孫 濤，孫之潭，胡美英，鐘國(guó)華

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)毒理研究室，廣州 510642)

魚(yú)藤，別名毒魚(yú)藤，簍藤。為蝶形花科Papilionoideae 魚(yú)藤屬Derris 多年生木質(zhì)藤本植物，產(chǎn)于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)。魚(yú)藤屬共有70 多種，我國(guó)有20 多種，產(chǎn)于西南部經(jīng)中部至東南部(婁予強(qiáng)等，2010)。魚(yú)藤屬植物具有抗氧化、抗癌、抗菌、降血糖、鎮(zhèn)痛等功能，在醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用(楊巡紜等，2013)。魚(yú)藤屬植物根部含有一種重要的活性成分——魚(yú)藤酮類(lèi)化合物，其具有較廣的殺蟲(chóng)譜，其毒性對(duì)農(nóng)作物安全，對(duì)哺乳動(dòng)物低毒，是一種比較理想的植物源農(nóng)藥(張庭英等，2005)。目前魚(yú)藤酮主要從魚(yú)藤的根中提取，大量提取會(huì)造成魚(yú)藤植被的破會(huì)，生態(tài)環(huán)境的惡化，而人工種植周期長(zhǎng)，占用大量土地，組織培養(yǎng)的費(fèi)用又較高，很難應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際。因此尋找可替代魚(yú)藤的新型生物資源具有極其重要的意義。

植物內(nèi)生真菌是指在其生活史一定階段或全部階段生活在健康植物組織或器官內(nèi)部，而被侵染的宿主植物并不表現(xiàn)出明顯病癥的一類(lèi)真菌(Stone et al.，2000)。內(nèi)生真菌長(zhǎng)期生活在植株體內(nèi)的特殊環(huán)境中并且與其協(xié)同進(jìn)化，一方面植株為其提供生長(zhǎng)必需的能量和營(yíng)養(yǎng);另一方面內(nèi)生真菌又通過(guò)自身的代謝活動(dòng)或者信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物體產(chǎn)生影響(Zou et al.，2000;石瑛，2010)?，F(xiàn)代內(nèi)共生理論認(rèn)為，植物與內(nèi)生真菌在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，生物化學(xué)途徑的連續(xù)演化會(huì)導(dǎo)致信息物質(zhì)在內(nèi)生真菌與宿主間的相互傳遞(邵愛(ài)娟等，2001)。大量研究表明植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物極為豐富，具有多種生物活性，如殺蟲(chóng)、抑菌、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)等，其中某些產(chǎn)物與宿主的次級(jí)代謝產(chǎn)物相同或相似(楊春平等，2005)。內(nèi)生菌的特殊生境決定了其次級(jí)代謝產(chǎn)物的獨(dú)特性。研究顯示，51%的從植物內(nèi)生真菌分離的生物活性物質(zhì)是以前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的化合物(Strobel，2003)。因此，利用植物內(nèi)生真菌開(kāi)發(fā)新藥源具有極大的可能性。本文是以毛魚(yú)藤Derris elliptica Benth.、白花魚(yú)藤 Derris albo-rubra Hemsl.、蜜花魚(yú)藤Derris thyrsiflora Benth.3種魚(yú)藤屬植物的內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，從中分離篩選代謝產(chǎn)物對(duì)昆蟲(chóng)具有生物活性的內(nèi)生真菌。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本論文中的魚(yú)藤內(nèi)生青霉菌株P(guān)enicillium sp.及其他菌株均為作者從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)毒理研究室殺蟲(chóng)植物標(biāo)本園內(nèi)的毛魚(yú)藤、白花魚(yú)藤和蜜花魚(yú)藤中分離得到。

1.2 供試?yán)ハx(chóng)及飼養(yǎng)

家蠶Bombyx mori L.:由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶絲科學(xué)系提供3 齡家蠶幼蟲(chóng)，在實(shí)驗(yàn)室里(溫度25℃±1℃，相對(duì)濕度70%)，把家蠶放在托盤(pán)中以桑葉飼養(yǎng)，待長(zhǎng)到4 齡供試。

松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus N.:供試松材線蟲(chóng)分離于廣東省東莞市樟木頭鎮(zhèn)病區(qū)松樹(shù)。在25℃±1℃培養(yǎng)箱中以玉米培養(yǎng)盤(pán)多毛孢Pestalotia sp.15 d 后，用改良貝曼漏斗法分離線蟲(chóng)，通過(guò)100 目篩后收集于500 目篩，用無(wú)菌水沖洗兩次，配成約10000 條/mL 線蟲(chóng)液備用。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，馬鈴薯200 g;葡萄糖20 g;瓊脂20 g;水1000 mL;pH 自然。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸2 min，打漿1-2 min，沖洗打漿機(jī)，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000 mL。

液體培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)。

1.4 內(nèi)生真菌的分離、純化和培養(yǎng)

采用內(nèi)生真菌常用的分離方法:采集新鮮供試植物的根和嫩枝，進(jìn)行表面消毒。首先分別以自來(lái)水和無(wú)菌水沖洗3-4 次，然后用75%酒精漂洗(5-15 min)，用無(wú)菌水沖洗3-4 次，再置于次氯酸鈉溶液(有效氯體積分?jǐn)?shù)為10%)漂洗1 min，最后用無(wú)菌水沖洗4 次。在超凈工作臺(tái)上將消毒過(guò)的植物組織切割成0.5 cm2×0.5 cm2小片，移入PDA 平板上，于25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。3-5 d 待植物樣品邊緣長(zhǎng)出菌絲體后，根據(jù)菌絲體的形態(tài)特點(diǎn)(包括菌絲體的顏色、形狀和質(zhì)地等)，采用尖端菌絲體挑取法對(duì)不同菌株進(jìn)行分離純化。采用組織印跡法檢驗(yàn)植物組織的滅菌效果:即將消毒而未切割的植物組織與固體平板接觸3-5 min，培養(yǎng)3-5 d，根據(jù)平板上菌落的有無(wú)判定分離結(jié)果的有效性(Sturz et al.，1997)。

內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)采用采用搖瓶發(fā)酵法。將純化菌株在無(wú)菌條件下接入裝有150 mL PD 培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，將其置于搖床中(25℃-28℃，RH=75%-85%，L∶D=12∶12)培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)數(shù)120 r/min，培養(yǎng)7-9 d。

1.5 內(nèi)生真菌活性物質(zhì)提取

用100 目篩將菌絲體由發(fā)酵液濾出，置于45℃烘箱中鼓風(fēng)烘干，得干菌絲體。菌絲體中加入10 倍體積(V/W)的甲醇冷浸提取，置于避光暗處，冷浸每次持續(xù)48 h 以上，浸提三次，提取液合并，減壓濃縮得粗提物。

1.6 對(duì)家蠶的生物活性測(cè)定

采用點(diǎn)滴法:供試樣品用丙酮稀釋?zhuān)梦⒘奎c(diǎn)滴儀將稀釋液點(diǎn)滴于家蠶試蟲(chóng)的前胸背板，對(duì)照組點(diǎn)滴丙酮。4 齡試蟲(chóng)點(diǎn)滴5μL。處理后加入新鮮的桑葉，分別于24 h、48 h 檢查試蟲(chóng)的生存和死亡頭數(shù)，按下列公式計(jì)算死亡率和校正死亡率。計(jì)算公式如下:

Abott 公式:

1.7 對(duì)松材線蟲(chóng)的生物活性測(cè)定

采用浸漬生測(cè)法:加1.5 mL 無(wú)菌水(含5%丙酮V/V)樣品稀釋液于直徑為3 cm 小培養(yǎng)皿中，然后加入供試線蟲(chóng)30-50 頭，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，另設(shè)5%丙酮溶液為對(duì)照。同一處理放入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于25℃培養(yǎng)箱中。分別于24 h 和48 h 用針刺法檢查試蟲(chóng)的生存和死亡個(gè)數(shù)，按1.6 的公式計(jì)算死亡率和校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛魚(yú)藤等魚(yú)藤屬植物內(nèi)生真菌的分離和初步鑒定結(jié)果

對(duì)毛魚(yú)藤、白花魚(yú)藤、蜜花魚(yú)藤等魚(yú)藤屬植物根和莖的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離，根據(jù)其菌落形態(tài)和孢子、分生孢子梗著生狀態(tài)等，對(duì)所分離純化的部分內(nèi)生真菌進(jìn)行了初步鑒定，初步鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。由于部分內(nèi)生真菌在PDA 培養(yǎng)基上不能誘導(dǎo)產(chǎn)孢，難以用經(jīng)典形態(tài)學(xué)的方法進(jìn)行菌種鑒定，因此未能全部列出。

表1 魚(yú)藤屬植物內(nèi)生真菌初步鑒定結(jié)果Table 1 Preliminary identification results of endophytic fungi isolated from the Derris

2.2 內(nèi)生青霉等真菌甲醇提取物對(duì)松材線蟲(chóng)的生物活性

采用浸漬生測(cè)法，對(duì)魚(yú)藤內(nèi)生青霉和另外3 株代謝表現(xiàn)旺盛的炭疽屬、擬莖點(diǎn)霉屬和黃曲霉屬內(nèi)生真菌的菌絲體甲醇提取物進(jìn)行了生物活性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。從表中可以看出，4種內(nèi)生真菌中以青霉菌的代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲(chóng)的毒殺效果最強(qiáng)，處理24 h 和48 h 后的校正死亡率分別為85.60%和93.24%，與其他內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的生物活性差異顯著。

表2 4種內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲(chóng)的毒力Table 2 Toxicity of the secondary metabolites of four endophytic fungi against Bursaphelenchus xylophilus N.

2.3 內(nèi)生青霉等真菌甲醇提取物對(duì)家蠶的生物活性

采用點(diǎn)法，對(duì)內(nèi)生青霉等4種真菌菌絲體甲醇提取物對(duì)家蠶4 齡幼蟲(chóng)的觸殺活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，以1.50 mg/頭的劑量點(diǎn)滴處理家蠶4 齡幼蟲(chóng)時(shí)，青霉菌代謝產(chǎn)物對(duì)家蠶4 齡幼蟲(chóng)的觸殺活性最高，24 h 的校正死亡率達(dá)到100%;0.50 mg/頭的劑量對(duì)家蠶4 齡幼蟲(chóng)48 h 和72 h 的校正死亡率分別為50%和95.8%。而另外3種真菌代謝產(chǎn)物對(duì)家蠶4 齡幼蟲(chóng)無(wú)觸殺活性。

表3 4種內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)家蠶4 齡幼蟲(chóng)的觸殺毒力Table 3 Contact toxicity of the secondary metabolites of four endophytic fungi against 4th instar larvae of the silkworm Bombyx mori L.

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)植物病蟲(chóng)害的防治多采用農(nóng)藥來(lái)進(jìn)行化學(xué)防治。但農(nóng)藥的不合理使用也帶來(lái)了一些弊病，如對(duì)害蟲(chóng)天敵的毒害，對(duì)環(huán)境的污染以及導(dǎo)致有害物產(chǎn)生抗藥性等。因此迫切需要開(kāi)發(fā)對(duì)人畜毒副作用小，對(duì)環(huán)境友好且藥效持久的農(nóng)藥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一些植物內(nèi)生真菌為尋找可替代，毒副作用小，安全有效的綠色農(nóng)藥提供了可能(Benhamou and Nicole，1999)。目前，植物內(nèi)生真菌本身及其次生代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用的研究已經(jīng)去取的較大的進(jìn)展，一些非常有價(jià)值的新菌株和新化合物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)(江愛(ài)兵等，2010)。蘭琪等(2004)從苦皮藤植株中分離得到一株具有殺蟲(chóng)活性的內(nèi)生真菌，其菌絲體的丙酮粗提物對(duì)3 齡粘蟲(chóng)有毒殺作用，在500μg/mL 濃度處理下，24 h 后的死亡率為85.3%。Strobel 等(2004)從植物 Bontia daphnoides 中分離得到內(nèi)生真菌Nodulisporium sp.，該菌會(huì)產(chǎn)生一種吲哚二萜類(lèi)化合物Nodulisporic acids，實(shí)驗(yàn)證明該物質(zhì)具有殺滅大蒼蠅幼蟲(chóng)的活性。

根據(jù)某些藥用植物的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)的現(xiàn)象，推測(cè)殺蟲(chóng)植物內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)苦楝的某些內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生楝科植物的活性物質(zhì)——苦楝素(王琪等，2007)，喜樹(shù)的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生喜樹(shù)堿及其衍生物(潘學(xué)武等，2010;曹晉靜和康冀川，2014)。本研究便是以傳統(tǒng)殺蟲(chóng)植物毛魚(yú)藤、白花魚(yú)藤和蜜花魚(yú)藤3種魚(yú)藤屬植物的內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，以家蠶和松材線蟲(chóng)為試蟲(chóng)，測(cè)定魚(yú)藤屬植物的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的生物活性。4種內(nèi)生真菌的的代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲(chóng)都具有一定的毒殺活性，其中青霉菌的代謝產(chǎn)物活性最高，48 h 校正死亡率達(dá)90%以上。4種內(nèi)生真菌中，只有青霉菌的代謝產(chǎn)物對(duì)家蠶4 齡幼蟲(chóng)具有觸殺活性，1.5 mg/頭劑量處理時(shí)，24 h 校正死亡率即達(dá)到100%。本文只對(duì)內(nèi)生真菌的甲醇初提物進(jìn)行了生物活性研究，其次生代謝產(chǎn)物的種類(lèi)以及結(jié)構(gòu)還待進(jìn)一步鑒定。

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