劉穎婷，張玉皓

[云南省第一人民醫(yī)院（昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院）牙周種植科，云南 昆明 650032]

·論著·

水溶蜂膠對(duì)人牙髓成纖維細(xì)胞的毒性作用研究*

劉穎婷，張玉皓

[云南省第一人民醫(yī)院（昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院）牙周種植科，云南 昆明 650032]

目的探討水溶性蜂膠對(duì)人牙髓成纖維細(xì)胞的毒性作用，為蜂膠的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法用一種新的四唑類(lèi)化合物MTS比色法檢測(cè)人牙髓細(xì)胞在不同濃度的蜂膠、氫氧化鈣溶液中體外培養(yǎng)48 h后細(xì)胞的相對(duì)增殖率(RGR)，用5級(jí)毒性分類(lèi)法評(píng)級(jí)。結(jié)果1 g/L及以下濃度的水溶蜂膠組對(duì)人牙髓成纖維細(xì)胞的毒性級(jí)別在2以下。結(jié)論1 g/L及以下濃度的水溶蜂膠液對(duì)人牙髓成纖維細(xì)胞的毒性作用較小，是治療牙髓疾病的安全藥物。

水溶蜂膠；人牙髓成纖維細(xì)胞；細(xì)胞毒性

蜂膠是蜜蜂采集膠源植物的芽孢滲出物中的天然樹(shù)脂，混合其上顎腺的分泌物，花粉及蜂蠟形成的褐色膠狀物質(zhì)，是天然蜂產(chǎn)品之一。它含有多種生理活性物質(zhì)，具有廣泛的生理和藥理作用，更是天然的抗生素，具有較強(qiáng)的抗菌性能,目前在根管消毒，牙周炎和口腔黏膜疾病的治療領(lǐng)域有廣泛的研究和應(yīng)用。本研究采用最新的一種檢測(cè)細(xì)胞毒性的四唑類(lèi)化合物MTS[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfopheny）-2H-tetrazolium，inner salt]比色方法檢測(cè)國(guó)產(chǎn)水溶性蜂膠對(duì)人牙髓成纖維細(xì)胞的毒性作用，探討蜂膠在牙髓治療領(lǐng)域的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

水溶性固體蜂膠：上海辰蜂生物技術(shù)公司提供，氫氧化鈣粉：上海二醫(yī)張江生物材料有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone）、澳洲胎牛血清（普飛）、0.5 g/L胰蛋白酶（Hyclone）和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均由諾貝生物科技有限公司提供。MTS（普洛麥格生物技術(shù)有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Therm-Fisher Forma 3111），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司），高速低溫離心機(jī)（日本HITACHI集團(tuán)CR22G），小鼠抗人波形絲蛋白單克隆抗體（福州邁新公司），小鼠抗人角蛋白單克隆抗體（福州邁新公司），酶標(biāo)儀（ST360，上?？苹瘜?shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）。

1.3 人牙髓成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代

牙髓標(biāo)本取自昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院頜面外科門(mén)診，取臨床青少年因正畸減數(shù)需要拔除的健康恒前磨牙4～5顆，立即置入含有3%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中帶回。在科室用碘酊、乙醇依次消毒牙冠，無(wú)菌高速渦輪機(jī)頭除去表面牙周組織，裂鉆環(huán)形切割牙頸部至近髓后立即置入培養(yǎng)液中帶到實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，骨鑿劈開(kāi)牙冠，用無(wú)菌的K銼謹(jǐn)慎從根管中抽出牙髓迅速剪去根尖1/3，置入浸有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌眼科剪剪成0.5 mm3組織塊，然后用DMEM培養(yǎng)液沖洗3次，探針將組織塊挑入培養(yǎng)瓶底部，以0.5 mm的間距均勻鋪置，對(duì)側(cè)壁滴入培養(yǎng)液，瓶底向上置入二氧化碳培養(yǎng)箱中，靜置4 h貼壁后翻轉(zhuǎn)，再加入適量培養(yǎng)液靜置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，組織塊未游出細(xì)胞前每周換液一次，細(xì)胞游出后每3天換液一次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞游出及生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞達(dá)到匯合點(diǎn)時(shí)，用0.5 g/L的胰酶消化，按1∶2傳代，原代培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞傳至第4代后，免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞的組織來(lái)源。細(xì)胞繼續(xù)傳代至第5代，取生長(zhǎng)良好的第5代牙髓細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞接種備用。

1.4 蜂膠水溶劑的配制

取國(guó)產(chǎn)水溶蜂膠用三蒸水將其配成1 g/10 ml的蜂膠溶液，0.2μm的無(wú)菌過(guò)濾器濾后再用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成4、2、1、0.6和0.2 g/L 5個(gè)濃度備用。對(duì)照的氫氧化鈣溶液配制：將200 mg氫氧化鈣干粉劑溶于50 ml的三蒸水中，3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，0.2μm的無(wú)菌過(guò)濾器濾后用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成10%、8%、4%、1%4個(gè)濃度備用。

1.5 人牙髓細(xì)胞相對(duì)增殖率的測(cè)定

Cell Titer 96@A Queous One Solution Cell Proliferation Assay（a）是一種用比色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中的活細(xì)胞數(shù)量的新的檢測(cè)試劑，此試劑含有一個(gè)新型的四唑化合物MTS和一種電子偶聯(lián)劑PES。PES具有增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，這使它可與MTS混合形成穩(wěn)定的溶液，是方便的單溶液模式。MTS被細(xì)胞生物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶解于培養(yǎng)基中，這種轉(zhuǎn)換是由代謝活躍的細(xì)胞中的脫氫酶產(chǎn)生的還原型煙酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸（NADPH）或煙酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸（NADH）的作用下完成的。檢測(cè)時(shí)，只需將少量的Cell Titer 96@AQueous One Solution Reagent試劑直接加入培養(yǎng)板孔的培養(yǎng)基中，孵育1～4 h，然后用酶標(biāo)儀讀取490 nm的吸光度值，操作步驟比MTT更少，更方便快捷。在490 nm處檢測(cè)到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)成正比。

本實(shí)驗(yàn)采用MTS比色法，檢測(cè)不同濃度的蜂膠水溶劑和氫氧化鈣溶液作用于人牙髓細(xì)胞后的吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR=實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值×100%，根據(jù)RGR換算細(xì)胞毒性的級(jí)別。

具體方法如下：取生長(zhǎng)良好的第5代牙髓細(xì)胞，0.5 g/L胰蛋白酶消化，離心后用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104/ml，接種于96孔板，每孔100μl。放置到37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察大多數(shù)細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)。棄去孔內(nèi)液體及不貼壁的細(xì)胞，將各稀釋藥液加入96孔板中，每種加5孔，每孔100μl；陰性對(duì)照組加含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每孔100μl。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)蜂膠的顏色也對(duì)吸光度產(chǎn)生一定的影響，因此在每組蜂膠實(shí)驗(yàn)組的上方還設(shè)一組不含細(xì)胞的蜂膠液對(duì)比孔，在該對(duì)照孔中加對(duì)應(yīng)濃度的蜂膠液100μl。用該蜂膠組的OD值減去該孔的OD值以排除蜂膠色度對(duì)實(shí)驗(yàn)組吸光度的影響，96孔板置37℃，體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入20μl配好的MTS試劑，再放回培養(yǎng)箱中放置4 h取出，在酶標(biāo)儀上振蕩30 s，于490 mm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，每種濃度孔的OD值取平均值。計(jì)算細(xì)胞RGR，根據(jù)細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1），用RGR值換算細(xì)胞毒性級(jí)。

表1 細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果組間進(jìn)行方差分析，對(duì)蜂膠與氫氧化鈣總體細(xì)胞毒性進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

本研究用傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法，12～15 d內(nèi)可見(jiàn)有的組織塊周邊有少量梭形細(xì)胞長(zhǎng)出，2～3 d后細(xì)胞迅速擴(kuò)增，約18～20 d左右細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底。按1∶2傳代，2～3 d可傳一代。原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞胞體呈長(zhǎng)梭形，星形胞體細(xì)長(zhǎng)，胞漿豐富，核位于中央，排列緊密多呈近于平行的束狀，細(xì)胞界限清楚，呈“漩渦狀”。見(jiàn)圖1。

圖1 牙髓成纖維細(xì)胞圖（×200）

2.2 細(xì)胞來(lái)源鑒定

取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人牙髓細(xì)胞爬片，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行波形絲蛋白，角蛋白免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察。牙髓成纖維細(xì)胞呈典型的成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞漿內(nèi)波形絲蛋白染色為陽(yáng)性，角蛋白染色呈陰性。波形絲蛋白是成纖維細(xì)胞的特征性蛋白，而角蛋白是上皮細(xì)胞的特征性蛋白，因此證實(shí)培養(yǎng)的是中胚層來(lái)源的人牙髓成纖維細(xì)胞。見(jiàn)圖2、3。

圖2 波形絲蛋白染色陽(yáng)性（×100）

圖3 角蛋白染色陰性（×100）

2.3 細(xì)胞相對(duì)增殖率結(jié)果及毒性分級(jí)

第5代人牙髓成纖維細(xì)胞以2×104/ml，接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后，各孔細(xì)胞密度均勻。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)正常，胞體呈長(zhǎng)梭形。加樣48 h后，陰性對(duì)照組細(xì)胞密度增加，形態(tài)正常；加藥物的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，低濃度的各孔中細(xì)胞形態(tài)基本正常，隨著濃度的增加，培養(yǎng)孔中出現(xiàn)變性死亡細(xì)胞，部分細(xì)胞漂浮起來(lái)。各孔加入MTS試劑后，放回培養(yǎng)箱中孵育4 h，取出后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度。不同濃度蜂膠水溶液與氫氧化鈣溶液對(duì)人牙髓成纖維細(xì)胞作用48 h后的吸光度值、換算的細(xì)胞相對(duì)增殖率及毒性級(jí)別如下，見(jiàn)表2。

表2 蜂膠和氫氧化鈣溶液對(duì)人牙髓成纖維細(xì)胞作用48 h后的OD值及毒性級(jí)別結(jié)果

對(duì)蜂膠組各濃度OD值進(jìn)行方差分析，F(xiàn)=30.618，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為不同濃度下的蜂膠OD值不同。對(duì)氫氧化鈣組各濃度OD值進(jìn)行方差分析，F(xiàn)=44.275，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為不同濃度下的氫氧化鈣OD值不同。對(duì)蜂膠和氫氧化鈣總體細(xì)胞毒性進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=0.882，P＜0.386，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明蜂膠和氫氧化鈣總體細(xì)胞毒性無(wú)差異。

3 討論

由于牙髓組織具有形成牙本質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)硬組織的功能，對(duì)外來(lái)刺激能產(chǎn)生一系列防御性反應(yīng)，因此保存活髓具有十分重要的意義。理想的蓋髓材料要有良好的封閉性，能有效地隔絕外界刺激，殺滅細(xì)菌，消除牙髓炎癥，保護(hù)牙髓。誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞形成修復(fù)性牙本質(zhì)橋，并能提供牙髓修復(fù)，牙本質(zhì)生物礦化所需要的微量元素及適宜的微環(huán)境[1]。

氫氧化鈣是目前應(yīng)用最廣泛的蓋髓材料，它能有效地促進(jìn)牙髓細(xì)胞分化，形成修復(fù)性牙本質(zhì)封閉露髓孔，并且其強(qiáng)堿性也具有一定的抑菌和殺菌作用。但臨床應(yīng)用也發(fā)現(xiàn)它有明顯的缺陷，例如它會(huì)引起接觸部位牙髓炎癥壞死；會(huì)發(fā)生牙髓退行性改變，出現(xiàn)根管內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化，鈣化蔓延到整個(gè)根管，出現(xiàn)堵塞或牙內(nèi)吸收等[2]。為進(jìn)一步改善性能，有研究試圖用氫氧化鈣復(fù)合其他材料或激光處理的方法提高治療效果[3-4]。也有學(xué)者在探索新的蓋髓材料，目前有礦化三氧化物凝聚體（MTA）；牙本質(zhì)粘接劑；磷酸鈣類(lèi)材料(羥基磷灰石、磷酸鈣骨水泥，陶瓷化骨粉等)；生物活性材料（骨形成蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、牙本質(zhì)膠原蛋白、富血小板血漿等）；抑菌類(lèi)材料（各類(lèi)抗生素）；中藥類(lèi)（黃芩苷等）[5-11]。但各種材料各有優(yōu)缺點(diǎn)：如磷酸鈣類(lèi)材料無(wú)抗菌性；生物活性材料易被破壞；粘接劑密封性好，但有刺激性等等，單一的材料均不能達(dá)到理想的蓋髓材料應(yīng)具備的性能。進(jìn)一步探索具有生物誘導(dǎo)活性，良好的生物相容性，消炎殺菌及物理機(jī)械性能都良好的復(fù)合蓋髓材料，提高活髓保存的成功率是該領(lǐng)域的研究方向。由于蓋髓治療常因微滲漏或牙本質(zhì)深層藏存的細(xì)菌感染而失敗，因此蓋髓劑能否殺滅露髓孔內(nèi)殘余細(xì)菌，消除牙髓炎癥有重要的意義。因此有研究者試圖復(fù)合幾種材料的性能，如束紅蕾[12]等把甲硝唑，紅霉素，克林霉素加入到磷酸鈣骨水泥，陶瓷化骨粉中用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的蓋髓，實(shí)驗(yàn)研究也取得了較好的效果。

近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越熱衷于綠色天然藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，蜂膠含有多種生理活性物質(zhì)，具有廣泛的生理和藥理作用，臨床上多用于治療潰瘍、燒傷、糖尿病及心血管病等[13]。最重要的是蜂膠的強(qiáng)抗菌功能是其他天然物質(zhì)無(wú)可比擬的，由于蜂膠含有大量的黃酮類(lèi)及芳香酸、脂肪酸及烯類(lèi)等多種化合物，它具有廣譜抗菌作用，能抑制多種細(xì)菌和病毒，有研究證實(shí)1%～10%的蜂膠對(duì)真菌和霉菌都有抑制作用[14]。在口腔領(lǐng)域關(guān)于蜂膠的研究也很廣泛，國(guó)內(nèi)已有研究表明，蜂膠的生物安全性很好[15]。蜂膠對(duì)齲病、牙周病和感染根管的致病菌有明顯的殺滅及抑制作用，已有研究將其引入齲病、牙周病及感染根管消毒治療領(lǐng)域[16-17]。國(guó)外有研究還發(fā)現(xiàn)，蜂膠能有效殺滅對(duì)氫氧化鈣消毒耐受的細(xì)菌，能有效殺滅難治性根尖周炎根管內(nèi)的糞腸球菌[18-19]。蜂膠的消炎鎮(zhèn)痛、表面麻醉、促進(jìn)增生、改善微循環(huán)的作用使其對(duì)復(fù)發(fā)性口瘡、扁平苔蘚等口腔黏膜病也有較好的療效[20]，已有蜂膠的牙膏，漱口水、口腔潰瘍貼膜生產(chǎn)用于口腔臨床。對(duì)于牙髓治療領(lǐng)域，由于蜂膠含醛，有凝固蛋白的作用，國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道用蜂膠復(fù)合普魯卡因等制成的復(fù)方蜂膠失和劑可以失和牙髓[21]。國(guó)外學(xué)者研究報(bào)道，較低濃度的蜂膠醇溶劑在保持有效的殺菌效力的同時(shí)對(duì)人牙髓、牙周及牙齦成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于氫氧化鈣，生物安全性好，用于蓋髓治療能誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成[22-24]，但尚無(wú)進(jìn)一步深入的研究報(bào)道。國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)水溶蜂膠對(duì)人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞毒性及蜂膠用于蓋髓治療的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

為進(jìn)一步明確蜂膠在蓋髓治療中的性能，研究能否利用蜂膠的天然強(qiáng)抗菌性，豐富的物質(zhì)含量和改善微循環(huán)、促進(jìn)增生等多種生物活性消除暴露牙髓的炎癥，從而誘導(dǎo)牙髓—牙本質(zhì)復(fù)合體反應(yīng)形成修復(fù)性牙本質(zhì)，筆者采用國(guó)產(chǎn)水溶蜂膠做人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。由于以前多數(shù)研究為蜂膠乙醇提取液，對(duì)蜂膠水提取液的研究非常少。在本實(shí)驗(yàn)中，為降低對(duì)牙髓的刺激，并填補(bǔ)蜂膠水溶劑用于蓋髓治療的研究空白，采用國(guó)產(chǎn)水溶蜂膠制備不同濃度的蜂膠水溶劑。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞，用MTS比色法檢測(cè)不同濃度的蜂膠水溶劑作用于人牙髓細(xì)胞后的OD值。計(jì)算細(xì)胞RGR，根據(jù)RGR換算細(xì)胞毒性的級(jí)別。觀察不同濃度的蜂膠水溶劑對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖的影響，并對(duì)其細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)級(jí)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水溶蜂膠及氫氧化鈣對(duì)人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞毒性各濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)蜂膠與氫氧化鈣總體細(xì)胞毒性進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明蜂膠和氫氧化鈣總體細(xì)胞毒性無(wú)差異。1 g/L及以下國(guó)產(chǎn)水溶蜂膠溶液對(duì)人牙髓細(xì)胞的毒性在2以下，具有低毒性，可考慮用于臨床治療。

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（張蕾 編輯）

Evaluation on cytotoxicity of water-solubile propolis to human dental pulp fibroblasts*

Ying-ting LIU,Yu-hao ZHANG
[Departmenent of Periodontology and Implant Dentistry,the First People's Hospital of Yunnan Province(Kunhua Hospital Affiliated to Kunming University of Sicence and Technology),Kunming,Yunan 650032,P.R.China)

【Objective】To evaluate the cytotoxicity of water-solubile propolis to human dental pulp fibroblasts and provide information for local application of propolis to dental diseases.【Methods】Human dental pulp fibroblasts were incubated in propolis and calcium hydroxide solution at different concentrations for 48 hours.The relative growth rate(RGR)was examined by a new method of MTS assay and cytotoxicity was classified by the five-class method.【Results】The cytotoxicity of 1 g/L and lower-concentration water-solubile propolis solution to human dental pulp fibroblasts was below the second class.【Conclusion】Water-solubile propolis solution at 1 g/L and lower concentration has weak cytotoxicity for human dental pulp fibroblasts and it is safe for local application to dental pulp diseases.

water-solubile propolis；human dental pulp fibroblast；cytotoxicity

R781.3

A

1005-8982（2015）30-0018-05

2015-03-03

云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（No：2011FZ277）