劉 鋒，陳志添，邵孔健，薩本仲

（福州市第二醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 350007）

洋地黃毒苷對(duì)肺癌NCI-H446與A549細(xì)胞增殖和周期的影響

劉 鋒，陳志添，邵孔健，薩本仲

（福州市第二醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 350007）

肺癌是全球癌癥導(dǎo)致死亡中最常見(jiàn)的病因，80%的肺癌屬于非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC），而70%的NSCLC確診時(shí)已為晚期，常規(guī)化療藥物在治療肺癌過(guò)程中易產(chǎn)生多藥耐藥性，尋找新靶向藥物治療肺癌愈發(fā)迫切［1］。1999年Haux等［2］對(duì)9 000多例因心臟疾患使用洋地黃毒苷的患者進(jìn)行了藥物療效分析，證實(shí)血液中洋地黃毒苷的較高濃度與血液和泌尿系統(tǒng)腫瘤較低發(fā)生率相關(guān)聯(lián)，洋地黃毒苷血漿濃度小于21 nmol/L的患者腫瘤發(fā)生率是血漿濃度在21～29 nmol/L患者的3.3倍。這提示心臟疾病患者服用洋地黃毒苷后，其正常血漿濃度即可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，洋地黃毒苷可在低于導(dǎo)致心臟毒性的濃度下發(fā)揮抑制腫瘤的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)洋地黃毒苷在體外抑制人肝癌、前列腺癌、白血病等多種腫瘤細(xì)胞增殖［4-6］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。但對(duì)強(qiáng)心苷藥物洋地黃毒苷發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞，采用不同濃度洋地黃毒苷作用于2種細(xì)胞后，探討洋地黃毒苷對(duì)肺癌NCIH446和A549細(xì)胞增殖和周期的影響，從細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)變化初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人肺癌NCI-H446與A549細(xì)胞均購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購(gòu)自天津市灝洋生物制品公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍(lán)（methylthiazolyl-diphenyltetrazolium bromide，MTT）為Sigma公司產(chǎn)品；洋地黃毒苷（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度＞99.9%，用DMSO溶解，配成10μ mol/L貯存液，過(guò)濾后分裝，-20℃ 保存?zhèn)溆茫?；裂解液、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人Cyclin A 1、P21單克隆抗體購(gòu)于Santa C ruz公司；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌NCI-H446與A549細(xì)胞分別接種于體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合率達(dá)到70%～80%進(jìn)行細(xì)胞傳代，先用PBS漂洗細(xì)胞后加入0.25%胰酶（含0.01% EDTA）消化細(xì)胞，再用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將細(xì)胞從瓶壁上洗脫，2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.3 MTT法測(cè)定洋地黃毒苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺癌NCI-H446與A549細(xì)胞，分別用胰酶消化，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5× 104/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μ L。在37 ℃ 、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液180 μL及藥液20 μL。取出用DMSO溶解配制的洋地黃毒苷母液，用培養(yǎng)液稀釋至終濃度為10、20、40、80、160 nmol/L。每個(gè)藥物濃度平行設(shè)4孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中每孔加入20 μL的PRMI-1640培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入5mg/mL的MTT 20 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微型震蕩器上搖勻15 min，待結(jié)晶完全溶解，放入酶標(biāo)儀中測(cè)定490nm波長(zhǎng)處吸光度值。計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定洋地黃毒苷對(duì)細(xì)胞周期的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌NCI-H446與A549細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清PRMI-1640培養(yǎng)液制備濃度為4.0×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶接種5 mL。培養(yǎng)過(guò)夜后，吸棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液及洋地黃毒苷藥液，使其終濃度為10、40、160 nmol/L，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。在給藥后24 h，消化離心收集細(xì)胞，PBS洗2次，細(xì)胞沉淀用70%乙醇懸浮，在-20 ℃冰箱固定24 h。PBS離心洗去乙醇后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（含50mg/L PI，10 mg/L RNaseA，0.1% TritonX-100，0.1%檸檬酸鈉和0.5% NaCl），室溫下避光染色30min，400目篩網(wǎng)過(guò)濾，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，分析細(xì)胞周期（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)630 nm）。

1.5 Western blot 檢測(cè)洋地黃毒苷對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

對(duì)于貼壁的人肺癌NCI-H446與A549細(xì)胞分別先用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次，加入200 μL 細(xì)胞裂解液與苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，終濃度100 μg/mL）混合液，放置于冰上裂解10 min，提取細(xì)胞總蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白定量。加入加樣緩沖液，沸水煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF）膜用含50 mg/mL BSA的TBST室溫封閉3 h，一抗（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min；加入相對(duì)應(yīng)二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10min；用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)Cyclin A1和P21蛋白的表達(dá)情況，置于多功能凝膠成像儀掃描分析印跡條帶光密度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量用目的條帶光密度值與內(nèi)參β-acitn蛋白光密度值的比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 洋地黃毒苷對(duì)人肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞增殖的影響

不同濃度洋地黃毒苷（10、20、40、80和160n mol/L）對(duì)肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖抑制的效果越來(lái)越明顯，呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴(lài)性（P＜0.05）。洋地黃毒苷分別作用肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞48 h后，半數(shù)抑制濃度IC50值依次為61.26 和110.73nmol/L。與A549細(xì)胞相比，NCI-H446細(xì)胞株表現(xiàn)為對(duì)洋地黃毒苷的增殖抑制作用更為敏感。

2.2 洋地黃毒苷對(duì)人肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞周期的影響

洋地黃毒苷對(duì)人肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞周期各時(shí)期DNA含量的影響如圖2和表1所示。洋地黃毒苷能使細(xì)胞周期阻滯于S期。隨著洋地黃毒苷藥物作用濃度的增加，在NCI-H446與A549細(xì)胞中，分別與對(duì)照組相比，G1/G0期細(xì)胞周期比例顯著下降（P＜0.05）， S期細(xì)胞周期比例顯著上升（P＜0.05），而G2/M期細(xì)胞周期變化不明顯（P＞0.05）。

2.3 洋地黃毒苷對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

洋地黃毒苷對(duì)NCI-H446和A549細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin A1和P21表達(dá)的影響如圖3所示：隨著洋地黃毒苷作用濃度的增加，Cyclin A1蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)下降，與對(duì)照組相比，洋地黃毒苷能顯著抑制Cyclin A1的表達(dá)（P＜0.05）；而P21蛋白表達(dá)水平隨著洋地黃毒苷作用濃度的增加而出現(xiàn)上升，與對(duì)照組相比，洋地黃毒苷能顯著提高P21蛋白的表達(dá)（P＜ 0.05）， 并呈濃度依賴(lài)性。

3 討 論

近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心苷類(lèi)固醇（cardiotonic sterroids，CTS）對(duì)人的多種惡性腫瘤如肝癌、前列腺癌、白血病和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞等具有廣譜及高選擇性抗腫瘤活性，而對(duì)人的正常細(xì)胞殺傷作用極弱［3-6］。在Johnasond等［4］的研究中，哇巴因誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞系PC23凋亡的IC50為0.152 μmol/L， 而誘導(dǎo)良性增生的前列腺細(xì)胞系BPH21凋亡的IC50＞100μ mol/L。目前臨床常用的化療藥物大多對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞沒(méi)有顯著的選擇性，而CTS由于對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒效果而使其將有可能發(fā)展成為一類(lèi)重要的抗腫瘤藥物。

洋地黃毒苷作為正性肌力藥物，臨床上用于治療心力衰竭和心房顫動(dòng)已有200多年的歷史，藥理學(xué)背景非常清楚，安全血漿藥物濃度高。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其在安全血漿藥物濃度內(nèi)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。如Hallbook等［7］研究了洋地黃毒苷、地高辛和哇巴因的抗白血病作用，發(fā)現(xiàn)洋地黃毒苷效果最好，特別是對(duì)來(lái)自病人的B-precursor ALL 和T-ALL細(xì)胞非常敏感，IC50值在安全血漿濃度范圍內(nèi)。Lopez-lazaro等［6］研究了洋地黃毒甙和地高辛等對(duì)腎上腺癌細(xì)胞株TK-10等3種腫瘤細(xì)胞株的抑增殖作用，發(fā)現(xiàn)洋地黃毒甙的IC50值在3～33 nmol/L之間，低于其治療慢性心功能障礙的有效血漿濃度。Elbaz等認(rèn)為，洋地黃毒苷及其類(lèi)似物可能將成為一類(lèi)新型的抗腫瘤藥物［8］。

在細(xì)胞周期運(yùn)行中，參與調(diào)控的蛋白主要包括3種：細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）及周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）。其中Cyclin及CDK為正性調(diào)節(jié)蛋白，CKI為負(fù)性調(diào)控蛋白，調(diào)控因子在G1/S、G2/M兩個(gè)關(guān)鍵限制點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控［9］。而幾乎所有腫瘤細(xì)胞都存在細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控，大多數(shù)抗腫瘤藥物可以使細(xì)胞周期阻滯于G1期、S期或G2/M期。研究發(fā)現(xiàn)，CTS也能通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，不可逆的引起細(xì)胞生長(zhǎng)停滯［10］。

Xu等［6］將哇巴因、蟾毒素體外作用于人肝癌HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞，能顯著性抑制細(xì)胞增殖，腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，呈現(xiàn)時(shí)間、濃度依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，肝癌細(xì)胞周期被阻滯于S期。在岳瑤等［11］的研究中，100 nmol/L 布法林作用于人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h，G2/M期細(xì)胞所占比率由對(duì)照組的12.18%增至53.19%，其機(jī)制與周期負(fù)調(diào)控因子p16、p21和pRb蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。也有報(bào)道布法林可引起人卵巢腫瘤細(xì)胞G0/G1周期阻 滯［12］，提示CTS作用于不同的細(xì)胞系可能影響不同控制點(diǎn)造成細(xì)胞周期阻滯。在本實(shí)驗(yàn)中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞周期分布情況，結(jié)果顯示，隨著藥物作用濃度的增加，G1/G0期細(xì)胞所占比例出現(xiàn)下降，而S期細(xì)胞所占比例出現(xiàn)顯著性上升，人肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞發(fā)生S期阻滯。

在細(xì)胞增殖與調(diào)控的過(guò)程中，正性調(diào)節(jié)因子Cyclin A1與負(fù)性調(diào)控因子P21蛋白扮演著重要作用。Cyclin A1屬S期和M期周期蛋白，可分別與CDK2和CDK1結(jié)合。實(shí)驗(yàn)表明，Cyclin A1/CDK2可以激活DNA 聚合酶α，在S期能促進(jìn)DNA合成與染色體復(fù)制，進(jìn)而促使細(xì)胞越過(guò)G2/M期轉(zhuǎn)折點(diǎn)，進(jìn)入M期［13］。P21是一種周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶抑制因子，Cyclin、CDK 和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）是它發(fā)揮生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。當(dāng)DNA損傷或細(xì)胞衰老時(shí)，p53增加并誘導(dǎo)p21轉(zhuǎn)錄，p21與相應(yīng)的CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制蛋白激酶的活性，阻滯細(xì)胞周期［14］。本研究觀察了不同濃度洋地黃毒苷對(duì)周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin A1、P21表達(dá)的影響。結(jié)果表明，隨著藥物作用濃度的增加，正性調(diào)控因子Cyclin A1表達(dá)量明顯下調(diào)，而負(fù)性調(diào)控因子P21蛋白表達(dá)水平明顯上升，并呈濃度依賴(lài)性。

綜上所述，洋地黃毒苷對(duì)人肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞的增殖有顯著性抑制作用，并能明顯影響細(xì)胞周期時(shí)相分布，使NCI-H446和A549細(xì)胞阻滯于S期。初步推斷，對(duì)S期調(diào)控相關(guān)的正性（Cyclin A1）、負(fù)性（P21）調(diào)節(jié)因子表達(dá)水平同時(shí)發(fā)揮干預(yù)效應(yīng)，可能是洋地黃毒苷對(duì)人肺癌NCI-H446和A549細(xì)胞發(fā)揮S期阻滯、影響細(xì)胞增殖的分子機(jī)制之一。

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Effect of digitoxin on proliferation and cell cycle of NCI-H446 and A549 cells

LIU Feng，CHEN Zhitian，SHAO Kongjian，SA Benzhong
（Department of Hepatobiliary Surgery， The Second Hospital of Fuzhou， Fuzhou 350007， Fujian， China）

目的： 探討洋地黃毒苷對(duì)肺癌NCI-H446與A549細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)的NCI-H446與A549細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度（10、20、40、80、160 nmol/L）的洋地黃毒苷處理24、48和72 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)洋地黃毒苷處理細(xì)胞48 h后各組細(xì)胞周期分布，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Cyclin A和P21蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與未經(jīng)洋地黃毒苷處理的對(duì)照組相比，不同濃度（10、20、40、80和160 nmol/L）的洋地黃毒苷均可抑制 NCI-H446與A549細(xì)胞的增殖， 均呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性（P＜0.05），作用48 h后，洋地黃毒苷對(duì)NCI-H446與A549細(xì)胞的IC50值分別為61.26 nmol/L和110.73 nmol/L。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，隨藥物作用濃度增加，G0/G1細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例顯著增加，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot分析結(jié)果顯示，洋地黃毒苷能劑量依賴(lài)性的下調(diào)Cyclin A1蛋白表達(dá)和上調(diào)P21 蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論：洋地黃毒苷可抑制體外培養(yǎng)的肺癌NCI-H446與A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，其機(jī)制可能與細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)有關(guān)。

洋地黃毒苷；肺癌；細(xì)胞周期調(diào)控；細(xì)胞周期蛋白A1

OBJECTIVE:To investigate the effects of digitoxin on proliferation and cell cycle of human lung cancer cell lines NCI-H446 and A549，and to explore its possible mechanisms.METHODS：NCI-H446 and A549 cells were treated with digitoxin at different concentrations（10，20，40，80 and 160 nmol/L）. The effect on proliferation of NCI-H446 and A549 cells were detected by MTT assay. Flow cytometry was used to test the cell cycle distribution of NCIH446 and A549 cells. Protein expressions of Cyclin A1 and P21 in NCI-H446 and A549 cells were evaluated by Western blot.RESULTS：As compared with control group，cell proliferation was inhibited by digitoxin in a dose- and timedependent manner（P＜0.05），the IC50value for digotoxin were 61.26 nmol/L in NCI-H446 and 110.73 nmol/L in A549 at 48 h. After 48 h treatment，the proportion of NCI-H446 and A549 cells in G0/G1 phase was decreased，while the proportion in S phase was increased. Western blot analysis showed that digitoxin could significantly up-regulate the expression of Cyclin A1 and down-regulate the expression of P21 in a dose-dependent way（P＜0.05）.CONCLUSION：Digitoxin could exert an the anti-proliferative effect on NCI-H446 and A549 cells and induce S phase arrest in vitro. The mechanism may be related to the expressions of proteins associated with cell cycle.

digitoxin；lung cancer；regulation of cell cycle；Cyclin A1

R734.2

A

1004-616X（2015）01-0006-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.002

2014-07-14；

2014-10-21

福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011-S-67-4）

作者信息： 劉 鋒，E-mail：508788420@qq.com； Tel：18046041710