黃愛博，洪文旭，葉金波，劉建軍，許 華*

（1. 暨 南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2. 深 圳市疾病預防控制中心，深圳市現(xiàn)代毒理學重點實驗室，廣東 深圳 518055；3. 深 圳市人口和計劃生育科學研究所，廣東 深圳 518040）

三氯乙烯對L-02肝細胞中SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1mRNA表達水平
的影響

黃愛博1，2，洪文旭3，葉金波2，劉建軍2，許 華1，*

（1. 暨 南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2. 深 圳市疾病預防控制中心，深圳市現(xiàn)代毒理學重點實驗室，廣東 深圳 518055；3. 深 圳市人口和計劃生育科學研究所，廣東 深圳 518040）

三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是工業(yè)上廣泛應用的一種有機溶劑，也是一種環(huán)境污染物，可通過呼吸道吸入和皮膚吸收進入人體，主要蓄積于肝臟、腦、心臟等器官，對機體產(chǎn)生危害作用［1-2］。體內(nèi)外試驗證明，TCE及其代謝產(chǎn)物可引起癌變、畸變及免疫毒性作用等，例如TCE對人類腎臟具有致癌作用，同時，TCE可引起人外周血淋巴細胞染色體畸變率的增高。國際癌癥研究署（International Agency for Research on Cancer，IARC）在1995年對TCE致癌性分類作了修改，將其對人類非致癌改為對人類可能致癌。2011年，美國環(huán)保局在針對TCE的最終健康評估報告中，將TCE歸類為人類致癌物。SET蛋白，最早因發(fā)現(xiàn)于患者SE的染色體畸變，被命名為SET蛋白（patient SE translocation，SET），已發(fā)現(xiàn)該蛋白與多種生物學活性相關，在基因表達、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生等方面的功能正越來越受到關注［3-4］。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在L-02肝細胞中，SET蛋白的表達隨TCE濃度的升高而上調(diào)，并證明了SET蛋白在TCE肝細胞毒性作用中起到非常重要的角色。在后續(xù)的研究中，我們應用串聯(lián)純化技術研究SET的相互作用蛋白，在SET復合物中鑒定出翻譯延長因子1A1（E longation factor 1-alpha 1，eEF1A1）、翻譯延長因子1A2（E longation factor 1-alpha 2，eEF1A2）及DNA損傷結合蛋白（damagespecific DNA binding protein 1，DDB1）。進一步，我們發(fā)現(xiàn)TCE處理可以誘發(fā)這些SET的相互作用蛋白在蛋白表達水平、亞細胞定位及與SET的相互作用發(fā)生改變［5］。本研究用人肝細胞（L-02）為模型進行體外研究，觀察TCE染毒對L-02肝細胞中的這些SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1的mRNA表達水平的變化，為深入了解TCE致肝細胞毒性作用機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與試劑 人L-02肝細胞株，來源于中國科學院上海細胞生物學研究所；1640培養(yǎng)基、EDTA-胰蛋白酶、雙抗（青霉素 鏈霉素）和胎牛血清（FBS）均購自美國Gibco公司；RNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司；SYBRPremix Ex TaqTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自日本TaKaRa公司；CCK-8購自日本Dojindo Molecular Technologies公司，三氯乙烯（ACS reagent，≥99.5%）、尿素（Urea）等其他試劑均購自美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器 FORMA 3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Forma公司；GS-15R臺式冷凍離心機，美國Beckman公司；5417R型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Mx4000型實時熒光定量PCR儀，美國Shratagene公司；凝膠成像系統(tǒng)，英國UVI公司；Infinite M1000酶標儀，美國TECAN Group Ltd公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞毒性試驗 L-02細胞接種于含10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RMPI-1640完全培養(yǎng)基上，置37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。采用活細胞計數(shù)試劑盒進行細胞毒性檢測，接種細胞懸液100 μL于96孔板內(nèi)（每孔 8 000個細胞），預先置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細胞匯合度達70%～80%時，按下列分組處理：①DMSO溶劑對照組為0.5% 二甲基亞砜（DMSO）+ddH2O+無血清培養(yǎng)基。②TCE染毒組（分別為1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L TCE）+0.5% DMSO +ddH2O+ 無血清培養(yǎng)基。每組設6個復孔，24 h后，在每孔內(nèi)加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450nm波長處用Infinite M 1000酶標儀檢測吸光度值D（450），細胞毒性檢測至少重復3次。

式中，D（450）染毒為具有細胞、CCK8溶液和TCE的孔的吸光度，D（450）空白為具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細胞的孔的吸光度，D（450）DMSO為 具有細胞、CCK8溶液和DMSO而沒有TCE的孔的吸光度。

1.2.2 生物信息學分析 利用PICASSO（protein i nteraction confidence assessment system with multiple sources）（http://61.50.138.118/PICASSO/） 分析DDB1、eEF1A1及eEF1A2蛋白與SET蛋白的相關性［6］。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測 將不同濃度的TCE（1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L）暴露處理L-02細胞，以DMSO為溶劑對照，每組設3個平行樣本。24 h后，對eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達水平進行實時熒光定量PCR測定。采用RNeasy Mini Kit試劑提取總RNA，用試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫eEF1A1、eEF1A2、DDB1和GAPDH基因序列，設計各mRNA引物，具體序列見表1。在對各目的基因進行相對定量之前，先梯度稀釋cDNA模板進行標準曲線和熔解曲線分析，以確定熒光定量PCR的最佳反應條件及反應體系，然后采用比較閾值法（threshold cycles，Ct），以看家基因GAPDH為內(nèi)參照，相對定量處理組樣品內(nèi)各目的基因的表達水平。反應體系為SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL，50×ROX Reference Dyell 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL， cDNA 2μL，ddH2O 8 μL。擴增產(chǎn)物的反應程序為：95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以熒光定量PCR儀所附帶的Mx 4000軟件自動計算并分析結果，熒光定量PCR 測 定至少重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SSPS 13.0軟件進行對細胞毒性試驗的吸光度相對值以及eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達的相對量進行單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 TCE對L-02細胞的毒性效應

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)染毒24 h后，TCE針對L-02肝細胞的IC50為16 mmol/L［7］。本研究選擇了IC50的1/2作為最高染毒濃度。細胞毒性實驗表明，與對照組比較，TCE染毒致使L-02細胞的活力顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。具體結果見圖1，所有的濃度均用于后續(xù)mRNA表達水平的分析中。

2.2 SET與eEF1A1、eEF1A2和DDB1蛋白的相關性判斷

PICASSO得分是評價兩個蛋白生物相關性的生物信息學指標，如果PICASSO的得分超過2.0，認為兩個蛋白具有相互作用。結果，eEF1A1、eEF1A2和DDB1蛋白與SET蛋白相關性的得分分別為4.6、4.6和8.8，認為這3個蛋白與SET均具有相互作用。

2.3 TCE對L-02細胞內(nèi)eEF1A1、eEF1A2和DDB1mRNA表達水平的影響

2.3.1 RNA的純度、標準曲線及熔解曲線分析 總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定，其D（260）/D（280）的比值在1.80～2.00之間，說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。瓊脂糖凝膠電泳顯示，28 S和18 S條帶清晰可見，并且28 S條帶亮度約為18 S的2倍，說明所提取的總RNA無明顯降解，完整性良好。

通過標準曲線分析可知，GAPDH、eEF1A1、eEF1A2和DDB1基因的擴增效率均介于90%～110%之間，且相關系數(shù)均大于0.99，說明整個PCR擴增系統(tǒng)工作良好，對目的基因的擴增效率接近，可以開展后續(xù)的相對定量分析。根據(jù)熔解曲線分析結果（圖2）可知，GAPDH、eEF1A1、eEF1A2和DDB1基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線峰均為第一峰形，未見其他峰值，峰的形狀也較為銳利，提示各基因的熔解溫度均一，擴增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎進行定量是可靠的。

2.3.2 eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達水平的變化 不同濃度TCE（1.0、2.0、4.0和8.0 mmol/L）處理L-02細胞后，eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達水平的變化見圖3。結果可見，eEF1A1 mRNA表達水平在2.0 mmol/L以上TCE作用后顯著增加（P＜0.05），eEF1A2和DDB1 mRNA表達水平出現(xiàn)隨著TCE濃度的增加先升高后降低的情況（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討 論

SET是一種具有多種生物功能的重要的細胞因子，又名模板活化因子1（template activating factor 1，TAF1），參與基因表達調(diào)控、翻譯后修飾和細胞凋亡等多個生物學過程。一些消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病伴有SET表達或亞細胞定位異常，提示SET與這些疾病的發(fā)生發(fā)展相關。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)TCE可以誘發(fā)SET在L-02細胞中表達上調(diào)，沉默SET的表達可以降低由TCE引起的肝細胞毒性，證明SET在TCE誘導的肝毒性作用中扮演重要角色。我們通過串聯(lián)親和純化和質(zhì)譜鑒定方法分析SET的相互作用蛋白，在SET復合物中鑒定出eEF1A1、eEF1A2及DDB1，生物信息學分析進一步證明了eEF1A1、eEF1A2、DDB1和SET的相互作用。我們還進一步證明了TCE暴露可以誘發(fā)SET相互作用蛋白eEF1A1和eEF1A2的亞細胞定位及表達水平發(fā)生明顯改變［8］。

mRNA在蛋白轉(zhuǎn)錄過程起到非常關鍵的作用，因此研究mRNA的表達水平，對進一步理解TCE誘導蛋白表達水平的改變具有重要的意義。針對前期研究結果，在已經(jīng)研究了TCE對L-02肝細胞中eEF1A1、 eEF1A2和DDB1蛋白表達水平的影響基礎上，我們主要探索TCE對eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達水平的影響。在本實驗中，通過研究不同濃度TCE對eEF1A1、 eEF1A2和DDB1 mRNA表達的影響以及分析TCE對L-02細胞的增殖毒性作用，我們發(fā)現(xiàn)，TCE暴露處理L-02細胞后可明顯影響eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA的表達并且細胞活性發(fā)生顯著變化。其中，L-02經(jīng)過1.0 mmol/L TCE暴露后，DDB1 mRNA的表達水平顯著增高，而經(jīng)（2.0、4.0和8.0mmol/L）TCE處理后，表達水平呈下降趨勢。DDB1蛋白廣泛參與細胞周期調(diào)控、組織器官發(fā)育分化、DNA復制、DNA損傷與修復以及基因表達的表現(xiàn)遺傳調(diào)控等重要的生命活動［9］。因此推斷可能是因低濃度TCE染毒L-02后，啟動修復保護機制，DDB1 mRNA表達水平升高。但是隨著TCE濃度的升高，喪失其保護機制，mRNA表達水平降低。eEF1A1 mRNA的表達水平隨著TCE濃度的升高呈上升趨勢。eEF1A2 mRNA表達水平與TCE處理24 h后細胞活性的變化趨勢接近，即1.0 mmol/L TCE處理，表達水平上調(diào)，2.0、4.0 和8.0 mmol/L TCE處理，表達水平呈下調(diào)趨勢。大量的蛋白質(zhì)組學研究已表明，eEF1A可與細胞內(nèi)許多分子相互作用，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)重要生理過程和機制。eEF1A1具有促進凋亡的作用，而eEF1A2則具有抗凋亡的活性［10］。eEF1A2 mRNA表達情況可能是由于低濃度TCE暴露處理對細胞產(chǎn)生凋亡作用，而eEF1A2具有抗凋亡作用，導致其mRNA表達水平上升，但隨著TCE濃度的增加，其抗凋亡的補償機制會逐漸減弱，致使其mRNA表達水平下降。而eEF1A1 mRNA表達水平的升高則可能是細胞為對抗TCE產(chǎn)生的毒性作用，通過提高eEF1A2 mRNA的表達水平對損傷進行調(diào)節(jié)修復。

本研究結果觀察到TCE處理后可以引起SET及其相關蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1在mRNA表達水平的異常。且SET缺陷可以有效減緩TCE對L-02細胞的毒性作用，以及對細胞周期與凋亡的影響［7］。 然而，eEF1A1、 eEF1A2和DDB1如果通過改變表達水平參與到由SET介導的TCE的毒性作用，需要在后續(xù)工作中通過觀察SET缺陷細胞株中，TCE染毒下生物學效應及這些基因在表達水平的變化，進一步明確TCE毒性作用與SET和SET相關蛋白的內(nèi)在聯(lián)系。

［1］ Liu J，Huang H，Xing X，et al. Comparative proteomicanalysis on human L-02 liver cells treated with varying concentrations o f t richloroethylene［J］. T oxicol I nd H ealth，2007，23（1）：91-101.

［2］ Hong WX，Liu W，Zhang YF，et al. Identification of serum biomarkers for occupational medicamentosa-like dermatitis induced by trichloroethylene using mass spectrometry［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2013，273（1）：121-129.

［3］ Zhang P，Compagnone NA，F(xiàn)iore C，et al. Developmental gonadal expression of the transcription factor SET and its target gene，P450c17 （17alpha-hydroxylase/c17，20 lyase）［J］. DNA Cell Biol，2001，20（10）：613-624.

［4］ Qu D，Zhang Y，Ma J，et al. The nuclear localization of SET mediated by impalpha3/impbeta attenuates its cytosolic toxicity in neurons［J］. J Neurochem，2007，103（1）：408-422.

［5］ HONG WX，YE JB，CHEN MT，et al. Trichloroethylene induces biphasic concentration-dependent changes in cell proliferation and the expression of SET-associated proteins in human hepatic L-02 cells［J］. Biomed Environ Sci，2013，26（7）：618-621.

［6］ Li D，Liu W，Liu Z，et al. PRINCESS，a protein interaction confidence evaluation system with multiple data sources［J］. Mol Cell Proteomics，2008，7（6）：1043-1052.

［7］ Yang X，Jiang Y，Li J，et al. Lentivirus-mediated silencing of I2PP2A through RNA interference attenuates trichloroethyleneinduced cytotoxicity in human hepatic L-02 cells［J］. Toxicol Lett，2012，209（3）：232-238.

［8］ Hong Wenxu，Yang Liang，Chen Moutong，et al. Proteomic analysis of trichloroe-thylene-induced alterations in expression，distribution，and interactions of SET/TAF-Iα and two SET/TAF- Iα-binding proteins，eEF1A1 and eEF1A2，in hepatic L-02 cells［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2012，263（4）：259-272.

［9］ Lee JH，Yoon HJ，Terzaghi W，et al. DWA1 and DWA2，two Arabidopsis DWD protein components of CUL4-based E3ligases，act together as negative regulators in ABA signal transduction［J］. Plant Cell，2010，22（11）：1716-1732.

［10］ Wijeweera P，Arnason JT，Koszycki D，et al.Evaluation of anx-iolytic properties of Gotukola-（centella asiatica） extracts and

Effects of trichloroethylene on mRNA expression of SET-associated proteins including eEF1A1，eEF1A2 and DDB1in L-02 cells

HUANG Aibo1，2，HONG Wenxu3，YE Jinbo2，LIU Jianjun2，XU Hua1，*
（1. College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632；2. Key Laboratory of Modern Toxicology of Shenzhen， Shenzhen Center for Disease Control and Prevention， Shenzhen 518055；3. Shenzhen Research Institute of Population and Family Planning， Shenzhen 518040， Guangdong， China）

目的： 探討人L-02肝細胞經(jīng)三氯乙烯（TCE）染毒后SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達水平的變化。方法：取對數(shù)生長期的L-02肝細胞，暴露于不同濃度TCE（1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L）中，以DMSO為溶劑對照。24 h后，采用實時熒光定量PCR檢測eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達水平。結果：與對照組相比，不同濃度的TCE均能夠使L-02肝細胞eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表達水平發(fā)生明顯變化。其中，DDB1和eEF1A2 mRNA表達水平在低濃度（1.0 mmol/L）TCE暴露下顯著升高，而隨著TCE濃度的升高其mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。eEF1A1 mRNA表達水平隨著TCE濃度的增加而升高（P＜0.05）。結論：TCE染毒可誘發(fā)L-02肝細胞中SET相互作用蛋白的mRNA表達水平發(fā)生改變。

三氯乙烯；細胞毒性；SET相互作用蛋白；mRNA

OBJECTIVE:To research the effects of trichloroethylene on the RNA expressions of SET-associated proteins including eEF1A1，eEF1A2 and DDB1 in L-02 cells.METHODS：L-02 cells，being in the logarithmic growth phase，were treated with different concentrations （1.0，2.0，4.0，8.0 mmol/L） of trichloroethylene for 24 h， and DMSO were used as control. The mRNA levels of eEF1A1， eEF1A2 and DDB1 were analyzed with qPCR.RESULTS：The results showed that mRNA levels of DDB1 and eEF1A2 were significantly up-regulated under low concentration of trichloroethylene（1.0 mmol/L） and were significantly down-regulated with increasing concentrations of trichloroethylene. The mRNA levels of eEF1A1 were significantly up-regulated with increasing of trichloroethylene concentration.CONCLUSION：Exposure of trichloroethylene c ould a lter m RNA e xpression o f S ET-associated p roteins i n L -02c ells.

trichloroethylene；cytotoxicity；SET-associated proteins；mRNA

R994.6

A

1004-616X（2015）01-0064-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.014

2014-05-28；

2014-10-29

國家自然科學基金（21102094）；廣東省醫(yī)學科研基金（A2014659 ）； 深圳市科技研究計劃項目（JCYJ20130329161137543，GJH20120628151305456）；深圳市重點實驗室提升項目（ZDSY2012061508 580488 9）

作者信息：黃愛博，E-mail：huangaibo@163.com。*通信作者，許 華， Email：h uax_mail@126.com