚少應(yīng)用(趙鴻等，2004)。一般情況下，12S rRNA 和16S rRNA 比較適合于研究屬間、不同種團(tuán)以及分化時(shí)間較早的系統(tǒng)關(guān)系，COI、COII、ND1 和ND2則經(jīng)常用于分析親緣關(guān)系密切的種、亞種及地理種群之間的系統(tǒng)關(guān)系。

截至2014年12月29 日，NCBI 上共記載了蚧總科昆蟲核苷酸序列286744 條，主要集中于18S基因、28S 基因、COI 基因和COII 基因，其中18S基因763 條，28 S 基因2168 條，COI 基因1810 條，COII 基因266 條。

2 分子生物學(xué)技術(shù)在蚧蟲分類鑒定中的應(yīng)用

近年來迅速發(fā)展起來了一系列分子生物學(xué)方法，如RFLP、RAPD、SSR、ISSR 和DNA 條形碼技術(shù)等，并很快被應(yīng)用于昆蟲的物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化等的研究中，主要解決蚧蟲分類系統(tǒng)存在的問題，集中于其功能基因、親本起源和協(xié)同進(jìn)化等方面的研究。

2.1 各種分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

2.1.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內(nèi)切酶切片長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)是基于生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中因突變、重組等原因引起核苷酸發(fā)生替換、插入或缺失等，使同源生物限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生變化，用限制性內(nèi)切酶處理不同生物個(gè)體的DNA，依據(jù)所產(chǎn)生的大分子片段的長(zhǎng)度和數(shù)目差異，反映限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)在DNA 分子上的分布，計(jì)算DNA 間的遺傳距離，據(jù)此來判定個(gè)體間、群體間或種間的差異(閆華超等，2006;黃映萍，2010)。鑒于RFLP 的來源于自然變異，穩(wěn)定性高，且特定的切割位點(diǎn)使其具有較高的可靠性，日前在蝗蟲、線蟲、蚊類、蟻類、棉鈴蟲等昆蟲中應(yīng)用較為廣泛，而且多選擇mtDNA，而蚧蟲研究中雖有涉及，但多是結(jié)合PCR 技術(shù)聯(lián)合分析，以確定其種類所屬。

針對(duì)蚧蟲屬、族、種內(nèi)不易確定分類地位的物種，Chiu 等(2004)運(yùn)用RFLP 技術(shù)對(duì)蘇鐵白輪盾蚧Aulacaspis yasumatsui、月橘白輪盾蚧A.murrayae 和樟白輪盾蚧A.yabunikkei 的rDNA 的18S、ITS 1 及部分的5.8 S 區(qū)域擴(kuò)增，蘇鐵白輪盾蚧和月橘白輪盾蚧均產(chǎn)生500 bp 的DNA 片段，而樟白輪盾蚧則產(chǎn)生約450 bp 的DNA 片段;之后對(duì)擴(kuò)增出的ITS1 區(qū)域進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切割，結(jié)果以內(nèi)切酶TaqI 的酶切圖譜鑒別效果最佳，因此rDNA/PCR-RFLP 技術(shù)可用于區(qū)別這3種盾蚧，白輪盾蚧屬Aulacaspis spp.昆蟲為廣西、臺(tái)灣等地的重要入侵種，在蘇鐵Cycansrevoluta Thunb.植物上危害日趨嚴(yán)重，該研究為檢疫口岸蚧蟲種級(jí)分類階元的快速鑒定提供了技術(shù)支持。Rung 等(2009)利用RFLP-PCR 技術(shù)成功區(qū)分大洋臀紋粉蚧Planococcus minor 和柑橘粉蚧P.citri，并能將其與來自夏威夷的柑橘粉蚧種群相區(qū)分，研究表明RFLP 技術(shù)能夠確定蚧蟲地理種間的親緣關(guān)系，為蚧蟲種屬特異性鑒定提供有效手段，是蚧蟲分類和進(jìn)化可靠的證據(jù)。Burban 等(1999)用PCR-RFLP-SSCP 技術(shù)研究日本松干蚧Matsucoccns matsumurae mtDNA 的多態(tài)性，并將其與已有的寄主樹種的遺傳信息相比較，結(jié)果出現(xiàn)三條不重疊的條帶，由此指出日本松干蚧的種群變異與寄主植物的遺傳結(jié)構(gòu)有關(guān)，當(dāng)?shù)胤N大多表現(xiàn)為協(xié)同進(jìn)化，而其他的則因?yàn)榉N內(nèi)寄主轉(zhuǎn)換而有所不同，這可能與人為設(shè)定樹種有關(guān)，此次研究為構(gòu)建蚧蟲基因組連鎖圖譜、蚧蟲基因變異影響因素的奠定了基礎(chǔ)，尤其對(duì)蚧蟲屬級(jí)分類階元的界定進(jìn)行了補(bǔ)充。RFLP 技術(shù)與SSCP、PCR 技術(shù)聯(lián)合的發(fā)展方向，對(duì)RFLP 技術(shù)的不足之處是一種技術(shù)層次上的彌補(bǔ)，目前國(guó)內(nèi)外單獨(dú)利用RFLP 技術(shù)對(duì)目標(biāo)昆蟲開展的研究已經(jīng)不能滿足需求，若能借鑒植物病原菌和同翅目其他昆蟲如蚜蟲、飛虱等的鑒定技術(shù)，并以隨后興起的AFLP 技術(shù)(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)為參考，做出改進(jìn)，通過Southern 雜交與放射性顯影技術(shù)相結(jié)合，檢測(cè)與探針DNA 有同源性的片段(黃可輝等，2005;李獻(xiàn)梅等，2009;黃映萍，2010)，則更能拓寬該技術(shù)在蚧蟲分子研究方面的應(yīng)用范圍，突顯其優(yōu)勢(shì)。

2.1.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 技術(shù)

RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)是1990年Williams 提出的DNA 分子多態(tài)檢測(cè)技術(shù)，其原理是利用一系列隨機(jī)排列的堿基組成的寡聚核苷酸(通常為9-10個(gè)堿基)單鏈作為引物，對(duì)所研究的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酸胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，EB 顯色或放射性自顯影來檢驗(yàn)DNA 片段的多態(tài)性，借此反映基因組相應(yīng)區(qū)域 的 DNA 的多態(tài)(Williams and Kubelik，1990)。此技術(shù)最早應(yīng)用在蚜蟲的寄生蜂種群的鑒定和區(qū)分上，隨后在按蚊、寄生蜂、舞毒蛾、蝗蟲、蚜蟲、粉虱等昆蟲中均有應(yīng)用(Black et al.，1992;劉春林等，2003)。Ben-Dov 等(2000)利用RAPD 技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，對(duì)1872年定名的一種星蠟蚧Ceroplastes vinsonii Signoret 重新確定，發(fā)現(xiàn)其是1881年定名的龜蠟蚧(C.floridensis Comstock)的同種異名，對(duì)來自Reunion 的蠟蚧屬新種C.reunionensis 與紅蠟蚧C.Rubens 進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)它們雖然在形態(tài)特征上相似，但在分子水平上兩個(gè)種的種間和種內(nèi)都有差異，說明RAPD技術(shù)對(duì)蚧蟲分類地位和傳統(tǒng)分類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修正。

總結(jié)以上研究結(jié)果得出,磁共振在乳腺癌診斷中具有較顯著的臨床價(jià)值,確診率較高,誤診率及漏診率較低,可為臨床醫(yī)師診斷病情提供依據(jù),值得各醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。

昆蟲的種群遺傳分化與種群本身的適應(yīng)性有關(guān)，而且受環(huán)境因素的影響，據(jù)研究，蚧蟲種群分化同時(shí)受到寄主因素和地理因素的雙重影響。李夢(mèng)等(2006)利用5 條隨機(jī)引物(S61、S64、S67、H9、H16)對(duì)河北不同地區(qū)種群的10個(gè)蚧蟲種群進(jìn)行研究，結(jié)果顯示不同地理來源的皺大球蚧 Eulecanium kuwanai 和瘤堅(jiān)大球蚧 E.gigantean 之間已經(jīng)產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化，遺傳差異與地理距離呈正相關(guān);寄生于白蠟Fraxinus chinensis 和刺槐Robinia pseudoacacia 兩種不同寄主植物上的扁平球堅(jiān)蚧Parthenolecanium corni種群之間存在一定程度的遺傳差異，隨后，高寶嘉等(2007)也取得了相同的結(jié)果;劉全超(2012)根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn)檢以相同的方法和設(shè)計(jì)思路檢測(cè)了來自河北邯鄲、石家莊和保定3個(gè)地區(qū)16個(gè)不同寄主白蠟Fraxinus chinensis、紫葉碧桃Amygdalus persicaf pendula、月季Rosa chinensis、紫葉李Prunus cerasifera ehrhar f.atropurpurea、二球懸鈴木Platanus acerifolia、稠李Psdus racemosa、杜梨Pyrus betulaefolia、楓楊Pterocarya stenoptera、木槿Hibiscus syriacus、垂絲海棠Malus halliana、紫薇Lagerstroemia indica 和華桑Morus cathayana 的草履蚧Drosicha corpulenta種群之間的DNA 多態(tài)性，結(jié)果顯示不同寄主來源的草履蚧已產(chǎn)生明顯的種群分化，而同種寄主不同地理種群也存在遺傳差異。上述三項(xiàng)研究結(jié)果趨同，這可能與蚧蟲的生態(tài)習(xí)性、地理位置和生態(tài)環(huán)境有密切關(guān)系。RAPD 技術(shù)穩(wěn)定性差的問題一直是爭(zhēng)議的焦點(diǎn)，此實(shí)驗(yàn)分別對(duì)擴(kuò)增體系中各種反應(yīng)物梯度和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，摸索了適合實(shí)驗(yàn)材料的理想的退火溫度，同時(shí)利用酯酶同工酶標(biāo)記技術(shù)對(duì)RAPD 標(biāo)記的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，建立了RAPD 對(duì)蚧蟲的最適反應(yīng)體系，但作者認(rèn)為必須使用一定數(shù)量的引物以獲得足夠的基因用于分析。

部分蚧蟲在系統(tǒng)發(fā)育上和蟲種問題方面長(zhǎng)期存在歧義，松干蚧是松樹上一類比較古老的昆蟲，針對(duì)我國(guó)松干蚧的蟲種問題，蚧蟲學(xué)界分類主張各不相同，湯枋德(1978)認(rèn)為分布于遼寧的松干蚧是一個(gè)新種，但是楊平瀾等(1976)認(rèn)為分布于遼、魯、江、浙的松干蚧均為日本松干蚧，楊鈐等(2006)采用優(yōu)化的RAPD 技術(shù)和篩選出的4 條長(zhǎng)度為10 bp 的隨機(jī)引物(S500、S1415、11N010145 和11N010146)對(duì)來自浙江金華、山東青島、遼寧撫順的3個(gè)松干蚧地理種群進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增，證明這3個(gè)地理來源的松干蚧均為日本松干蚧，并由UPGMA 聚類分析推測(cè)浙江金華的松干蚧極有可能是從山東青島傳過去，此研究重新評(píng)估了松干蚧屬，為解決我國(guó)松干蚧的分布和物種問題提供了借鑒。陳航(2007)對(duì)采自不同寄主的7種紫膠蟲進(jìn)行多態(tài)性分析，聚類分析結(jié)果表明，田紫膠蟲Kerria ruralis 與尼泊爾紫膠蟲K.nepalensis、普薩紫膠蟲K.pusana 親緣關(guān)系緊密，與云南紫膠蟲K.yunnaensis、中華紫膠蟲K.chinensis 關(guān)系較遠(yuǎn)，其中田紫膠蟲與中華紫膠蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，信德紫膠蟲K.sindica 和紫膠蚧K.lacca 與其它5種紫膠蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該論文澄清了云南紫膠蟲與紫膠蚧、中華紫膠蟲三者之間，證實(shí)了信德紫膠蟲與紫膠蚧緊密的姐妹群，但還需要篩選出更多獨(dú)立進(jìn)化的基因標(biāo)記進(jìn)行分析和比較，才能徹底澄清紫膠蟲系統(tǒng)發(fā)育研究中存在的疑點(diǎn)。

2.1.3 微衛(wèi)星DNA 技術(shù)

SSR(Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)是指由1-6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)而形成的核苷酸序列，也被稱為“微衛(wèi)星”，Spritz(1981)首先在珠蛋白中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端的互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR 反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，將擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酞胺凝膠電泳，依據(jù)微衛(wèi)星序列拷貝數(shù)的差異決定基因型，并計(jì)算等位基因發(fā)生的頻率(閆華超，2006)。NCBI 登陸的數(shù)據(jù)中，以雙翅目、鱗翅目和膜翅目昆蟲的微衛(wèi)星數(shù)量最多，占75%，而半翅目昆蟲的研究相對(duì)偏少。

謝映平等采用3 條微衛(wèi)星引物對(duì)日本龜蠟蚧Ceroplastes japonicus、角蠟蚧C.ceriferus、白蠟綿粉蚧Phenacoccus fraxinus、瘤堅(jiān)大球蚧和朝鮮球蚧Didesmococcus koreanus 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示種內(nèi)遺傳分化程度從大到小為日本龜蠟蚧＞朝鮮毛球蚧＞角蠟蚧＞瘤堅(jiān)大球蚧＞白蠟綿粉蚧;種間的遺傳分化程度明顯低于種內(nèi)(石晶，2005;謝映平等，2007)，確定了一種大規(guī)模提取蚧蟲基因組DNA 的方法，印證了朝鮮毛球蚧和瘤大球堅(jiān)蚧的遺傳關(guān)系比一直同在蠟蚧亞科的角蠟蚧和日本龜蠟蚧的遺傳關(guān)系還近，是對(duì)堅(jiān)蚧類分類地位提升的支持，也進(jìn)一步將毛球蚧類從軟蚧類分離出來歸入堅(jiān)蚧類，雖然試驗(yàn)不可能完全代表所在屬或科的遺傳多態(tài)性特征，但總體支持了湯氏分類系統(tǒng)和Hodgson 的蚧科分類系統(tǒng)，此外增加蚧蟲分子研究中的單微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量是對(duì)該技術(shù)一個(gè)很有必要的補(bǔ)充。繼上述研究之后，李慧等(2014)利用5'錨定簡(jiǎn)并引物對(duì)扶桑綿粉蚧、桃小食心蟲Carposina sasakii、稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus等10種重要農(nóng)業(yè)害蟲進(jìn)行微衛(wèi)星DNA 篩選，發(fā)現(xiàn)扶桑綿粉蚧冗余率(重復(fù)序列的數(shù)量/總序列的數(shù)量)最高為71.7%，扶桑綿粉蚧微衛(wèi)星類型為完全型，驗(yàn)證了SSR 技術(shù)在扶桑綿粉蚧微衛(wèi)星引物篩選的有效性，為進(jìn)一步挖掘其微衛(wèi)星位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。羅梅等(2014)利用高通量搜索的方法對(duì)扶桑綿粉蚧轉(zhuǎn)錄組中28120 條unigenes 的數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，共找到1781個(gè)SSR 位點(diǎn)，發(fā)生頻率(含有SSR 的unigene 數(shù)量與總unigene 數(shù)量之比)為5.79%，SSR 的分布頻率(SSR個(gè)數(shù)與總unigene數(shù)量比)為6.33%，SSRs 的主要重復(fù)類型是單核苷酸重復(fù)，SSR 重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在5-19次之間，單核苷酸重復(fù)基序的擴(kuò)增多態(tài)性比三核苷酸重復(fù)基序的豐富，該結(jié)論驗(yàn)證了SSR 技術(shù)在低級(jí)單元中的多態(tài)性普遍比高級(jí)單元的高，為扶桑綿粉蚧遺傳多樣性分析、進(jìn)化分析及入侵生物學(xué)等提供了理論依據(jù)。

2.1.4 簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增技術(shù)

ISSR(Inter Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增)技術(shù)是在SSR 的5'或3'端加錨1-4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基組成16-18個(gè)堿基序列，然后以此為引物，對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR 的一段基因組DNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增(黃可輝，2005)。馬力等(2007)利用ISSR-PCR 方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)棗大球蚧、朝鮮毛球蚧Didesmococcus koreanus、日本龜蠟蚧 Ceroplasts japonicus 和白蠟綿粉蚧Phenacoccus fraxinus 的快速鑒定，同年又篩選出了多態(tài)性豐富的13個(gè)ISSR 引物，提供了一個(gè)適合蚧蟲的ISSR-PCR 最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的標(biāo)準(zhǔn)化程序，增強(qiáng)了ISSR 標(biāo)記技術(shù)在蚧蟲種間遺傳多樣性分析的穩(wěn)定性;Chen(2013)等運(yùn)用ISSR 和RAPD 相結(jié)合的技術(shù)對(duì)20種紫膠蟲的COI、28S 和EF-1α 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)印度次大陸是轉(zhuǎn)移到歐亞大陸的紫膠蟲的分布中心，大陸漂移理論和現(xiàn)有的化石記錄表明紫膠蟲是從印度次大陸漂向歐亞大陸的，隨著溫度的升高，紫膠蟲可能進(jìn)入熱帶地區(qū)。此研究是在明確7種紫膠蟲的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化關(guān)系后開展的一項(xiàng)工作(陳航，2007)，雖然當(dāng)時(shí)取得了一些建設(shè)性的成果，但云南紫膠蟲、中華紫膠蟲、田紫膠蟲、尼泊爾紫膠蟲與普薩紫膠蟲5 者之間的核基因分析結(jié)果并不一致，還無法對(duì)其撲朔迷離的關(guān)系形成定論，本研究增添的ISSR 技術(shù)更加深入地比較和分析了紫膠蟲的遺傳規(guī)律和進(jìn)化機(jī)制。朱新帥等(2014)用ISSR 引物對(duì)來自新疆哈密、巴州、阿克蘇、喀什、和田5個(gè)地區(qū)共計(jì)15個(gè)棗球蠟蚧地理種群進(jìn)行多態(tài)分析，篩選出46 條ISSR 引物，并證明種群間的遺傳背景存在明顯分化，種群的遺傳多樣性與年均溫度、年均濕度呈正相關(guān)，與寄主樹齡和緯度無相關(guān)性，而與海拔呈負(fù)相關(guān);為棗球蠟蚧遺傳變異、發(fā)生與環(huán)境的關(guān)系提供了理論支撐，ISSR 技術(shù)對(duì)評(píng)估和區(qū)分種群間的變異取得較好的成果，我國(guó)運(yùn)用ISSR 技術(shù)對(duì)蚧蟲的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的研究?jī)H山西大學(xué)實(shí)驗(yàn)室稍顯成熟，但也僅僅局限于紫膠蟲，有關(guān)蚧蟲其他種類都還比較籠統(tǒng)，甚至還未涉及，需要進(jìn)一步的探討。

2.1.5 DNA 條形碼技術(shù)

DNA 條形碼(DNA Barcoding)也稱DNA 條形編碼，類似于超級(jí)市場(chǎng)商品包裝上用于識(shí)別商品的粗細(xì)、間隔不同的黑白條紋圖案，是利用COI的前部長(zhǎng)約650 bp 序列作為標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化地對(duì)物種進(jìn)行鑒定和分類，DNA 條形碼最初由加拿大圭爾夫大學(xué)(University of Guelph)的動(dòng)物學(xué)家Hebert 等(2003)提出。其技術(shù)流程包括樣品獲取、DNA 提取、PCR 擴(kuò)增、序列測(cè)定、序列比對(duì)及根據(jù)序列差異進(jìn)行判別。該技術(shù)在鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和雙翅目等昆蟲中均有研究(Monaghan et al.，2005;Nelson et al.，2007;Fisher and Smith，2008)。

蚧蟲的DNA 條形碼研究多是將COI 基因與核基因聯(lián)合分析，例如，可將18S rDNA、16S rDNA、EF-1α 和COI 聯(lián)合作為蚧蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究中的標(biāo)準(zhǔn)序列，以增加同源序列之間的可比性(Caterino et al.，2000;Zhang et al.，2000;Hajibabaei，2006)。Gullan 等(2003)通過擴(kuò)增COI、28S、EF-1α 基因序列及其比對(duì)分析，并結(jié)合外部形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)了粉蚧1 新種Ferrisia gilli，并證明雙條弗粉蚧為物種復(fù)合體;隨后，又對(duì)粉蚧科腺刺粉蚧屬Ferrisia Fullaway 的6種粉蚧進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些粉蚧平均遺傳距離均大于4%，并建議將雙條弗粉蚧細(xì)分為6個(gè)不同的支系(Gullanet et al.，2010)，因此結(jié)合形態(tài)特征上的差異可將其分為幾個(gè)不同的亞種，這無疑是對(duì)粉蚧科昆蟲分類區(qū)系的再次完善;對(duì)大洋臀紋粉蚧、柑橘臀紋粉蚧、無花果臀紋粉蚧Planococcus ficus等3種近緣種粉蚧的mtDNA COI 序列以及18S 和28S 基因序列的研究結(jié)果同樣說明蚧蟲COI 基因序列變異程度較其他基因高(何衍彪等，2007)，此結(jié)論是蚧蟲DNA 條碼研究開展的先決條件。

隨著蚧蟲的mtDNA COI 受到越來越多的重視，Park 等(2011)通過重新設(shè)計(jì)COI 基因序列的正向引物，對(duì)盾蚧科和粉蚧科進(jìn)行了物種鑒定的有效性研究，揭示了介殼蟲DNA 條形碼序列核苷酸組成的特性(Deng et al.，2012);Saccaggi 等(2008)通過mtDNA COI 基因序列特征分析成功將葡萄綿粉蚧Planococcus ficus、柑橘臀紋粉蚧和長(zhǎng)尾粉蚧Pseudococcus longispinus 區(qū)別開來;同時(shí)，利用引物PcoF1/LepR1 擴(kuò)增mtDNA COI 基因，實(shí)現(xiàn)了對(duì)新菠蘿灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes、大洋臀紋粉蚧和南洋臀紋粉蚧Planococcus lilacius 等蚧蟲的快速檢測(cè)(徐浪，2010;徐浪等，2013)。由此可知該技術(shù)在蚧蟲的鑒定可行性方面已經(jīng)毋庸置疑，除此之外，也證明了DNA 條形碼在同屬蚧蟲鑒定中的優(yōu)勢(shì)。

為進(jìn)一步開展蚧蟲DNA 條形碼系統(tǒng)研究，何衍彪等隨后又初步明確了熱區(qū)的菠蘿潔粉蚧、新菠蘿灰粉蚧在我國(guó)的分布，海南萬寧種群可能是菠蘿潔粉蚧的1個(gè)隱存譜系的結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)mtDNA COI 基因序列有33個(gè)變異位點(diǎn)(何衍彪等，2011;何衍彪，2012)，這與Rung 等(2008)對(duì)大洋臀紋粉蚧和柑橘臀紋粉蚧的鑒定結(jié)果一致;此外Ball 和Armstrong(2008)利用該技術(shù)證實(shí)了珠蚧科Margarodidae 不同地理種群介殼蟲復(fù)合種的存在;褚棟等(2009)對(duì)來自海南三亞和陵水地區(qū)的扶桑綿粉蚧mtDNA COI 測(cè)序，并與美國(guó)佛羅里達(dá)州的扶桑綿粉蚧序列進(jìn)行比較，推測(cè)扶桑綿粉蚧可能是至少含有2個(gè)隱存譜系或姊妹種的復(fù)合種，新入侵我國(guó)海南三亞和陵水地區(qū)的扶桑綿粉階是該復(fù)合種內(nèi)的1個(gè)隱存譜系或物種，且可能不是來自美國(guó)佛羅里達(dá)州;陳哲等(2012)對(duì)中國(guó)、巴基斯坦、美國(guó)的扶桑綿粉蚧mtDNA COI基因序列的堿基差異比較和遺傳距離分析進(jìn)一步驗(yàn)證了褚棟等的結(jié)論，而對(duì)于扶桑綿粉蚧另外一遺傳支系是否也入侵中國(guó)有待于擴(kuò)大樣本采集點(diǎn)和樣本數(shù)來進(jìn)一步深入驗(yàn)證。以上結(jié)果說明DNA條形碼可作為粉蚧近緣種鑒別的依據(jù)，同時(shí)可有效地發(fā)現(xiàn)和揭示蚧蟲中的隱存分類單元和復(fù)合種。

繼DNA 條形碼概念提出之后，一個(gè)專門獲取、儲(chǔ)存、分析和發(fā)表DNA 條形碼記錄的數(shù)據(jù)庫—生物DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(DNA Barcode of Life Data，BOLD，http://www.boldsystems.org)成立，并于2007年獲得官方認(rèn)可。田虎(2013)以來自全國(guó)7個(gè)省12個(gè)不同采集區(qū)域的21種介殼蟲為靶標(biāo)構(gòu)建了介殼蟲類昆蟲DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，目前該系統(tǒng)可對(duì)40種介殼蟲類昆蟲進(jìn)行鑒定識(shí)別;截止到2014年12月，BOLD 中與條形碼有關(guān)的序列已達(dá)4201240 條，其中，可作為鑒定物種水平的DNA 條形碼，即每個(gè)物種有三個(gè)以上且序列長(zhǎng)度不低于500 bp 的序列為3654244 條序列(http://www.barcodinglife.org/)。其中，同翅目蚧總科下含有來自11個(gè)國(guó)家的449 條48種蚧蟲的DNA 條碼序列，見表1。其中，439 條有物種名稱，分別代表295個(gè)種類。

表1 蚧總科含DNA 條碼昆蟲種類Table 1 Insect species of Coccoidea with DNA barcoding

(續(xù)上表)

2.2 各種分子生物學(xué)技術(shù)的比較

針對(duì)不同的靶標(biāo)基因匹配有不同的分子生物學(xué)技術(shù)，而且各有其利弊。針對(duì)蚧蟲低級(jí)階元，即種內(nèi)或者近緣種之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析，以上幾種分子生物學(xué)技術(shù)均可獲得預(yù)期效果。

RFLP 技術(shù)中的限制性內(nèi)切酶可以將DNA 片段消化成很小的DNA 片段，但這只是對(duì)較小的基因組，在切割大分子基因時(shí)，各種片段在凝膠上相互重疊，很難區(qū)分。目前通常將RFLP-PCR 技術(shù)與雜交技術(shù)結(jié)合，但這樣造成RFLP 技術(shù)操作復(fù)雜繁瑣和放射性危害，而且RFLP 技術(shù)用于相距較遠(yuǎn)種(岐化值大于10%-15%)時(shí)，因?yàn)檩^遠(yuǎn)種間的酶切片段同源性差，則不能清晰地推演種間進(jìn)化關(guān)系。

RAPD 技術(shù)在一定程度上彌補(bǔ)了RFLP 技術(shù)的缺陷，其操作簡(jiǎn)便易行的特點(diǎn)受到諸多學(xué)者的偏愛，而且所用的引物沒有嚴(yán)格的種屬界限，能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量樣品分析(黃可輝，2005)。不足之處在于，RAPD 技術(shù)重復(fù)性差，對(duì)于不同試驗(yàn)對(duì)象基因組來說，究竟進(jìn)行多少引物的RAPD 篩選才能獲得足夠的基因仍然沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

相對(duì)于RFLP 和RAPD 技術(shù)，SSR 技術(shù)凝膠電泳時(shí)具有單堿基的高分辨率，SSR 序列廣泛存在于真核生物基因組的非編碼區(qū)和編碼區(qū)，遺傳信息量大，一個(gè)SSR 座位可以檢測(cè)26個(gè)等位基因(孫荊濤等，2012)，微衛(wèi)星分子標(biāo)記在昆蟲遷飛習(xí)性的研究中作用顯著，但是微衛(wèi)星具有較復(fù)雜變異模型，很難將種群間的遺傳距離轉(zhuǎn)化為種群分化的時(shí)間尺度，而且必須依賴每類微衛(wèi)星兩段序列設(shè)計(jì)引物，而不像RAPD 引物是隨機(jī)合成的，需前期研究基礎(chǔ)，而且該技術(shù)對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程的準(zhǔn)確度和精確度要求非常高，稍許差錯(cuò)就會(huì)對(duì)最終結(jié)果造成很大影響(Ellegren，2004)。

隨后ISSR-PCR 技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)是在SSR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，保證了可重復(fù)性，常常采用1個(gè)SSR 序列和1個(gè)引物對(duì)，從而保證了引物與基因組DNA 中的SSR 的5'或3'末端結(jié)合，通過PCR 反應(yīng)擴(kuò)增SSR 之間的DNA 片段，以增強(qiáng)多態(tài)性(張立榮，2002;黃映萍，2010)，無需預(yù)先克隆和測(cè)序，無需知道DNA 序列即可用引物進(jìn)行擴(kuò)增，也正因如此，一些ISSR 引物可能在特定基因組中沒有配對(duì)區(qū)域而無擴(kuò)增產(chǎn)物。

隨著研究的不斷深入，DNA 條形碼技術(shù)在蚧蟲研究中越來越受到重視，除了具有其他分子標(biāo)記手段所不具備的功能外，DNA 條碼技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)還包括:引物通用性，積累廣泛的生物分類信息及分析進(jìn)化關(guān)系，其鑒定所需樣品量少，只需一小塊或一小片材料即可鑒定一個(gè)物種;同時(shí)可鑒定出許多群體中普遍存在的隱存分類單元(Nelson et al.，2007)，這對(duì)部分形態(tài)特征不穩(wěn)定的蚧蟲的鑒定具有很好的參考價(jià)值;另外DNA 條形碼具有數(shù)字化的數(shù)據(jù)庫，因而提供了信息化的分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和有效的生物分類學(xué)手段，成為學(xué)科進(jìn)展最迅速的前沿之一。

3 存在的問題及發(fā)展前景

3.1 存在的問題

3.1.1 與傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)的兼容問題

分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)于大多數(shù)動(dòng)物類群都具有良好的鑒別力，其快速、準(zhǔn)確、便捷的鑒定能力，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足，突破了以往對(duì)經(jīng)驗(yàn)的過分依賴的局限，為物種識(shí)別鑒定提供了新的研究方法和手段。然而，某些蚧蟲的模式標(biāo)本已經(jīng)遺失，有的也因年代過于久遠(yuǎn)而無法取樣，并且這些標(biāo)本通常具有重要的分類學(xué)價(jià)值，分子學(xué)方法對(duì)于標(biāo)本具有破壞性，因此從珍貴的模式標(biāo)本上獲取目的基因是不合適的。雖可以采用一般標(biāo)本的方式作為折衷，但這種處理方式可能導(dǎo)致分子系統(tǒng)與林奈分類系統(tǒng)在對(duì)應(yīng)上出現(xiàn)偏差。利用分子系統(tǒng)學(xué)對(duì)蚧蟲進(jìn)行鑒定，選用rDNA還是mtDNA 的技術(shù)分析的可靠性，必須借由傳統(tǒng)分類學(xué)的驗(yàn)證，完全脫離形態(tài)學(xué)的DNA 分類是沒有意義的，需要形態(tài)學(xué)與標(biāo)準(zhǔn)基因的聯(lián)合分析。

3.1.2 假基因的干擾問題

運(yùn)用不同DNA 提取方法所獲得的基因組細(xì)胞內(nèi)含有大量的DNA 序列，包括自身序列和非自身序列，核基因組里存在線粒體基因的同源序列，如果這些序列被誤用作目的基因，便會(huì)造成電泳雜帶、測(cè)序雙峰以及背景噪音模糊等，進(jìn)而影響DNA 條形碼的種群分類鑒定。假基因(pseudogene)在基因表達(dá)、基因調(diào)控以及產(chǎn)生基因多樣性等方面可能都扮演著極為重要的角色，科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)假基因并不是“垃圾基因”，但其確切的作用機(jī)制仍不清楚(Moulton et al.，2004)。假基因可分為以下兩種:一類是重復(fù)假基因，這類假基因是由于基因組DNA 重復(fù)，或染色體不均等交換過程中，基因編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)發(fā)生突變?nèi)鐗A基置換、插入或缺失，導(dǎo)致復(fù)制后的基因喪失正常功能而形成的，第二類是加工假基因或返座假基因(processed pseudos)，這類假基因是由mRNA 轉(zhuǎn)錄本反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后重新整合到基因組，由于插入位點(diǎn)不合適或序列發(fā)生突變而失去正常功能形成的，由于假基因不被表達(dá)，所以細(xì)胞中不存在相應(yīng)的RNA，可通過RT-PCR 的方法予以解決(Frohman et al.，1988;Collura et al.，1996;王關(guān)林和方宏筠，1998;Lorenz et al.，2005)。諸多研究顯示提取的DNA 樣品中存在PCR 抑制物，影響擴(kuò)增效率，可加入少量牛血清蛋白或Q-solution 等洗滌樣品，或者稀釋DNA 等降低抑制，進(jìn)行二次PCR 和設(shè)計(jì)特異性引物等也是解決此問題的有效途徑(Moulton et al，2004;Juen and Traugott，2006;李凱等，2010)。

3.2 發(fā)展前景

早期傳統(tǒng)的形態(tài)分類法為蚧蟲的分類鑒定奠定了基礎(chǔ)，但目前僅僅依靠形態(tài)學(xué)資料還不能完全解決蚧蟲的系統(tǒng)分類問題。80年代以來分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，并滲入系統(tǒng)與進(jìn)化研究中而形成了一門新興交叉學(xué)科-昆蟲分子生物學(xué)，為昆蟲系統(tǒng)學(xué)的研究和發(fā)展增添了新的活力。分子生物學(xué)技術(shù)主要針對(duì)于形態(tài)特征極其相似的近緣種、復(fù)合種及種以下的亞種、生物型、地理種群的識(shí)別和鑒定，能解決傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法難以解決的問題。如何從豐富的蚧蟲DNA 信息中篩選出準(zhǔn)確有效地鑒別物種的片段是很關(guān)鍵的。鑒于DNA條形碼相對(duì)于其他分子生物學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，在鱗翅目、鞘翅目等昆蟲中已有很成熟的DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫建立，蚧蟲的COI 基因長(zhǎng)度約為1500 bp，究竟哪一段可以作為蚧蟲的基因條形碼尚無定論。

部分蚧蟲屬種間差異率很小，不同物種需要使用不同的基因序列以完成其DNA 條形碼的構(gòu)建，單一的COI 序列不能夠完全做到區(qū)分的目的，增加分析基因的數(shù)量是確保準(zhǔn)確分類的有效途徑，因此需要聯(lián)合一些其他基因比如核內(nèi)基因來增加標(biāo)記數(shù)(Moritz and Cicero，2004)。對(duì)于不同地理來源的昆蟲，DNA 條形碼在建立鑒定技術(shù)和物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系時(shí)并不能準(zhǔn)確區(qū)分地區(qū)，即其具有區(qū)域性研究的限制;另有學(xué)者指出DNA 條形碼對(duì)于新分化的種群也存在欠缺之處，只能作為分類學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)新物種的線索;對(duì)于長(zhǎng)度變異較大的條形碼序列(如非編碼基因PsbA-trnH)，在比對(duì)方法的確定以及對(duì)插入和缺失的處理方面仍存在較大爭(zhēng)議，分類非常困難，雖然有一些解決途徑被提出，但仍需改進(jìn)。

總體來說，相對(duì)國(guó)外逐漸發(fā)展的分子體系，國(guó)內(nèi)蚧蟲DNA 條形碼研究尚處于起步階段，有關(guān)蚧蟲類昆蟲的分子分類研究體系較弱，作為一種標(biāo)準(zhǔn)的物種鑒定方法，DNA 條形碼技術(shù)有著巨大的科學(xué)應(yīng)用潛力，尤其在蚧蟲分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究等領(lǐng)域應(yīng)用前景更為顯著，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建蚧蟲完整的DNA 條形碼序列數(shù)據(jù)庫將是很好的發(fā)展方向。

References)

Annstrong K，Cameron C，F(xiàn)rampton E.Fruitfly(Diptera:TepMtidae)species identification:A rapid molecular diagnostic technique for quarantine application［J］.Bulltin of Entomological Reaearch，1997，87:111-118.

Aljanabi SM，Martine Z.Universal and rapid salt extraction of high quality genomic DNA f or PCR based techniques［J］.Nucleic.Acids.Res.，1997，25(22):4692-4693.

Ashfaq M，Noor AR，Mansoor S.DNA-based characterization of an invasive mealybug(Hemiptera:Pseudococcidae)species damaging cotton in Pakistan［J］.Applied Entomology and Zoology，2010，45(3):395-404.

Ball SL，Armstrong KF.Rapid，one-step DNA extraction for insect pest identification by using DNA barcodes［J］.Journal of Economic Entomology，2008，101(2):523-532.

Black IVWC，Duteart NM，Puterka GJ.Use of random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction(RAPD-PCR)to detect DNA polymorphisms in a aphids［J］.Bull.Entomol.Res.，1992，82:151-159.

Ben-Dov Y，Miller DR，Gibson GAP.Scale Net:A database of the scale insects of the world.United States Department of Agriculture(USDA)，2002，Available online:http://www.sel.barc.usda.gov/scalenet/scalenet.htm.

Ben-Dov Y，Matile-Ferrero D，Gafny R.Taxonomy of Ceroplastes rubens Maskell with description of a related new species(Hemiptera:Coccoidea:Coccidae)from Reunion，including DNA polymorphism analysis［J］Annales de la Societe Entomologique de France，2000，36(4):423-433.

Beuning L，Murphy P，Wu E.Molecular-based approach to the differentiation of mealybug(Hemiptera:Pseudococcidae)species［J］.Economic Entomology，1999，92(02):463-472.

Burban C，Petit RJ，Carcreff E，et al.Rangewide variation of the maritime pine bast scale Matsucoccus feytaudi Duc.(Homoptera:Matsucoccidae)in relation to the genetic structure of its host［J］.Molecular Ecology，1999，10(8):1593-1602.

Chen H.Phylogenetic Relationships And Molecular Evolution of 7 Species In Lac Insects(Tachardiidae:Kerria)［D］.Beijing:Chinese Academy of Forestry Offcial，2007.［陳航.7種紫膠蟲的系統(tǒng)發(fā)育與分子進(jìn)化分析(Tachardiidae:Kerria)［D］.北京:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2007］

Collura RV，Auerbach MR，Stewart CB.A quick，direct method that can differentiate expressed mitochondrial genes from their nuclear pseudogenes［J］.Current Biology，1996，6(10):1337-1339.

Chen H，Chen X，F(xiàn)eng Y，et al.Molecular phylogeny and biogeography of lac insects(Hemiptera:Kerriidae)inferred from nuclear and mitochondrial gene sequences［J］.Molecular Biology Reports，2013，40(10):5943-5952.

Caterino MS，Cho S，Sperling FAH.The current state of insect molecular systematics:a thriving tower of babed［J］.Annu.Rev.Entomol.，2000，45(1):1-54.

Cook LG，Gullan PJ，Trueman HE.A preliminary phylogeny of the scale insects(Hemiptera:Stemorrhyncha:Coccoidea)based on nuclear small subunit ribosomal DNA［J］.Molecular Phylogenetics and Evolution，2002，25(1):43-52.

Chu D，Liu GX，F(xiàn)u HB，et al.Phylogenetic analtsis of mt COI reveals the cryptic lineages in Phenacoccus solenopsis complex(Hemiptera:Pseudococcidae)［J］.Acta Entomologica，2009，52(11):1261-1265.

Chiu YC，Wu WJ，Wong CY，et al.Application of the PCR-RFLP technique for the rapid diagnosis of scale insects(Homoptera:Coccoidea)on imported agricultural products in Taiwan［J］.Formosan Entomol.，2004，24(4):365-375.

Chen Z，Zhang J，F(xiàn)u HF，et al.On the validity of the species Phenacoccus solenopsis based on morphological and mitochondrial COI data，with the description of a new body color variety［J］.Biodiversity Science，2012，20(4):443-450.［陳哲，張姜，傅杭飛，等.基于形態(tài)特征和線粒體COI 基因探討扶桑綿粉蚧物種的有效性并記述一體色變異型扶桑綿粉蚧［J］.生物多樣性，2012，20(4):443-450］

Dayrat B.Towards integrative taxonomy［J］.Biological Journal of the Linnean Society，2005，85(3):407-415.

Downie DA，Gullan PJ.Phylogenetic analysis of mealybugs(Hemiptera:Coccoidea:Pseudococcidae)based on DNA sequences from three nuclear genes，and a review of the higher classification［J］.Systematic Entomology，2004，29(2):238-260.

Deng J，Yu F，Zhang TX，et al.DNA barcoding of six Ceroplastes species(Hemiptera:Coccoidea:Coccidae)from China［J］.Molecular Ecology Resources，2002，12(5):791-796.

Frohman MA，Dush MK，Martin GR.Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts:Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85:8998-9002.

Frézal L，Leblois R.Four years of DNA barcoding:Current advances and prospects［J］.Infect Genet.Evol.，2008，8:727-736.

Fisher BL，Smith MA.A revision of Malagasy species of Anochetus mayr and Odontomachus latreille(Hymenoptera:Formicidae)［J］.PLoS ONE，2008，3:e1787.

Gullan PJ，Downie DA，Steffan SA.A new pest species of the mealybug genus Ferrisia Fullaway(Hemiptera:Pseudococcidae)from the United States［J］.Annals of the Entomological Society of America，2003，96(6):723-737.

Gullan PJ，Kaydan MB，Hardy NB.Molecular phylogeny and species recognition in the mealybug genus Ferrisia Fullaway(Hemiptera:Pseudococcidae)［J］.Systematic Entomology，2010，35(2):329-339.

Gao BJ，Li M，Wang CH，et al.RAPD analysis of genetic divergence among populations in Eulecanium kuwanai Kanda and Eulecanium gigantean Shinji［J］.Acta Ecologica Sinica，2007，27(3):918-923.［高寶嘉，李夢(mèng)，王春和，等.皺大球蚧(Eulecanium kuwanai)和瘤堅(jiān)大球蚧(Eulecanium gigantean)地理種群的RAPD 遺傳分化［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27(3):918-923］

He YB.Molecular Identification，Genetic Structure and Control Strategy of Pink Pineapple Mealybug，Dysmicoccus Brevipes(Cockerell)［D］.Chongqing:Southwest University，2012.［何衍彪.菠蘿潔粉蚧的分子鑒定、遺傳結(jié)構(gòu)及其控制基礎(chǔ)研究［D］.重慶:西南大學(xué)，2012］

Huang YP.Advance on DNA molecular maker technigue［J］.Journal of the Graduates Sun Yat-sen University(Natural Sciences.Medicine)，2010，31(2):27-36.［黃映萍.DNA 分子標(biāo)記研究進(jìn)展［J］.中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)·醫(yī)學(xué)版)，2010，31(2):27-36］

Huang HK，Guo QX，Yu B.The appliton of molecularmarker methods in entomology studies［J］.Entomological Journal of East China，2005，14(2):109-114.［黃可輝，郭瓊霞，虞赟，等.分子標(biāo)記法在昆蟲學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.華東昆蟲學(xué)報(bào)，2005，14(2):109-114］

Hosseini R，Hajizadeh J.Molecular identification of three of the most important mealybug species(Hemiptera:Sternorrhyncha:Coccoidea:Pseudococcidae)on ornamental plants in Guilan province，Iran［J］.Zootaxa，2011，3009:46-54.

Hajibabaei M，Janzen DH，Burns JM，et al.DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2006，103:968-971.

He YB，Wan XW，Zhan RL，et al.Genetic relationship of 12 species of mealybugs(Hemiptera:Pseudococcidae)based on DNA sequences［J］.Chinese Journal of Tropical Crops，2011，32(12):2324-2330.［何衍彪，萬宣伍，詹儒林，等.基于DNA 序列的12種粉蚧親緣關(guān)系分析［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32(12):2324-2330］

He Yb，Zhan RL，Zhao YL.Research progress on Dysmicoccus brevipes(Cockerell)and mealybug wilt of pineapple［J］.Guangdong Agricultural Sciences，2007，2:44-49.［何衍彪，詹儒林，趙艷龍.菠蘿粉蚧及菠蘿凋萎病研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，2:44-49］

Juen A，Traugott M.Amplification facilitators and multiplex PCR:Tools to overcome PCR-inhibition in DNA-gut content analysis of soil living invertebrates［J］.Soil Biology and Biochemistry，2006，38(7):1872-1879.

Kondo T，Gullan PJ，Williams DJ.Coccidology:The study of scale insects(Hemiptera:Sternorrhyncha:Coccoidea)［J］.Revista Corpoica-Cienciay Tecnología Agropecuaria，2008，9(2):55-61.

Li M.Study on the Population Differentation and Genetic Diversity of the Patial Coccoidea［D］.Hebei:Agricultural University of Hebei Province，2006.［李夢(mèng).部分蚧科昆蟲種群分化及遺傳多樣性的研究［D］.河北:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006］

Liu QC.Studyon The Population Differentiation and Genetic Diversity of Drosicha Corpulenta Populations on Different Hosts and Geography［D］.Hebei:Agricultural University of Hebei Province，2012.［劉全超.草履蚧不同寄主和地理種群分化及遺傳多樣性研究［D］.河北:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012］

Luo M，Dong ZY，Bin SY，et al.Molecular cloning，prokaryotic expression and expression at different developmental stages of cathepsin B gene in mealybug Phenacoccus solenopsis Tinsley(Hemiptera:Pseudococcidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2012，55(3):276-283.［羅梅，董章勇，賓淑英，等.扶桑綿粉蚧組織蛋白酶B 基因的克隆、原核表達(dá)和不同發(fā)育階段表達(dá)分析［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2012，55(3):276-283］

Luo M，Dong ZY，Bin SY，et al.Molecular cloning and bioinformatics analysis of calmodulin genes in Phenacoccus solenopsis Tinsley［J］.Journal of Huazhong Agricultural University，2012，31(3):320-324.［羅梅，董章勇，賓淑英，等.扶桑綿粉蚧鈣調(diào)蛋白基因的克隆與生物信息學(xué)分析［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31(3):320-324］

Lorenz JG，Jackson WE，Beck JC，et al.The problems and promise of DNA barcodes for species diagnosis of primate biomaterials［J］.Philosophical Transactions of the Royal Society of London.Series B，Biological Sciences，2005，360(1462):1869-1878.

Li H，Lang KL，Shen CP，et al.Isolation and characterization of microsatellite DNA loci from ten important agricultural pest using anchored PCR method［J］.Journal of Biosafety，2014，23(1):60-65.［李慧，郎坤玲，沈長(zhǎng)朋，等.基于錨定PCR 技術(shù)對(duì)10種重要農(nóng)業(yè)害蟲微衛(wèi)星DNA 位點(diǎn)的篩選及其特征分析［J］.生物安全學(xué)報(bào)，2014，23(1):60-65］

Li XM，Wang XF，Cui ZJ.Applications and optimizations of T-RFLP in fingerprinting environmental microbial populations［J］.Joural of China Agricultural University，2009，14(4):1-9.［李獻(xiàn)梅，王小芬，崔宗均.末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(T-RFLP)在微生物群體分析上的應(yīng)用與技術(shù)優(yōu)化［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，14(4):1-9］

Liu CL，You LS，Luo QH，et al.Random amplified polymorphic DNA of the similar broconid wasps cotton field andpaddy field from China［J］.Acta Zootaxonomica Sinica，2003，28(4):568-572.［劉春林，游蘭韶，羅慶懷，等.中國(guó)棉田和稻田繭蜂近緣種的RAPD 分子標(biāo)記研究［J］.動(dòng)物分類學(xué)報(bào)，2003，28(4):568-572］

Liu MH，Yang RP，Zeng CH，et al.Application and prospect of biological control to diseases and insect pests with modern biotechnology［J］.Jiangxi Plant Protection，2009，32(1):14-18.［劉明輝，楊榮萍，曾春輝，等.現(xiàn)代生物技術(shù)在病蟲害生物防治中的應(yīng)用途徑和前景［J］.江西植保，2009，32(1):14-18］

Luo M，Zhang H，Bin SY，et al.High-throughput discovery of SSR makers in the mealybug，Phenacoccus solephsis(Hemiptera:Pseudococcidae)，from its transcriptome database［J］.Acta Entomologica Sinica，2014，57(4):395-400.［羅梅，張鶴，賓淑英，等.基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)高通量發(fā)掘扶桑綿粉蚧微衛(wèi)星引物［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2014，57(4):395-400］

Li K，Zhao LY，Tian JC，et al.Research progress in DNA-based approach tracking trophic links［J］.Acta Phytophylacica Sinica，2010，37(1):83-88.［李凱，趙麗亞，田俊策，等.食物鏈網(wǎng)絡(luò)DNA 跟蹤技術(shù)研究進(jìn)展［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010，37(1):83-88］

Monaghan MT，Balke M，Gregory TR，et al.DNA-based species delineation in tropical beetles using mitochondrial and nuclear markers［J］.Philosophical Transactions of the Royal Society of London.Series B，Biological Sciences，2005，360(1462):1925-1933.

Moritz C，Cicero C.DNA barcoding:promise and pitfalls［J］.PLoS Biol.，2004，2(10):1529-1531.

Moulton MJ，Song H，Whiting MF.Assessing the effects of primer specificity on eliminating numt coamplification in DNA barcoding:A case study from Orthoptera(Arthropoda:Insecta)［J］.Mol.Ecol.Resour.2010，10(4):615-27.

Ma L，Xie YP，Xue JL.Rapid identification of scale insect by total DNA extraction and PCR［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2007，35(5):145-147.［馬力，謝映平，薛皎亮.蚧蟲DNA 的提取及PCR 法蟲種快速鑒定技術(shù)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(5):145-147］

Nelson LA，Wallman JF，Dowton M.Using COI barcodes to identify forensically and medically important blowflies［J］.Med.Vet.Entomol.，2007，21:44-52.

Park DS，Leem YJ，Hahn KW，et al.Molecular identification of mealybugs(Hemiptera:Pseudococcidae)found on Korean pears［J］.Journal of Economic Entomology，2010，103(1):25-33.

Park DS，Suh SJ，Hebert PDN，et al.DNA barcodes for two scale insect families，mealybugs(Hemiptera:Pseudococcidae)and armored scales(Hemiptera:Diaspididae)［J］.Bulletin of Entomological Research，2011，101(4):429-434.

Qi XF.The Researchof Coccoidea Faunas in Beijing［D］.Beijing:Beijing Forestry University，2008.［齊曉豐.北京地區(qū)蚧蟲區(qū)系的研究［D］.北京:北京林業(yè)大學(xué)，2008］

Rung A，Miller DR，Scheffer SJ.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to distinguish three mealybug groups within the Planococcus citri-P.minor species complex(Hemiptera:Coccoidea:Pseudococcidae)［J］.Journal of Economic Entomology，2009，102(1):8-12.

Rung A，Scbeffer SJ，Evans G，et al.Molecular identification of two closelv related species of mealybugs of the genus Planococcus(Homoptera:Pseudococcidae)［J］.Annals of the Entomological Society of America，2008，101(3):525-532.

Robertson HM，Warr CG，Carlson JR.Molecular evolution of the insect chemoreceptor gene superfamily in Drosophila melanogaster［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100(2):14537-14542.

Shi J.Genomic DNA Isolationof Scale Insect and Microsatellite Primers Polymorphism PCR［D］.Shanxi:Shanxi University，2005.［石晶.蚧蟲基因組DNA 提取及微衛(wèi)星引物多態(tài)性擴(kuò)增研究［D］.山西:山西大學(xué)，2005］

Saccaggi DL，Krüger K，Pietersen G.A multiplex PCR assay for the simultaneous identification of three mealybug species(Hemiptera:Pseudococcidae)［J］.Bulletin of Entomological Research，2008，98(1):27-33.

Tang FD.Discusstion on Matsucoccus matsumurae(KUW.)with descrition of a new species［J］.Acta Entomologica Sinica，1978，21，164-169.［湯枋德.關(guān)于松干蚧的討論及一新種描記-兼與《中國(guó)的松干蚧》文商榷［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，1978，21:164-169］

Tian H.DNA Barcoding for Species Identification of Scale Insects［D］.Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences，2013.［田虎.介殼蟲類昆蟲DNA 條形碼識(shí)別技術(shù)研究［D］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013］

Tang KX，Kai GY，Zhang L，et al.Advances in RACE and its application in plant gene cloning［J］.Journal of Fudan University(Natural Science)，2012，41(6):704-709.［唐克軒，開國(guó)銀，張磊，等.RACE 的研究及其在植物基因克隆上的應(yīng)用［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，41(6):704-709］

Utsugi JB，Toshihide KT，Motomi ITO.Current progress in DNA barcoding and future implications for entomology［J］.Entomological Science，2011，14(2):107-124.

Wu SA.Checklist and faunistic analysis of scale insect pests(Hemiptera:Coccoidea)in Chinesemainland［J］.Journal of Beijing Forestry University，2009，31(4):55-63.［武三安.中國(guó)大陸有害蚧蟲名錄及組成成分分析(半翅目:蚧總科)［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(4):55-63］

Wang GL，F(xiàn)ang HJ.Principleand Technology of Plant Genetic Engineering［M］.Beijing:Science Press，1998，84-108.［王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)［M］.北京:科學(xué)出版社，1998，84-108］

Wei JF，F(xiàn)eng JN，Wang P，et al.Study on the phylogeny of seven genera of Diaspidinae based on EF-1a sequences［J］.Journal of Northwest A ＆ F University(Nat.Sci.Ed.)，2009，37(11):149-156.［魏久鋒，馮紀(jì)年，王 鵬，等.基于核基因EF-lα序列的盾蚧亞科7個(gè)屬的系統(tǒng)發(fā)育［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，37(11):149-156］

Williams JGK，Kubelik AR，Livak KJ，et al.DNA polylnorphisms amplified by arbitrary Primers are useful as genetie markers［J］.Nuel.Aeids.Res.，1990，18(22):6531-6535.

Wang YQ，Wang XG，Xu LX.A new rapid method for extraction of high quality of genomic DNA from animal tissues［J］.Chinese Journal of Zoology，2001，36(1):27-29.［汪永慶，王新國(guó)，徐來祥.一種動(dòng)物基因組DNA 提取方法的改進(jìn)［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2001，36(1):27-29］

Xie YP，Ma L，Xue JL，et al.The genetic relationship of the five species of scale insects by using the microsatellite primers approach［J］.Journal of Shanxi Agricultural University(Natural Science Edition)，2007，27(4):400-404.［謝映平，馬力，薛皎亮，等.應(yīng)用微衛(wèi)星技術(shù)分析五種蚧蟲的親緣關(guān)系［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，27(4):400-404］

Xie YP，Ma L，Xue JL，et al.Advances in molecular systematics of Coccoidea.In:Li DM.Dynamic of Entomological Research，Representative Conference of National Member of the Entomological Society of China and Academic Annual Symposium of 2007［C］.Beijing:China Agricultural Scientech Press，2007，33-36.［謝映平，馬力，薛皎亮，等.蚧蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展.見:李典謨.昆蟲學(xué)研究動(dòng)態(tài)-中國(guó)昆蟲學(xué)會(huì)第八次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨2007年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集［C］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2007，33-36］

Xu L，Yu DJ，Jiao Y，et al.TaqMan real-time qualitative PCR for the inspection and identification of Planococcus minor and P.lilacius(Homoptera:Pseudococcidae)［J］.Plant Quarantine，2010，24(2):24-28.［徐浪，余道堅(jiān)，焦懿，等.大洋臀紋粉蚧和南洋臀紋粉蚧TaqMan 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法［J］.植物檢疫，2010，24(2):24-28］

Xu L，Yu DJ，Jiao Y，et al.Molecular identification of Dysmicoccus neobrevipes and related species through DNA barcoding［J］.Plant Quarantine，2013，27(3):43-45.［徐浪，余道堅(jiān)，焦懿，等.新菠蘿灰粉蚧及其近似種的DNA 條形碼鑒定［J］.植物檢疫，2013，27(3):43-45］

Yan FC，Gao L，Li GL.Progress in molecular maker technigue and its application［J］.Bulletin of Biology，2006.41(2):17-18.［閆華超，高嵐，李桂蘭.分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用［J］.生物學(xué)通報(bào)，2006.41(2):17-18］

Yan HJ，Huang XQ，Cheng ZQ，et al.Advances of the studies on constructionstrategy and analysis of cDNA library［J］.Journal of Yunnan Agricultural University，2006，21(1):1-6.［晏慧君，黃興奇，程在全.cDNA 文庫構(gòu)建策略及其分析研究進(jìn)展［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21(1):1-6］

Yang PL，Hu JL，Ren ZY.Pine bast scales from China［J］.Acta Entomologica Sinica，1976，19，199-204.［楊平瀾，胡金林，仁遵義.中國(guó)的松干蚧［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，1976，19:199-204］

Yang Q，Xie YP，F(xiàn)an XH，et al.Genetic differentiation of Matsucoccus matsumurae from three geographic populations in China［J］.Scientia Silvae Sinicae，2013，49(12):88-96.［楊鈐，謝映平，樊金華，等.日本松干蚧3個(gè)地理種群的遺傳分化［J］.林業(yè)科學(xué)，2013，49(12):88-96］

Zhong T.New advance of rapid amplification of cDNA ends［J］.Foreign Medical Science(Molecular Biology Section)，2002，24(1):7-11.［鐘濤.cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)新進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè))，2002，24(1):7-11］

Zhang QH，Mao Y，Chen ZH.Strategy of intact cDNA cloning genome study［J］.Journal of Chinese Biotechnology，2000，20(4):3-5.

Zhao H，Peng DL，Zhu JL，et al.RDNA-ITS-PCR in the molecular identification of plant-parasitic nematode［J］.Plant Quarantine，2004，18(2):100-105.［趙鴻，彭德良，朱建蘭.rDNA-ITS-PCR 技術(shù)在植物寄生線蟲分子診斷中的應(yīng)用［J］.植物檢疫，2004，18(2):100-105］

Zhu XS，Wang DY，Yu JN.Genetic variation of Eulecanium giganteum(Shinji)geographical populations and its correlation with ecological factors［J］.Chinese Journal of Ecology，2014，33(5):1267-1273.［朱新帥，王登元，于江南.新疆棗球蠟蚧地理種群的遺傳變異與生態(tài)因子的相關(guān)性［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2014，33(5):1267-1273］

Zhang LR，Xu DQ，Liu DQ.SSR marker，ISSR marker and their application to plant genetics and breeding［J］.Journal of Agricultural University of Hebei，2002，25(1):90-93.［張立榮，徐大慶，劉大群.SSR 和ISSR 分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種研究中的應(yīng)用［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25(1):90-93］