劉桂清，萬方浩

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.廣東省昆蟲研究所，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)和利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)業(yè)害蟲綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東青島 266109)

離腹寡毛實(shí)蠅屬Bactrocera Macquart、小條實(shí)蠅屬Ceratitis Macleay 和按實(shí)蠅屬Anastrepha Schiner是實(shí)蠅科Tephritidae 中寄主范圍最廣，最具經(jīng)濟(jì)重要性的三大類群。世界已知的離腹寡毛果實(shí)蠅有561種，有記載的為害經(jīng)濟(jì)植物的種類有53種，其中具有經(jīng)濟(jì)重要性的種類36種，除橄欖實(shí)蠅B.oleae (Rossi)原產(chǎn)于南歐，現(xiàn)擴(kuò)至非洲、亞洲印度北部和巴基斯坦西北部外，多數(shù)種主產(chǎn)舊大陸的亞洲熱帶、亞熱帶和暖溫帶，以及澳大利亞和南太平洋地區(qū)，少數(shù)種類分布于非洲南部和夏威夷群島。該屬包含許多世界性果蔬植物的檢疫害蟲，如桔小實(shí)蠅B.dorsalis (Hendel)、橄欖實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅B.cucurbitae (Coquillett)、番石榴實(shí)蠅B.correcta (Bezzi)、桔大實(shí)蠅B.minax (Enderlein)、辣椒實(shí)蠅B.latifrons (Hendel)、昆士蘭果實(shí)蠅B.tryoni (Froggatt)、扎氏果實(shí)蠅Bactrocera jarvisi(Tryon)、桃實(shí)蠅B.zonata (Saunders)、南瓜實(shí)蠅B.tau (Walker)等，可危害水果類寄主植物有2l 科37 屬，蔬菜類寄主植物有4 科16 屬(梁廣勤等，1996)。

鑒于離腹寡毛實(shí)蠅屬危害范圍廣及對(duì)國(guó)內(nèi)外貿(mào)易造成的嚴(yán)重?fù)p失，世界上許多國(guó)家和地區(qū)都將離腹寡毛果實(shí)蠅列為重要的危險(xiǎn)性檢疫害蟲，我國(guó)農(nóng)業(yè)部2007年5月28 日頒布實(shí)施的《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，離腹寡毛實(shí)蠅屬所有物種都被列為檢疫性對(duì)象。除加強(qiáng)檢疫外，昆蟲不育技術(shù) (Sterile insect technique，SIT)是根除重大實(shí)蠅害蟲或預(yù)防其在新地區(qū)定殖的有效方法 (Klassen and Curtis，2005)，該技術(shù)的核心是通過大規(guī)模釋放不育雄蟲與野生雌蟲發(fā)生不育交配從而達(dá)到控制該地區(qū)害蟲種群的目的(Knipling，1955)。在輻照處理蛹之前將靶標(biāo)雌、雄蟲分離是不育雄蟲釋放的前提，不育雄蟲釋放不僅可以提高SIT 的防治效果(Rendón et al.，2004)，而且是病媒昆蟲如蚊蟲昆蟲不育技術(shù)項(xiàng)目實(shí)施的先決條件 (Catteruccia et al.，2005)。

通過分析性別決定通路關(guān)鍵基因的進(jìn)化，有助于闡明昆蟲性別分化的分子機(jī)制，而且為發(fā)展雌、雄蟲性別分離策略，提高昆蟲不育昆蟲技術(shù)的應(yīng)用效果和開發(fā)新的害蟲種群遺傳控制方法奠定基礎(chǔ)。目前，黑腹果蠅Drosophila melanogaster Meigen 性別決定分子機(jī)制研究相對(duì)成熟，為離腹寡毛果實(shí)蠅性別決定機(jī)制的比較研究提供了依據(jù)。在果蠅中，遺傳級(jí)聯(lián) (sex lethal ＞transformer +transformer 2 ＞double sex)上游基因通過性別特異剪接方式產(chǎn)生不同的產(chǎn)物控制級(jí)聯(lián)下游基因的剪接，從而控制雌雄分化 (Bell et al.，1991;Sánchez，2008)。Tra-2 基因是性別決定通路關(guān)鍵基因，tranformer (tra)需要與trasformer 2 (tra-2)相互結(jié)合形成Tra/Tra-2 復(fù)合體，調(diào)控下游基因double sex (dsx)pre-mRNA 以雌性特異方式剪接產(chǎn)生雌性特異Dsx 蛋白。胚胎顯微注射tra-2 基因雙鏈RNA 會(huì)導(dǎo)致XX 染色體胚胎發(fā)育為雄蟲表型(Salvemini et al.，2009;Schetelig et al.，2012)，這種性別反轉(zhuǎn)有利于只釋放不育雄蟲的害蟲防治項(xiàng)目。目前，有關(guān)離腹寡毛果實(shí)蠅tra-2 基因生物信息學(xué)方面的系統(tǒng)研究尚未見報(bào)道，故本研究首先克隆得到瓜實(shí)蠅tra-2 基因，對(duì)7種離腹寡毛果實(shí)蠅tra-2 基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究，并對(duì)18種昆蟲tra-2 基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 瓜實(shí)蠅基因組DNA 和總RNA 的提取和文庫(kù)構(gòu)建

瓜實(shí)蠅為廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心室內(nèi)飼養(yǎng)蟲源。成蟲以人工飼料飼養(yǎng)，幼蟲以南瓜飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為27℃±1℃、RH 75%±5%，光周期為14 h∶10 h (光照∶黑暗)。選取初羽化瓜實(shí)蠅雌、雄蟲提取基因組DNA 和總RNA。

參照Bender et al.(1983)的方法提取瓜實(shí)蠅成蟲基因組DNA。采用TriZol Reagent (Invitrogen)分別提取單頭瓜實(shí)蠅雌、雄成蟲總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 樣本的完整性，NanophotometerTMP-Class (IMPLEN，德國(guó))檢測(cè)RNA 的純度和濃度，每個(gè)樣本取2 μg 總量的合格RNA，按 照 TransScript TM One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金生物技術(shù)有限公司)第一鏈cDNA 合成試劑盒說明書構(gòu)建cDNA 文庫(kù);按照BD SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (BD Biosciences)試劑盒說明書分別構(gòu)建雌、雄蟲5'-RACE cDNA 和3'-RACE cDNA 文庫(kù)，具體步驟及注意事項(xiàng)參照試劑盒說明書。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata、橄欖實(shí)蠅、加勒比按實(shí)蠅Anastrepha suspensa 同源tra-2 基因的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物F30/R530 擴(kuò)增瓜實(shí)蠅tra-2 的中間片段，在獲得的中間片段序列基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)5' RACE 和3' RACE 特異引物，擴(kuò)增tra-2 的cDNA 全長(zhǎng)。參照番石榴實(shí)蠅同源tra-2 基因的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)3 對(duì)外顯子特異引物F13/R337，F(xiàn)327/R711，F(xiàn)686/R1140 用于擴(kuò)增瓜實(shí)蠅tra-2 的內(nèi)含子序列。本研究所用引物均使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)，引物序列詳細(xì)信息見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 瓜實(shí)蠅tra-2 基因克隆引物Table 1 Primers for cloning Bactrocera cucurbitae homolog tra-2

1.3 瓜實(shí)蠅同源tra-2 基因克隆

以單頭雌、雄蟲第一鏈cDNA 為模板，采用簡(jiǎn)并引物F30/R530 擴(kuò)增tra-2 的中間片段，PCR 反應(yīng)體系為:滅菌ddH2O 水19.5 μL，10×PCR reaction buffer 2.5 μL，dNTP Mix (10mM)0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，TranStart Taq DNA 聚合酶 (2.5U)0.5 μL，cDNA 模板1 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性3 min;94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，1 min，共35 個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，割取目的大小條帶并用 EasyPure Quick Gel Extraction Kit 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書回收PCR 產(chǎn)物，參照pEASY-T1 Simple Cloning Kit 克隆試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T1 克隆載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布在含有Ampicillin/X-gal/IPTG 的LB 平板上，37℃倒置培養(yǎng)12 h，藍(lán)白斑篩選，挑取5 個(gè)白色菌落進(jìn)行菌液PCR，并將菌落PCR 陽性克隆株挑入LB 液體培養(yǎng)基(含 Amp) 中過夜培養(yǎng)，按照 AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit 質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)說明書提取質(zhì)粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

為擴(kuò)增tra-2 基因的cDNA 全長(zhǎng)，以5' RACE Ready cDNA 為模板，5' RACE out/in 為引物擴(kuò)增tra-2 5' UTR;以3' RACE Ready cDNA 為模板，3'RACE out/in 擴(kuò)增tra-2 3' UTR，RACE-PCR 反應(yīng)程序如下:95℃預(yù)變性3 min;94℃，30 s，72℃，2 min 擴(kuò)增5 個(gè)循環(huán);94℃，30 s;70℃，30 s;72℃，1 min 擴(kuò)增5 個(gè)循環(huán);94℃，30 s;68℃，30 s;72℃，1 min 擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。最后，以基因組DNA 為模板，分別以引物F13/R337、F327/R711、F686/R1140 擴(kuò)增該基因的內(nèi)含子，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95℃退火3 min，94℃，30 s，60℃，45 s，72℃，1 min 擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。所有PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，割膠回收，并將回收產(chǎn)物連接至pEASY-T1 克隆載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆株，送測(cè)序，具體步驟同上。

1.4 序列分析

利用Jemboss 軟件進(jìn)行核苷酸序列翻譯，并預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)域。NCBI網(wǎng)站Blast 工具對(duì)序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，利用Spidey 分析基因外顯子和內(nèi)含子的邊界(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/)。利 用 Bioedit(Hall，1999)和Clustal W (Thompson et al.，1994)軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，參照地中海實(shí)蠅Tra-2 蛋白結(jié)構(gòu)特征確定Tra-2 蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，如N 端和C 端精氨酸/絲氨酸富集區(qū)(Arginine/Serine rich region，RS)、RNA 識(shí)別基序 (RNA recognition motif，RRM) 等 (Salvemini et al.，2009)。

1.5 分子進(jìn)化分析

本文中引用了18種昆蟲的Tra-2 序列進(jìn)行分析，物種及登錄號(hào)分別為:雙翅目:瓜實(shí)蠅(GenBank:KR056217)、桔小實(shí)蠅 (GenBank:KP342061)、番石榴實(shí)蠅(GenBank:KM658207)、橄欖實(shí)蠅(GenBank:AJ547623)、昆士蘭果實(shí)蠅(GenBank:KJ443723)、扎式果實(shí)蠅 B.jarvisi(Tryon)(GenBank:KJ443722)、西印度按實(shí)蠅Anastrepha obliqua (Macquart) (GenBank:FN658607)、加勒比按實(shí)蠅A.suspensa (Loew)(GenBank:JN597290)、地中海實(shí)蠅 Ceratitis capitata (Wiedemann)(GenBank:EU999754)、家蠅Musca domestica L.(GenBank:AY847518)、銅綠蠅 Lucilia cuprinia (Wiedemann) (GenBank:FJ461620)、黑腹果蠅 Drosophila melanogaster Meigen (GenBank:M23633)、黑果蠅D.virilis Sturtevant (GenBank:XM_ 002049663)、擬暗果蠅D.pseudoobscura Frolova ＆ Astaurov (GenBank:XM_ 001360568);鱗翅目:家蠶Bombyx mori L.(GenBank:NM_ 001126233);膜翅目:意大利蜜蜂Apis mellifera L.(GenBank:XM_ 001121070)、麗蠅蛹集金小蜂 Nasonia vitripennis Walker(GenBank:XP_ 001601106)。

利用MEGA 5 軟件進(jìn)行分子進(jìn)化分析，采用Kimura 2 參數(shù)模型(Kimura，1980)估算核苷酸序列分異 (pNT)，并計(jì)算轉(zhuǎn)換與顛換的比值(transition/transversion ratio，R)。采用差異位點(diǎn)占所有比較位點(diǎn)的百分?jǐn)?shù)(p-distance)估算Tra-2蛋白及其RS 和RRM 保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列分異(pAA)(Nei and Kumar，2000)。采用Nei-Gojobori 修正算法 (Zhang et al.，1998)，假設(shè)transition/transversion ratio 為1，計(jì)算核苷酸同義突變率(pS)和非同義突變率(pN)。采用競(jìng)爭(zhēng)刪除選項(xiàng)(Compete deletion option)計(jì)算進(jìn)化距離，鄰接法(Neighbor-joining method)(Tamura et al.，2011)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)構(gòu)建1000 次。同時(shí)利用DnaSP v.5 軟件(Librado and Rozas，2009)分析核苷酸序列分異，所有突變位點(diǎn)經(jīng)Tajima D檢驗(yàn)。并通過計(jì)算Effective Number of Codons(ENC)、Codon BiasIndex (CBI)和Scaled Chisquare (Schi2)分析該基因的密碼子偏好性。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓜實(shí)蠅tra-2 基因結(jié)構(gòu)

以第一鏈cDNA 為模板，以F30/R530 為引物，RT-PCR 擴(kuò)增得到片段長(zhǎng)度為501 bp 的產(chǎn)物，BlastX 分析發(fā)現(xiàn)推斷的氨基酸序列與橄欖實(shí)蠅、暗色實(shí)蠅A.serpentina (Wiedemann)(GenBank:FN658613)Tra 2 蛋白序列的相似度為97%，推斷得到的501 bp 的片段為瓜實(shí)蠅tra-2 基因序列。通過RACE 技術(shù)擴(kuò)增得到tra-2 cDNA 全長(zhǎng)1467 bp，開放讀碼框753 bp，共編碼250 個(gè)氨基酸殘基，分子量為295.59 kD，等電點(diǎn)PI 為6.87，有2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。瓜實(shí)蠅tra-2 與桔大實(shí)蠅同源tra-2 基因的序列一致性最高，達(dá)到90%，其次是與其他離腹寡毛果實(shí)蠅，與地中海實(shí)蠅tra-2 基因的序列一致性為83.6%，與黑腹果蠅的最低，僅為51.6%(表2)。7種離腹寡毛果實(shí)蠅tra-2 基因結(jié)構(gòu)類似，均包含8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子，外顯子和內(nèi)含子大小及其翻譯起始位點(diǎn)見圖1，翻譯起始密碼子均位于第1 個(gè)外顯子末端，與地中海實(shí)蠅tra-2 基因結(jié)構(gòu)相似(Salvemini et al.，2009)，與黑腹果蠅tra-2 (翻譯起始密碼子位于第2 個(gè)外顯子)不同。

圖1 瓜實(shí)蠅tra-2 基因結(jié)構(gòu)及與同屬其他種tra-2 基因結(jié)構(gòu)比較Fig.1 Comparison of genomic organization of Bactrocera cucurbitae tra-2 with that from other Bactrocera species

2.2 瓜實(shí)蠅和其他離腹寡毛果實(shí)蠅Tra-2 蛋白

以該基因推導(dǎo)的Tra-2 氨基酸序列具有SR 蛋白家族的典型特征，如RNA 結(jié)合基序 (RNA Recognition Motif，RRM)及其側(cè)翼的2 個(gè)精氨酸/絲氨酸富集結(jié)構(gòu)域(Arginine/Serine rich domain，RS)，暗示Tra-2 蛋白可以與其他蛋白結(jié)合發(fā)揮其功能。7種離腹寡毛果實(shí)蠅之間的序列一致性最高，其中扎式果實(shí)蠅與昆士蘭果實(shí)蠅的氨基酸序列一致性最高，達(dá)到99.6%，橄欖實(shí)蠅和瓜實(shí)蠅的最低，為94%，番石榴實(shí)蠅與桔小實(shí)蠅的核苷酸序列一致性最高，達(dá)到97.6%，番石榴實(shí)蠅與瓜實(shí)蠅的最低，為87.4%。7種離腹寡毛果實(shí)蠅與地中海實(shí)蠅的序列一致性較高，與黑腹果蠅的最低，只有45.7% (表2)。在氨基酸殘基數(shù)量上，瓜實(shí)蠅和桔大實(shí)蠅的Tra-2 蛋白均有250 個(gè)氨基酸殘基數(shù)，比桔小實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅和扎實(shí)果實(shí)蠅的Tra-2 蛋白少1 個(gè)，比昆士蘭果實(shí)蠅的Tra-2 蛋白少5 個(gè)，但氨基酸差異主要發(fā)生在RS1 和RS2結(jié)構(gòu)域，所有物種的RNA 識(shí)別基序RRM 結(jié)構(gòu)域均有相同的氨基酸殘基數(shù)(圖2)。

2.3 Tra-2 系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化分析

以家蠶、意大利蜜蜂、麗蠅蛹集金小蜂的Tra-2 蛋白作為系統(tǒng)進(jìn)化樹的外圍支，重構(gòu)雙翅目Tra-2 蛋白的進(jìn)化關(guān)系(圖3)，結(jié)果表明，家蠶、意大利蜜蜂、麗蠅蛹集金小蜂Tra-2 蛋白代表1 個(gè)基礎(chǔ)分支，雙翅目昆蟲Tra-2 代表另1 個(gè)分支。在雙翅目昆蟲中，果蠅單獨(dú)聚為一支，蠅科的家蠅和麗蠅科的銅綠蠅以及實(shí)蠅科果實(shí)蠅聚為另一支，在實(shí)蠅科果實(shí)蠅中，按實(shí)蠅屬與小條實(shí)蠅屬先聚在一起，然后與離腹寡毛實(shí)蠅屬聚在一起。離腹寡毛實(shí)蠅屬Tra-2 蛋白與小條實(shí)蠅屬和按實(shí)蠅屬的最為接近，其次是麗蠅科和蠅科的Tra-2 蛋白，這些物種Tra-2 蛋白表現(xiàn)為單一起源，而果蠅Tra-2 蛋白表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性的分化。

表2 Tra-2 氨基酸和cDNA 序列一致性Table 2 Tra-2 amino acids and cDNA sequence percentage identity

圖2 雙翅目昆蟲Tra-2 氨基酸序列比較Fig.2 Comparison of the putative Tra-2 polypeptides from Diptera species

圖3 鄰接法構(gòu)建18種昆蟲Tra-2 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree reconstructed from 18 Tra-2 proteins using the neighbor-joining method

表3 Tra-2 基因的同義和非同義分異Table 3 Synonymous and nonsynonymous divergence of tra-2 genes

DnaSP5 分析18種昆蟲tra-2 基因核苷酸序列比對(duì)的1152 個(gè)核苷酸位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)425 個(gè)核苷酸位點(diǎn)存在變異，其中372 個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Parsimony information sites)，53 個(gè)為單突變位點(diǎn)(Singleton sites)。Tra-2 基因序列分異結(jié)果如表3所示，同義分異Ks 均大于非同義分異Ka，其中同義替換位點(diǎn)數(shù)(SS)為133.33-144.50，同義替換核苷酸多樣性均值Pi (s)為0.63599;非同義替換位點(diǎn)數(shù)(NSS)為395.50-406.67，非同義替換核苷酸多樣性均值Pi (a)為0.25439，表明同義變異引起的tra-2 基因核苷酸變異高于非同義變異，核苷酸多樣性在不同的核苷酸區(qū)段也存在差異，如圖4A 所示，tra-2 基因RS1 和RS2 結(jié)構(gòu)域的核苷酸多樣性高于RRM 結(jié)構(gòu)域。所有突變位點(diǎn)經(jīng)Tajima D 檢驗(yàn)，Tajima's D 為-0.94782，差異不顯著(P ＞0.10)(圖4B)，表明tra-2 基因核苷酸變異符合中性進(jìn)化模型。

圖4 18種昆蟲tra-2 基因編碼核苷酸多態(tài)性和Tajima 中性檢測(cè)Fig.4 DNA polymorphism of tra-2 coding sequences from 18 insects and Tajima's test of neutrality

在氨基酸和核苷酸水平分析18種昆蟲tra-2 基因的變異，同時(shí)分析Tra-2 蛋白R(shí)RM、RS1、RS2結(jié)構(gòu)域的氨基酸和核苷酸變異，結(jié)果如表4 所示，tra-2 基因的總體氨基酸和核苷酸變異分別為0.333±0.019 和0.533±0.022，均高于實(shí)蠅科昆蟲tra-2 基因 (氨基酸和核苷酸變異分別為0.073±0.010 和0.148± 0.010)，實(shí)蠅科 蟲tra-2蛋白高度保守。Tra-2 蛋白及其RRM、RS1 和RS2 結(jié)構(gòu)域的同義突變水平均顯著高于非同義突變水平(Z-test，P＜0.001)，RS1 結(jié)構(gòu)域變異高于RS2，兩者均高于RRM 結(jié)構(gòu)域，說明tra-2 基因變異主要來源于同義突變，受凈化選擇壓力，RRM與RS 結(jié)構(gòu)域相比更為保守。密碼子偏好性分析表明Tra-2 RRM 結(jié)構(gòu)域密碼子偏好性低于RS1 和RS2結(jié)構(gòu)域。

表4 18種昆蟲Tra-2 蛋白及其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)化參數(shù)Table 4 Evolutionary parameters of the 18 Tra-2 proteins and their conserved domains

3 結(jié)論與討論

通過同源基因克隆和RACE 技術(shù)克隆得到瓜實(shí)蠅tra-2 基因組DNA 和cDNA 全長(zhǎng)，瓜實(shí)蠅tra-2基因與其他6種寡毛果實(shí)蠅和地中海實(shí)蠅的基因結(jié)構(gòu)一致，均包含8 個(gè)外顯子和7 個(gè)內(nèi)含子，而且存在內(nèi)含子剪接抑制ISS 位點(diǎn)和RNA 結(jié)合蛋白R(shí)BP1 結(jié)合位點(diǎn)。瓜實(shí)蠅tra-2 基因不存在性別特異剪接，只有1 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，編碼250 個(gè)氨基酸殘基，編碼氨基酸具有SR 蛋白家族特征，如RS 和RRM 結(jié)構(gòu)域。與黑腹果蠅tra-2 存在4 個(gè)轉(zhuǎn)錄本(Amrein et al.，1990;McGuffin et al.，1998)不同，瓜實(shí)蠅tra-2 與地中海實(shí)蠅(Salvemini et al.，2009)、家蠅 (Burghardt et al.，2005)、銅綠蠅(Concha and Scott，2009)、加勒比實(shí)蠅(Schetelig et al.，2012)等同源tra-2 基因均只有1個(gè)轉(zhuǎn)錄本，并未檢測(cè)到生殖系特異的轉(zhuǎn)錄本。序列分析結(jié)果表明瓜實(shí)蠅Tra-2 與其他離腹寡毛果實(shí)蠅和地中海實(shí)蠅的氨基酸和核苷酸的序列一致性均比黑腹果蠅的Tra-2 高，Tra-2 系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果也表明7種離腹寡毛果實(shí)蠅與實(shí)蠅科的地中海實(shí)蠅和按實(shí)蠅、蠅科的家蠅和麗蠅科的銅綠蠅的遺傳距離更近，為單一起源，而果蠅Tra-2 表現(xiàn)出明顯的分異。分子進(jìn)化分析結(jié)果表明tra-2 基因核苷酸變異主要來源于同義變異，Tra-2 蛋白受凈化選擇壓力，以維持RNA 結(jié)合蛋白的典型特征，特別是RNA 識(shí)別基序RRM 的結(jié)構(gòu)。

在地中海實(shí)蠅、橄欖實(shí)蠅、銅綠蠅和加勒比按實(shí)蠅等昆蟲中，Tra-2 通過與Tra 結(jié)合形成Tra/Tra-2復(fù)合體，在性別決定中發(fā)揮雙重功能:一方面通過與下游基因dsx 雌性特異外顯子結(jié)合，調(diào)控dsx 雌性特異剪接;另一方面通過與tra 雄性特異外顯子結(jié)合，抑制這些外顯子被剪接翻譯為成熟的mRNA (Concha and Scott，2009;Salvemini et al.，2009;Schetelig et al.，2012)，Tra-2 內(nèi)含子剪接抑制ISS 位點(diǎn)在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用 (Ruiz et al.，2007)。由于Tra 缺乏RNA 結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，因此，Tra 發(fā)揮作用必須與RNA 結(jié)合蛋白如Tra-2 相互作用(Black，2003)。tra-2 基因核苷酸序列同義和非同義替換率結(jié)果表明該基因受凈化選擇壓力，通過維持Tra-2 蛋白結(jié)構(gòu)的高度保守發(fā)揮其在昆蟲性別決定中的作用。在果蠅中，Tra 已發(fā)生高水平的中性進(jìn)化(Kulathinal et al.，2003)，而Tra-2 精氨酸/絲氨酸富集區(qū)RS 是Tra 和Tra-2相互結(jié)合的位置，因此，tra-2 基因RS 結(jié)構(gòu)域核苷酸變異很可能是為了適應(yīng)tra 核苷酸變異，以保證Tra/Tra-2 復(fù)合體的形成，Tra-2 通過與Tra 協(xié)同進(jìn)化發(fā)揮其在昆蟲性別決定中的作用。

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