吳春濤，李擁軍，劉蘇，王智勇

探討微小核糖核酸-455在壓力超負荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型中的作用機制

吳春濤，李擁軍，劉蘇，王智勇

目的：通過結(jié)扎小鼠主動脈弓導(dǎo)致主動脈縮窄（TAC）兩周后建立心肌肥厚的模型，旨在探討微小核糖核酸-455（miR-455）在心肌肥厚中細胞與分子學(xué)機制。

方法：選用18只昆明種小鼠，隨機分為TAC+miR-455組（n=6，尾靜脈注射包被miR-455 的腺病毒）、TAC+綠色熒光蛋白（GFP）組（n=6，TAC+GFP組，尾靜脈注射包被GFP的腺病毒）和假手術(shù)組（n=6，尾靜脈注射包被GFP的腺病毒）。術(shù)后兩周測量小鼠血流動力學(xué)及超聲心動圖指標(biāo)；對心肌組織進行蘇木素-伊紅（HE）染色和馬松（MASSON） 染色觀察心肌組織病理學(xué)變化；應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）方法檢測心肌肥厚基因與纖維化基因的表達；免疫蛋白印跡法（Western blot）分析凋亡蛋白；qRT-PCR與Western blot分析miR-455的靶基因和蛋白。

結(jié)果：造模兩周時，與假手術(shù)組比較，TAC+GFP組小鼠心重/體重值增加[（9.78±0.20） mg/g vs（8.25±0.22） mg/g，P＜0.01]，左心室舒張期前壁厚度明顯增加[（1.782±0.058） mm vs （1.457±0.050） mm，P＜0.05]，左心室舒張期內(nèi)徑變小[（3.027±0.052）mm vs （3.142±0.050）mm，P＜0.05]，左心室射血分數(shù)增加[（84.167 ±4.167）% vs（77.000±3.347）%，P＜0.05]；心肌肥厚基因（心房鈉尿因子、骨骼肌肌動蛋白和β肌球蛋白重鏈）和心肌纖維化基因（轉(zhuǎn)化生長因子β1和結(jié)締組織生長因子）表達的明顯增加（P均＜0.05）；抗凋亡蛋白有明顯降低，促凋亡蛋白明顯升高（P均＜0.05）。與TAC+GFP組比較，TAC+miR-455組小鼠的心重/體重值增加[（12.04±0.11）mg/g vs （9.78±0.20）mg/g，P＜0.01]，左心室舒張期前壁厚度增加[（1.908±0.062） mm vs （1.782±0.058）mm，P＜0.01]，左心室舒張期內(nèi)徑變小 [（2.893±0.069）mm vs（3.027±0.052） mm，P＜0.01]，但兩組在左心室射血分數(shù)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；心肌肥厚基因表達增加（P均＜0.05），但心肌纖維化基因表達水平兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2雖降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），促凋亡蛋白Bax無明顯升高。Western blot 分析，TAC+GFP組與假手術(shù)組比較，鈣網(wǎng)蛋白（CALR）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 （GRP78）蛋白水平都有升高（P均＜0.01），TAC+miR-455組與TAC+GFP組比較，GRP78水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而CALR水平卻有了明顯下降（P＜0.01）；qRT-PCR結(jié)果顯示CALR水平下降同時也有CALR mRNA的下降（P＜0.01）。

結(jié)論：短期壓力負荷后小鼠出現(xiàn)了代償性心肌肥厚的特征，表現(xiàn)為心室壁的增厚，心室腔的縮小，心重/體重比值增加以及心臟收縮功能的增強；病理學(xué)出現(xiàn)明顯心肌細胞增大，伴隨出現(xiàn)心肌肥厚相關(guān)的胎兒期基因的重新激活。miR-455通過降解靶mRNA使CALR降低這條途徑，使得心肌細胞進一步增大，心肌肥厚更加明顯。

微小核糖核酸；心肌肥厚；鈣網(wǎng)蛋白

Methods: The mice model of cardiac hypertrophy was established by transverse aorta constriction (TAC), and 18 male kunming TAC mice were randomly divided into 3 groups:①TAC + miR-455 group,②TAC + GFP (green fluorescence protein)

group and ③Sham group (sham operation + GFP). n=6 in each group and all animals were treated for 2 weeks. The hemodynamic and echocardiographic indexes were examined, histo-pathological changes of myocardial tissue were observed by HE and Masson staining. The hypertrophic and fibrosis gene expressions were measured by RT-PCR, the apoptosis protein level was detected by Western blot analysis. The expressions of miR-455 targeting gene and protein were also determined.

Results: Upon 2 weeks modeling, compared with Sham group, TAC+GFP group had increased ratio of heart weight/ body weight (9.78 ± 0.20) mg/g vs (8.25 ± 0.22) mg/g, P＜0.01, increased left ventricular diastolic (LVD) wall thicknesses (1.782 ± 0.058) mm vs (1.457 ± 0.050) mm, P＜0.05, decreased LVD diameter (3.027 ± 0.052) mm vs (3.142±0.050) mm, P＜0.05, increased LVEF (84.167 ± 4.167) % vs (77.000 ± 3.347) %, P＜0.05; increased gene expressions of cardiac hypertrophy and fibrosis, all P＜0.05, decreased anti-apoptosis protein and increased promoting apoptosis protein, all P＜0.05. Compared with TAC+GFP group, TAC+miR-455 group presented increased ratio of heart weight/body weight (12.04 ± 0.11) mg/g vs (9.78 ± 0.20) mg/g, P＜0.01, increased LVD wall thicknesses (1.908 ± 0.062) mm vs (1.782 ± 0.058) mm, P＜0.01, decreased LVD diameter (2.893 ± 0.069) mm vs (3.027 ± 0.052) mm, P＜0.01, while LVEF was similar between 2 groups, P＞0.05; increased gene expression of cardiac hypertrophy, P＜0.05, while gene expression of cardiac fibrosis was similar between 2 groups, P＞0.05; the anti-apoptosis protein and promoting apoptosis protein expressions were similar between 2 groups. Compared with Sham group, TAC+GFP group had increased expressions of calreticulin (CALR) and glucose-regulated protein 78 (GRP78), all P＜0.01. Compared with TAC+GFP group, TAC+miR-455 group had decreased mRNA and protein expressions of CALR, both P＜0.01, while GRP78 protein expression was similar between 2 groups, P＞0.05.

Conclusion: miR-455 may promote cardiac hypertrophy induced by short-term overload pressure via targeting CALR in experimental mice.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:889.)

近年來在多種生命體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的小分子核糖核酸（RNA），即微小核糖核酸（miRNA）。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的15～22 bp的非編碼單鏈RNA分子，通過結(jié)合靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)而對其表達進行轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控[1]。最近發(fā)現(xiàn)miRNA通過轉(zhuǎn)錄后負性調(diào)節(jié)目的蛋白質(zhì)參與許多心血管病，例如miRNA-34a、miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-133、miRNA-208/miRNA-195和miRNA-199與心肌肥厚有關(guān)[2-5]，miRNA-29 和miRNA-21與心肌纖維化有關(guān)[6,7]，miRNA-210 和miRNA-494與缺血性心臟病有關(guān)[8,9]。事實上關(guān)于微小核糖核酸-455（miR-455）的研究很少，PubMed 上僅有4篇關(guān)于miR-455的文章[10-13]，而且其中并沒有miR-455與心肌肥厚的研究。通過計算機計算miR-455 的5'端有6個核苷酸，被稱為種子序列（Seed sequence），與鈣網(wǎng)蛋白（CALR）匹配完好（圖1），而CALR與心肌肥厚關(guān)系密切，因此可以大膽推測miR-455在心肌肥厚中起著重要作用。我們通過小鼠結(jié)扎主動脈弓導(dǎo)致主動脈縮窄（TAC））建立了心肌肥厚的模型，旨在探討miR-455在心肌肥厚中的細胞與分子學(xué)機制。

圖1 miR-455與鈣網(wǎng)蛋白的堿基互補

1 材料與方法

實驗動物與分組：選用18只4周齡健康雄性昆明種小鼠（購自河北醫(yī)科大學(xué)），體重約（20±2）g，隨機分為主動脈縮窄（TAC）+miR-455組（TAC+miR-455組），TAC+綠色熒光蛋白（GFP）組（TAC+GFP組）和假手術(shù)組，每組6只。TAC+miR-455組小鼠于主動脈弓結(jié)扎術(shù)后第1天，第8天尾靜脈注射包被miR-455 的腺病毒0.1 ml（5.0×109ifu/ml，Invitrogen，中國上海）；TAC+GFP組小鼠于主動脈弓結(jié)扎術(shù)后第1天，第8天尾靜脈注射包被GFP的腺病毒0.1 ml（1.0×109ifu/ml，Invitrogen，中國上海） ；假手術(shù)組小鼠于手術(shù)后第1天，第8天尾靜脈注射包被GFP的腺病毒0.1 ml（1.0×109ifu/ml，Invitrogen，中國上海）。

動物模型制作：小鼠麻醉后找到左胸骨邊緣約2 mm處，沿第二肋間隙打開胸腔，游離主動脈弓，于鎖骨下動脈（第一分支）和左頸總動脈（第二分支）間穿0號線備用，平行于主動脈弓放置27-gauge（直徑0.4 mm）針頭，一同結(jié)扎后抽出針頭，使主動脈狹窄65%～70%。假手術(shù)組手術(shù)同上，但不結(jié)扎主動脈弓。

超聲心動圖檢查：應(yīng)用超聲心動圖于手術(shù)前、術(shù)后2周評估心功能。測量左心室舒張期內(nèi)徑

（LVIDd）、左心室舒張期前壁厚度（LVAWd）、左心室射血分數(shù)（LVEF）。

血流動力學(xué)檢測：術(shù)前、術(shù)后2周三組小鼠行微導(dǎo)管術(shù)進行血流動力學(xué)檢測，測量并記錄動脈收縮壓、左心室收縮末壓（LVESP）、左心室舒張末壓（LVEDP）。

病理組織學(xué)檢測：血流動力學(xué)測定之后，迅速取出心臟，放入冰生理鹽水后泵出心腔余血，濾紙吸干水分精密天平稱重，計算心重/體重值（mg/ g）。取心室肌，置于4%多聚甲醛中，梯度乙醇脫水，石蠟切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色和馬松（MASSON） 染色，應(yīng)用Motic 6.0分析軟件（中國廈門）顯微鏡下觀察。

心肌組織miR-455、mRNA的測定：Trizol法提取總RNA，使用Applied Biosystems 7300型PCR基因擴增儀進行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）。miR-455以U6為內(nèi)參（All-in-One miRNA qPCR Detection System，GeneCopoeia，馬里蘭州，美國），miR-455 引物序列：ATGTGCCTTTGGACTACATCGAA；U6引物序列：TCGTGAAGCGTTCCATATTTTTAA；通用下游引物：TTACTACGTCATGACTAGTAA。mRNA以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參（賽百盛，中國北京），采用ΔCt（ΔCt目的-ΔCt內(nèi)參）法進行相對定量分析，以2-ΔCt作為目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

免疫蛋白印跡法分析：提取心肌細胞總蛋白，用Lowry蛋白定量試劑盒測定蛋白含量[14]，用5X樣品Buffer處理后分裝-70℃貯存。取上述細胞蛋白樣品（含蛋白75 μg）進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，10%分離膠），將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（Millipore Immobion-P，Millipore，馬塞諸塞州，美國），經(jīng)封閉、洗脫后分別加入抗CALR：1:500；抗Bax：1:500；抗Bcl-2：1:1000（博士德，中國武漢）4℃孵育過夜，洗膜后以相應(yīng)熒光二抗孵育1 h，并以兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（1:5000，BioWorld，中國南京）同上操作，作為內(nèi)對照?？乖贵w復(fù)合物用雙色紅外激光掃描儀進行掃膜采用Image-Pro Plus（Version 4.1，Media Cybernetics，LP，美國）軟件分析蛋白條帶積分光密度值（IOD），以靶蛋白IOD 與GAPDH 的IOD比值反映靶蛋白相對表達水平。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間及組內(nèi)比較用方差分析（ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-455在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染（圖2）

造模2周后，與假手術(shù)組相比，TAC+GFP組小鼠體內(nèi)miR-455表達明顯降低。與TAC+GFP組相比，TAC+miR-455組小鼠體內(nèi)miR-455表達明顯升高（P均＜0.01），說明miR-455在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染成功。

圖2 小鼠心肌組織miR-455的表達

2.2 miR-455對小鼠血流動力學(xué)、超聲心動圖參數(shù)、心肌肥厚和心肌纖維化基因及心肌組織病理學(xué)的影響（表2）

造模2周后，與假手術(shù)組相比，右側(cè)頸動脈血壓測定顯示，TAC+GFP組和TAC+miR-455組小鼠動脈收縮壓和LVESP明顯升高（P均＜0.01），但是

LVEDP差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），說明小鼠高血壓模型成功，正處于高血壓后心肌肥厚狀態(tài)，未進入心力衰竭。

與假手術(shù)組相比，TAC+GFP組小鼠的心重/體重值增加（P＜0.01），LVAWd明顯增加，LVIDd變小，LVEF增加（P均＜0.05）。TAC+miR-455組較TAC+GFP組心重/體重值增加（P＜0.01），LVAWd增加，LVIDd減?。≒均＜0.01）。TAC+miR-455組較TAC+GFP組LVEF增加， 但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

miR-455對心肌肥厚基因表達的影響：造模兩周時，與假手術(shù)組比較，TAC+GFP組小鼠心肌組織中心房鈉尿因子、骨骼肌肌動蛋白和β肌球蛋白重鏈基因表達有明顯增加（P均＜0.01）。與TAC+GFP組比較，TAC+miR-455組心房鈉尿因子、骨骼肌肌動蛋白和β肌球蛋白重鏈的基因表達有進一步增加（P均＜0.05）。

miR-455對心肌纖維化基因表達的影響：與假手術(shù)組比較，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）和結(jié)締組織生長因子（CTGF）在TAC+GFP組和TAC+miR-455組的表達都有明顯上升（P均＜0.05），但兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明TAC 2周時心肌纖維化已開始出現(xiàn)，但miR-455對纖維化的影響未明顯顯現(xiàn)出來。

造模2周時，心室壁HE染色顯示，假手術(shù)組可見心室壁厚度正常，TAC+GFP組心室壁厚度增厚，TAC+miR-455組較TAC+GFP組心室壁厚度進一步增厚。心肌細胞HE染色顯示，假手術(shù)組可見心肌細胞呈紅色，心肌細胞排列整齊，大小正常，胞漿均勻，胞核染色均勻。TAC+GFP組心肌細胞橫截面積增大。TAC+miR-455組較TAC+GFP組心肌細胞進一步增大，心肌細胞排列紊亂，細胞漿濃染，細胞間距增大，細胞核空染增多。心肌纖維MASSON染色顯示，假手術(shù)組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細胞間隙中，呈現(xiàn)藍色，較之于假手術(shù)組，TAC+GFP組和TAC+miR-455組心肌膠原纖維明顯增加（圖3）。

表2 三組小鼠血流動力學(xué)、超聲心動圖參數(shù)及心肌肥厚基因和心肌纖維化基因的表達比較

表2 三組小鼠血流動力學(xué)、超聲心動圖參數(shù)及心肌肥厚基因和心肌纖維化基因的表達比較

注：1 mmHg=0.133 kPa。與假手術(shù)組比*P＜0.05**P＜0.01；與TAC+GFP組比△P＜0.05△△P＜0.01。余注見圖2

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圖3 心肌HE及MASSON染色結(jié)果

miR-455 對心肌細胞凋亡的影響（圖4）：Western blot 示造模兩周時，與假手術(shù)組相比，TAC+GFP組促凋亡蛋白Bax水平有明顯上升（P＜0.05），TAC+miR-455組變化不明顯（P＞0.05）。對于抗凋亡蛋白Bcl-2，與假手術(shù)組比較，TAC+GFP組和TAC+miR-455組有所下降（P＜0.01），但后兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

miR-455的靶基因分析（圖5）：Western blot 分

析，TAC+GFP組小鼠心肌CALR和GRP78蛋白水平升高（P均＜0.01），但經(jīng)過了miR-455的干擾，TAC+miR-455組GRP78水平依然升高（P＜0.01），而CALR水平卻有了明顯下降（P＜0.01），說明CALR是miR-455的靶蛋白之一。qRT-PCR提示CALR水平下降同時也有小鼠心肌CALR mRNA的表達下降，說明miR-455對CALR的調(diào)節(jié)是通過降解mRNA來抑制蛋白翻譯。

圖4 免疫蛋白印跡法分析小鼠心肌組織凋亡蛋白表達

3 討論

在實驗中，首先利用TAC成功構(gòu)建了壓力超負荷致小鼠心肌肥厚模型，兩周后小鼠出現(xiàn)了明顯的代償性的向心性心肌肥厚，伴隨有心室壁的增厚以及心室腔的縮小。升主動脈縮窄后，會出現(xiàn)血流動力學(xué)上的改變，心臟后負荷增加，改變了一系列神經(jīng)激素分泌，出現(xiàn)心肌肥厚。在這一過程中，會出現(xiàn)一些與心肌肥厚相關(guān)的胎兒期基因的表達升高，例如心房鈉尿因子、骨骼肌肌動蛋白和β肌球蛋白重鏈基因等分子。

圖5 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和免疫蛋白印跡法分析小鼠心肌miR-455的靶基因及靶蛋白表達

在這里第一次證明了在壓力超負荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠體內(nèi)miR-455是下調(diào)的。如果上調(diào)miR-455，會加速了小鼠的心肌肥厚，這與miR-455調(diào)控的靶mRNA——CALR密切相關(guān)。CALR是一種Ca2+結(jié)合分子伴侶，在維持細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)和協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊上有關(guān)鍵調(diào)控，在成熟心臟中保持在低水平，一旦其基因轉(zhuǎn)錄再次活化，蛋白水平升高說明出現(xiàn)了心肌肥大等病理狀態(tài)。

Tsutsui等[15]應(yīng)用腹主動脈狹窄的方法，塑造了壓力超負荷型的心肌肥厚大鼠模型，對大鼠進行心功能檢查與CALR檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌收縮力降低，肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶（SERCA）蛋白水平降低，CALR表達上調(diào)；應(yīng)用免疫組化方法，在對照組大鼠心臟中找到了CALR主要分布在間質(zhì)成纖維細胞。

張振英等[16]發(fā)現(xiàn)腹主動脈狹窄可誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚，與對照組比較，術(shù)后7天模型組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶CALR mRNA 表達于術(shù)后1天即發(fā)生顯著上調(diào)，較對照組增加136%，而蛋白在術(shù)后7天開始出現(xiàn)顯著變化，較對照組升高69.2% 。我們的研究與以往研究相一致，即心肌肥厚會伴隨CALR升高。實驗中下調(diào)CALR導(dǎo)致心肌肥厚的加重，Lee等[17]發(fā)現(xiàn)CALR可以抑制去甲腎上腺素誘導(dǎo)心肌細胞肥厚，為我們的發(fā)現(xiàn)提供了有力的支持。下調(diào)CALR后，β肌球蛋白重鏈有明顯增加，但仍可以看出LVEF有所升高，這種表現(xiàn)似乎與β肌球蛋白重鏈的作用不吻合。已知β-MHC與肌動蛋白的親和力低于a肌球蛋白重鏈，故以β肌球蛋白重鏈為主的心肌收縮力弱，收縮速度減慢而導(dǎo)致心肌收縮功能減退，而本實驗僅僅是TAC后兩周，β肌球蛋白重鏈雖然升高，但并不能保證β肌球蛋白重鏈在肥厚心肌中的作用已超過α肌球蛋白重鏈，有可能兩者最終的作用仍是α肌球蛋白重鏈為主，至于miR-455對TAC后長期心功能的影響尚需進一步實驗證實。并且本實驗進一步得出，CALR受到miR-455的調(diào)控，即CALR是miR-455的靶蛋白之一，如果上調(diào)miR-455那么CALR表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢，而且這種下調(diào)是通過降解靶mRNA實現(xiàn)，而非通過抑制其翻譯實現(xiàn)。因此，可以通過下調(diào)miR-455使得心肌肥厚得到減輕，從而延緩心力衰竭的進程。

通常明顯的心肌纖維化和凋亡多發(fā)生在慢性心衰的后期，此實驗主要探討短期TAC后miR-455的作用，雖然已出現(xiàn)心肌纖維化和凋亡發(fā)生，但miR-455尚未有顯著作用，因此miR-455對長期TAC后心肌肥厚的影響還需要進一步實驗證實。

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miR-455 Promotes Cardiac Hypertrophy Induced by Short-term Overloaded Pressure in Experimental Mice

WU Chun-tao, LI Yong-jun, LIU Su, WANG Zhi-yong.
Intensive Care Unit, The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050051), Hebei, China

Objective: To investigate the role of miR-455 in cardiac hypertrophy with its potential cellular and molecular mechanism in mice.

microRNA; Cardiac hypertrophy; Calreticulin

2014-08-20）

（編輯：許 菁）

050051 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科（吳春濤、王智勇）；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 心內(nèi)科（李擁軍），心外科（劉蘇）

吳春濤 副主任醫(yī)師 博士 主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究 Email：twbeer126@163.com 通訊作者：吳春濤

R54

A

1000-3614（2015）09-0889-06

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.09.016