譚焱，王繼業(yè)，易仁亮，邱健

探討雷帕霉素靶向抑制mTOR對(duì)大鼠心瓣膜細(xì)胞鈣化的影響及其作用機(jī)制

譚焱，王繼業(yè)，易仁亮，邱健

目的：探討雷帕霉素靶向抑制mTOR對(duì)大鼠心瓣膜細(xì)胞鈣化的影響及其作用機(jī)制。

方法：體外分離大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞后培養(yǎng)并鑒定；細(xì)胞共分為4組：正常對(duì)照組、鈣化誘導(dǎo)組、雷帕霉素組、鈣化誘導(dǎo)+雷帕霉素組；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；采用茜素紅S染色并觀察鈣沉積的變化，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)各組細(xì)胞中骨形成蛋白-2（bmp-2），骨鈣素（osteocalcin），骨調(diào)素（osteopontin），smad同源物1（smad1）及半胱氨酸蛋白酶（caspase-3）的表達(dá)水平。

結(jié)果：成功分離獲得大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞；各組細(xì)胞凋亡率沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）；鈣化誘導(dǎo)組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；鈣化誘導(dǎo)組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)（0.471±0.091）較正常對(duì)照組（0.104±0.023）多，鈣化誘導(dǎo)+雷帕霉素組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)（0.237±0.039）明顯少于鈣化誘導(dǎo)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；鈣化誘導(dǎo)組細(xì)胞的骨形成蛋白-2，骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），鈣化誘導(dǎo)+雷帕霉素組的骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白的表達(dá)水平明顯低于鈣化誘導(dǎo)組（P＜0.05），但3個(gè)實(shí)驗(yàn)組間caspase-3蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

結(jié)論：mTOR抑制劑雷帕霉素通過(guò)抑制mTOR后下調(diào)其靶蛋白骨形成蛋白-2、骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白的表達(dá)水平，從而抑制大鼠心瓣膜細(xì)胞的鈣化，即細(xì)胞鈣化變緩很可能與mTOR通路被抑制有密切的關(guān)系。

mTOR；雷帕霉素；心瓣膜細(xì)胞；細(xì)胞鈣化

Methods: The rat’s valvular interstitial cells were isolated and the cells were cultured in 4 groups: ①Normal control group, ②Calcification group, ③Rapamycin group and ④Calcification + rapamycin group. The apoptosis rates of valvular interstitial cells were detected by flow cytometry, calcium deposition was observed by Alizarin S staining, the calcified nodules were counted and the protein expressions of bmp-2, osteocalcin, osteopontin, smad-1 and caspase-3 were examined by Western blot analysis.

Results: The rat's valvular interstitial cells were suceessfully isolated; the cell apoptosis rates were similar among different groups, P＞0.05. The calcified nodule in Calcification group (0.471 ± 0.091) was more than Normal control group (0.104 ± 0.023), while the nodule in Calcification + rapamycin group (0.237 ± 0.039) was less than Calcification group, all P＜0.05. Compared with Normal control group, the protein expression levels of bmp-2, osteopontin and smad-1 were obviously increased in Calcification

group, P＜0.05, and compared with Calcification group, the above indexes were obviously lower in Calcification + rapamycin group, P＜0.05. The protein expression levels of caspase-3 were similar among 3 experimental groups, P＞0.05.

Conclusion: Rapamycin may down-regulate the targeting protein expressions of bmp-2, osteopontin and smad-1 via inhibiting mTOR, therefore, reducing the valvular interstitial cell calcification which might be related to mTOR pathway suppression in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:900.)

鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄（Calcific aortic valve stenosis, CAVS）是一類多發(fā)的老年退行性疾病，發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增高[1]。鈣化是CAVS最常見且重要的病理特征之一，近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn)，在退行性主動(dòng)脈瓣病變患者的瓣膜間質(zhì)鈣化區(qū)域中，成骨細(xì)胞相關(guān)的特異基因表達(dá)增加[2]。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞在CAVS各種發(fā)病機(jī)制中均被活化，出現(xiàn)不正常的增殖、分化，說(shuō)明其在CAVS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，抑制其增殖、分化可能成為CAVS治療的新切入點(diǎn)[3]。mTOR （mammalian target of RAPA）是抗癌藥物雷帕霉素（RAPA）的靶物質(zhì)[4]，也是細(xì)胞生長(zhǎng)的中樞控制因子，它根據(jù)細(xì)胞環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)條件做出相應(yīng)的應(yīng)答，參與調(diào)控蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的活性，從而控制與蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)[5]。因此在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化方面起著關(guān)鍵作用[6]。多數(shù)疾病的發(fā)生與mTOR信號(hào)通路調(diào)控異常密切相關(guān)[7]。在腫瘤方面，與之密切相關(guān)的生理過(guò)程如細(xì)胞的增殖、分化等均受mTOR的調(diào)控，抑制mTOR通路可以有效阻斷各種生長(zhǎng)因子異常信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[8]。本文利用雷帕霉素靶向抑制mTOR并研究其影響大鼠心瓣膜細(xì)胞鈣化的過(guò)程及機(jī)制，為mTOR靶向抑制在心臟瓣膜、腫瘤等疾病的應(yīng)用及新藥開發(fā)的靶點(diǎn)方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

材料：雷帕霉素（RAPA）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)所用抗體兔抗鼠成骨相關(guān)蛋白如骨形成蛋白-2（bmp-2）、骨鈣素（osteocalcin）、骨調(diào)素（osteopontin）、smad同源物1（smad1）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；茜素S染色試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基；鈣化培養(yǎng)基成分（含10 mmol/Lβ-甘油磷酸，50 μg/ml維生素C，100 nmol/L地塞米松的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO；PBS緩沖液： NaCl 8.0 g，KCl 0.2g，KH2PO40.24 g，Na2HPO4·12H2O 3.628 g，溶于800 ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1 000 ml，高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆?；Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）：濃度1 mol/L Tris-HCl 10 ml，加入NaCl 8.8 g，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1 000 ml備用。

大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)、鑒定及分組：采用膠原酶消化法體外分離大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞并傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1% L-glutamine，100 mg/L鏈霉素，1×105U/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃下，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞足量后，用免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞鑒定。經(jīng)鑒定后，將細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組：細(xì)胞不做任何處理；鈣化誘導(dǎo)組：細(xì)胞接受鈣化培養(yǎng)基行鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)；雷帕霉素組：細(xì)胞接受100 nmol/L雷帕霉素培養(yǎng)；鈣化誘導(dǎo)+雷帕霉素組：細(xì)胞接受鈣化培養(yǎng)基與100 nmol/L雷帕霉素培養(yǎng)。

大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡率流式檢測(cè)：細(xì)胞加藥培養(yǎng)24 h后，每組處理取3個(gè)復(fù)孔， 用0.25%胰酶消化，于1 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，以PBS洗液洗2次，細(xì)胞懸于PI-Annexin v凋亡雙染試劑盒中的緩沖液中，濃度為每毫升1×106個(gè)細(xì)胞，400目篩網(wǎng)過(guò)濾，準(zhǔn)確吸取0.5 ml細(xì)胞懸液于上樣管中，再加入5 μl Annexin v-FITC和PI染液，于室溫避光染色10 min后，上機(jī)檢測(cè)，用CellQuest軟件獲取1×104個(gè)細(xì)胞，分析活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞的百分率。

大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞茜素紅S染色：細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)7 d后，以70%乙醇固定細(xì)胞1 h，以雙蒸水洗3次后，茜素紅S溶液染色30 min。染色后以雙蒸水洗3遍，經(jīng)鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后，經(jīng)茜素紅S染色在瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的胞外基質(zhì)中可見鈣結(jié)節(jié)形成，經(jīng)

隨機(jī)在各實(shí)驗(yàn)組各抽取5孔比較，置于顯微鏡下觀察并進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)。

Western blot分析: 大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)7 d后，檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中骨形成蛋白-2、骨鈣素、骨調(diào)素、smad同源物1、caspase-3蛋白的表達(dá)水平[9]。按照說(shuō)明書操作進(jìn)行總蛋白定量。SDSPAGE電泳后PVDF膜轉(zhuǎn)膜和孵育抗體，5 %脫脂奶粉-TBS封閉，一抗1:1 500，室溫，反應(yīng)2 h。TBS洗滌PVDF膜5 min×5次，二抗1:5 000，室溫反應(yīng)1 h，TBS洗5 min×5次，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，采用Quantity One v 4.4.0軟件對(duì)目的蛋白及GAPDH所對(duì)應(yīng)條帶進(jìn)行光密度分析。

2 結(jié)果

大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果（圖1）：分離培養(yǎng)的大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白均為陽(yáng)性表達(dá)，證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞。

圖1 大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定圖

大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡測(cè)定結(jié)果：正常對(duì)照組（3.87±0.44）、雷帕霉素組（4.15±0.47）、鈣化誘導(dǎo)組（3.06±0.65）和鈣化誘導(dǎo)+雷帕霉素組（4.21±0.71）大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的凋亡率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)定量分析（圖2）：鈣化誘導(dǎo)組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)（0.471±0.091）明顯較正常對(duì)照組（0.104±0.023）多（P＜0.05），鈣化誘導(dǎo)+雷帕霉素組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)（0.237±0.039）明顯少于鈣化誘導(dǎo)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞茜素紅S染色

大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化（圖3、表1）：鈣化誘導(dǎo)組細(xì)胞的骨形成蛋白-2、骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組均升高（P＜0.05）； 鈣化誘導(dǎo)+雷帕霉素組的骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白表達(dá)水平較鈣化誘導(dǎo)組均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組間caspase-3蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平

表1 大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

表1 大鼠心瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

注：與正常對(duì)照組比較*P＜0.05；與鈣化誘導(dǎo)組比較△P＜0.05

?

3 討論

主動(dòng)脈瓣瓣膜鈣化可引起主動(dòng)脈瓣狹窄、關(guān)閉不全等疾病，是導(dǎo)致老年退行性瓣膜病的重要病理改變[10]。既往普遍認(rèn)為瓣膜鈣化是被動(dòng)的退行性鈣磷沉積的過(guò)程，而現(xiàn)在研究者明確該過(guò)程是一種普遍存在且高度保守的細(xì)胞通路介導(dǎo)的主動(dòng)性過(guò)程[11]。mTOR是雷帕霉素進(jìn)入細(xì)胞后的靶物質(zhì)，細(xì)胞中高度保守的FPR1基因編碼胞質(zhì)蛋白FKBPl2是雷帕霉素的直接受體[12]。mTOR抑制劑在心臟瓣膜、腫瘤等疾病方面的應(yīng)用有一定的前景，其衍生的新一代的化合物有雷帕霉素、依維莫司、坦西莫司等，均具有抗生素、免疫抑制及抗腫瘤的作用[13]。目前已有的研究證實(shí)雷帕霉素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，但是，mTOR信號(hào)通路在鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的研究尚少有報(bào)道。以往體內(nèi)誘導(dǎo)動(dòng)物瓣膜鈣化方法繁瑣且需時(shí)較長(zhǎng)，穩(wěn)定性差[14]，因此建立簡(jiǎn)易、有效、穩(wěn)定的體外瓣膜鈣化模型非常必要。

本研究采用膠原酶消化法從大鼠主動(dòng)脈瓣中分離并體外培養(yǎng)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，以含有β-甘油磷酸的鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈣化，從而實(shí)現(xiàn)瓣膜細(xì)胞體外對(duì)大鼠瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)。我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在主動(dòng)脈鈣化狹窄瓣膜病患者的瓣膜組織中，mTOR下游底物核糖體蛋白S6磷酸化較正常瓣膜組織中明顯升高，說(shuō)明mTOR在CAVS瓣膜組織中異?；罨?。因此，我們推測(cè)mTOR信號(hào)通路活化參與鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄的發(fā)生發(fā)展，其抑制劑雷帕霉素可能通過(guò)抑制瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分化從而阻斷CAVS的發(fā)生發(fā)展。

以往的研究表明，mTOR抑制劑可能通過(guò)間接調(diào)控細(xì)胞的凋亡，影響主動(dòng)脈瓣瓣膜鈣化過(guò)程[15]，但在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率均沒(méi)有明顯差別（P＞0.05），說(shuō)明mTOR抑制劑雷帕霉素不是通過(guò)影響細(xì)胞凋亡來(lái)抑制細(xì)胞鈣化過(guò)程。通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑雷帕霉素抑制細(xì)胞鈣化，是通過(guò)抑制mTOR后，下調(diào)骨形成蛋白-2、骨鈣素、骨調(diào)素和smad同源物1 的表達(dá)水平而引起的，因此細(xì)胞鈣化與mTOR通路被抑制有密切的關(guān)系。瓣膜鈣化與骨組織鈣化類似，為主動(dòng)可調(diào)控過(guò)程，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表型激活向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能為瓣膜鈣化的病理基礎(chǔ)。針對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用基因，進(jìn)行針對(duì)性治療，可能是未來(lái)瓣膜病治療的方向。

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Effect and Mechanism of Rapamycin Inhibiting mTOR on Heart Valve Cell Calcification in Experimental Rats

TAN Yan, WANG Ji-Ye, YI Ren-liang, QIU Jian.
Department of Cardiology, Southern Medical University, Guangzhou (510515), Guangdong, China

Objective: To investigate the effect and mechanism of rapamycin inhibiting mammalian target of RAPA (mTOR) on heart valve cell calcification in experimental rats.

Mammalian target of RAPA; Rapamycin; Heart valve cell; Cell calcification

2015-05-21）

（編輯：曹洪紅）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B031800418）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013J4100117）

510515 廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學(xué)（譚焱、邱?。?、 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 心內(nèi)科（譚焱、 王繼業(yè)、易仁亮、邱健 ）

譚焱 主治醫(yī)師 博士研究生 主要從事冠心病的早期診治和退行性瓣膜病研究 Email:yantan1123@163.com 通訊作者： 邱健

Email: jianqiu81@163.com

R541

A

1000-3614（2015）09-0900-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015. 09.018