劉曉麗，劉科，朱敏俠

（1.西藏民族大學(xué)生命科學(xué)基礎(chǔ)實驗室，陜西 咸陽 712082；2.西藏軍區(qū)總醫(yī)院普通外科，西藏 拉薩 850000）

·臨床論著·

高原藏族胃癌患者缺氧誘導(dǎo)因子-1a及缺氧誘導(dǎo)因子-2a表達水平及其作用機制的研究*

劉曉麗1，劉科2，朱敏俠1

（1.西藏民族大學(xué)生命科學(xué)基礎(chǔ)實驗室，陜西 咸陽 712082；2.西藏軍區(qū)總醫(yī)院普通外科，西藏 拉薩 850000）

目的研究缺氧誘導(dǎo)因子-1a（HIF-1a）及缺氧誘導(dǎo)因子-2a（HIF-2a）在高原藏族胃癌患者組織中的表達水平，并探索兩者對下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）影響的分子機制。方法采用實時定量PCR的方法對比胃癌患者癌組織及癌旁組織中HIF-1a、HIF-2a的差異表達，并探討兩者與臨床分期的相關(guān)性。對胃腺癌細胞SGC7901中HIF-1a、HIF-2a分別進行小RNA干擾后，利用RT-PCR法檢測VEGF的表達水平以及利用CCK-8方法檢測細胞的增殖情況。結(jié)果胃癌患者組織中表達HIF-1a、HIF-2a的mRNA水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；胃癌患者組織中表達HIF-1a的mRNA水平與胃癌的臨床分期顯著正相關(guān)（P＜0.05），而胃癌組織中HIF-2a的mRNA水平與胃癌的臨床分期無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；胃癌細胞中低表達HIF-1a后，VEGF的表達水平以及細胞的增殖水平均顯著降低（P＜0.05），而低表達HIF-2a后，VEGF的mRNA表達水平以及細胞的增殖水平均無顯著變化（P＞0.05）。結(jié)論HIF-1a對于高原藏族胃癌的形成具有促進作用，可能與促進VEGF表達及癌細胞增殖功能密切相關(guān)。

HIF-1a；HIF-2a；胃癌；VEGF

胃癌（gastric cancer）是消化系統(tǒng)高發(fā)病率的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，且顯著高于前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等其他實體瘤。胃癌因早期隱匿性強，約60%～70%患者確診即為中晚期，而這些患者外科手術(shù)和抗腫瘤治療未能明顯地改善胃癌的不良預(yù)后，5年生存率僅為5%～17%[1]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是目前胃癌治療方面急需解決的臨床難題。高原地區(qū)也是我國胃癌高發(fā)地區(qū)之一，其胃癌病死率居全國之首，達40.62/10萬[2]。藏族是在高原生活的特有少數(shù)民族，其機體在高原環(huán)境適應(yīng)過程中形成了特有的免疫體系。低氧既是高原環(huán)境下的一種重要的環(huán)境因子，也是一種主要的刺激原，機體對低氧的應(yīng)激反應(yīng)異常是導(dǎo)致各種高原適應(yīng)不全和高原疾病的重要原因。研究認為，低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible fac tor 1，HIF-1）是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個高度特異性的，在缺氧狀態(tài)下可以發(fā)揮活性的核轉(zhuǎn)錄因子，是專一調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵性介質(zhì)[3-4]。目前，HIF-1在高原胃癌患者中的表達情況及其機制的相關(guān)研究尚少報道。本研究通過觀察HIF家族兩個亞型——HIF-1a及HIF-2a在高原藏族胃癌患者組織中的表達水平，同時分析兩者與胃癌臨床分期的關(guān)系，并探討其對癌細胞增殖的影響，以期為高原胃癌基礎(chǔ)研究及臨床治療提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 患者標本

所有組織來源于2013年12月-2015年3月期間來西藏軍區(qū)總醫(yī)院行胃癌手術(shù)的84例藏族患者的腫瘤組織標本，同時取癌旁組織（距離癌組織大約5 cm）。其中男49例，女35例，年齡45～78歲，平均（62.11±9.97）歲，術(shù)前未做過任何放療及化療。

1.2 實驗材料與試劑

不完全DMEM低糖培養(yǎng)基以及胎牛血清（FBS）購自Gibco公司（美國），Trizol試劑盒購自英駿公司（上海），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Femantes公司（美國），PCR試劑盒、DNA Marker、DEPC、青霉素與鏈霉素（PS雙抗）均購于南京生興生化科技有限公司。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000對胃癌細胞SGC7901轉(zhuǎn)染siRNA-HIF-1a、siRNA-HIF-2a以及HIF-1a、HIF-2a過表達質(zhì)粒（上海吉瑪公司）。分為3組：空位組、對照組（加入亂序序列）、實驗組（分別加入HIF-1a或者HIF-2a的siRNA靶向序列）。HIF-1a的siRNA靶向序列為5'-TACGTTGTGAGTGGTAT TATT；HIF-2a的siRNA靶向序列為5'-CCCGGATA GACTTATTGCCAA[5]；對照序列為5'-AATTCTCCGA ACGTGTCACGT。用RT-PCR技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細胞總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集胃癌細胞，加入1 ml Trizol后，按照說明書的要求抽提總RNA，所得RNA溶于30 ml DEPC處理水。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000）進行定量及檢測純度。對所得RNA進一步采用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。本實驗使用美國ABI公司的7300型號Real-time PCR儀器進行擴增，PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，然后60℃20 s和70℃1 s進行40個循環(huán)，使用2-ΔΔCt法進行相對定量分析結(jié)果。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖水平

待SGC7901細胞匯合度達到50%～60%左右，加入轉(zhuǎn)染control和HIF-1a或HIF-2a siRNA，并分別于培養(yǎng)后0、24、48和72 h每孔按1∶10體積比混合完全DMEM和cell counting Kit-8（CCK-8，cell signling，USA），采用分光光度計測定450 nm波長OD值，并制作細胞生長曲線。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差±s）表示，組間比較用兩獨立樣本t檢驗，相關(guān)分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高原藏族胃癌患者組織中HIF-1a、HIF-2a的mRNA表達水平

與癌旁組織比較，高原藏族胃癌患者組織中HIF-1a與HIF-2a的mRNA水平均顯著增加（P＜0.05），提示缺氧誘導(dǎo)因子的表達異常可能是參與高原低氧環(huán)境下藏族胃癌患者致病的重要因子。

2.2 高原藏族胃癌患者組織中HIF-1a、HIF-2a的mRNA表達水平與胃癌TNM分期的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中HIF-1a的mRNA表達水平與胃癌的TNM分期顯著正相關(guān)（r=0.657，P＜0.05）（見表1），而胃癌組織中HIF-2a的mRNA表達水平與胃癌的TNM分期無顯著相關(guān)（r=0.312，P＞0.05）（見表2），說明HIF-2a與胃癌的臨床分期等級無顯著相關(guān)，而HIF-1a表達越高，胃癌的臨床分級越高（見表2）。

表1 引物的序列

表2 高原藏族胃癌患者組織中HIF-1a與HIF-2a的mRNA表達水平（±s）

表2 高原藏族胃癌患者組織中HIF-1a與HIF-2a的mRNA表達水平（±s）

注：1）與癌旁組織比較，t=6.74，P＜0.05；2）與癌旁組織比較，t= 9.17，P＜0.05

組別例數(shù)HIF-1a mRNAHIF-2a mRNA癌旁組織841.21±0.291.25±0.28胃癌組織843.42±2.191）2.12±1.152）

2.3 低表達HIF-1a對胃癌細胞增殖水平的影響

與對照組比較，胃癌細胞轉(zhuǎn)染HIF-1a siRNA后，HIF-1a mRNA水平顯著降低（見圖1A），與對照組比較，干擾HIF-1a后的胃癌細胞的增殖水平顯著降低（見圖1B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，與對照組比較，干擾HIF-1a后的胃癌細胞中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的mRNA水平顯著降低（見圖1C），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 高原藏族胃癌患者組織中HIF-1a、HIF-2a mRNA水平與胃癌TNM分期關(guān)系（±s）

表3 高原藏族胃癌患者組織中HIF-1a、HIF-2a mRNA水平與胃癌TNM分期關(guān)系（±s）

注：1）與胃癌的TNM分期比較，r=0.657，P＜0.05；2）r=0.312，P＞0.05

TNM分級例數(shù)胃癌組織（HIF-1a）胃癌組織（HIF-2a）Ⅰ253.19±0.412.51±0.36Ⅱ193.71±0.782.46±0.33Ⅲ224.46±0.683.35±0.45Ⅳ185.19±0.791）2.29±0.672）

圖1 低表達HIF-1a對胃癌細胞增殖水平的影響

圖2 低表達HIF-2a對胃癌細胞增殖水平的影響

2.4 低表達HIF-2a對胃癌細胞增殖水平的影響

與對照組比較，胃癌細胞轉(zhuǎn)染HIF-1a siRNA后，HIF-1a mRNA水平顯著降低（見圖2A），提示干擾效果成功。與對照組比較，干擾HIF-1a后的胃癌細胞的增殖水平無顯著變化（見圖2B）（P＞0.05），干擾HIF-1a的胃癌細胞中VEGF的mRNA水平亦無顯著變化（見圖2C）（P＞0.05）。

3 討論

缺氧是實質(zhì)性腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，同時也是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動因子。高原地區(qū)也是我國胃癌高發(fā)地區(qū)之一，其胃癌死亡率居全國之首。我國藏族是在高原生活的特有少數(shù)民族，其機體在高原環(huán)境適應(yīng)過程中形成特有的免疫體系。高原環(huán)境下，低氧是一種環(huán)境因子，也是一種主要的刺激原，機體對低氧的應(yīng)激反應(yīng)異常是導(dǎo)致各種高原適應(yīng)不全和高原疾病的重要原因。大量的臨床研究均表明，高原環(huán)境腫瘤組織中存在的缺氧狀態(tài)是腫瘤預(yù)后不良的重要指標[6]。缺氧首先是通過一種名為缺氧誘導(dǎo)因子的蛋白物質(zhì)來發(fā)揮作用，缺氧誘導(dǎo)因子是可以受缺氧誘導(dǎo)的，并且在缺氧狀態(tài)下穩(wěn)定存在[7-9]。研究認為，缺氧誘導(dǎo)因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤的轉(zhuǎn)移中起著核心功能，并在評價腫瘤治療及預(yù)后中發(fā)揮重要的作用。

缺氧誘導(dǎo)因子家族中，HIF-1a和HIF-2a是近年來新發(fā)現(xiàn)的能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)分子，在多種腫瘤細胞中表達，是缺氧條件下腫瘤細胞產(chǎn)生的核轉(zhuǎn)錄因子，并在腫瘤血管生成中起著核心調(diào)控作用[10]。研究認為，HIF-1a與以胃癌的浸潤程度、淋巴結(jié)以及遠處轉(zhuǎn)移為依據(jù)的臨床TNM分期呈正相關(guān)，同時與平均生存時間及5年生存率也存在密切相關(guān)。其原因主要是由于腫瘤組織的快速生長導(dǎo)致血管紊亂、腫瘤的血液供應(yīng)能力下降、氧氣消耗增加，由于患者處于貧血狀態(tài)，血紅蛋白下降使得血液攜氧能力下降，最終導(dǎo)致胃癌的低氧環(huán)境[10-11]。然而至今，HIF-1a、HIF-2a在藏族高原胃癌患者這一類低氧環(huán)境中特殊人群的潛在作用及其機制尚少了解。

本研究觀察我國藏族高原的胃癌患者體內(nèi)HIF-1a、HIF-2a基因的表達情況，并通過低表達胃癌細胞系中HIF-1a、HIF-2a基因水平后，探討兩者基因修飾對胃癌的發(fā)生、發(fā)展的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏族高原胃癌的患者組織中HIF-1a、HIF-2a基因的表達顯著高于癌旁組織，從而初步提示HIF-1a、HIF-2a在高原藏族胃癌患者的發(fā)病中可能發(fā)揮著重要的作用。原因可能是，在胃癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的進程中，造成局部組織缺氧，顯著促進HIF-1a、HIF-2a的表達[11-12]，而處在缺氧、嚴寒等環(huán)境下的高原，低氧血癥是最主要的病生變化，造成機體高表達HIF-1a、HIF-2a[13-14]。但它作為一種原發(fā)打擊因素或急性持續(xù)性地刺激因素成為一種非特異性刺激原，并且用以激活機體內(nèi)的炎癥細胞因子、介質(zhì)、基因等極端復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，使全身多器官、組織、細胞處于預(yù)激狀態(tài)，而高原胃癌腫瘤在這個特殊環(huán)境中，其造成局部組織缺氧可能更加嚴重，從而可能更加顯著地促進HIF-1a、HIF-2a的表達。筆者進一步分析胃癌組織中HIF-1a、HIF-2a的mRNA表達水平與胃癌的TNM分期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1a與胃癌分期顯著正相關(guān)，而胃癌組織中HIF-2a的mRNA表達水平與胃癌的TNM分期程度無相關(guān)，提示了高原胃癌組織中HIF-1a表達越高，胃癌的分期越高，也就說明HIF-1a的高表達與高原胃癌腫瘤的惡性行為及不良的預(yù)后有著密切的關(guān)系。而高原胃癌組織中HIF-2a與胃癌的分期無顯著相關(guān)，同時CHEN等人[15]發(fā)現(xiàn)胃癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的組織中HIF-1a的表達水平顯著增加，也從側(cè)面支持本研究的結(jié)論。

進一步采用小RNA干擾技術(shù)干擾胃癌細胞系中HIF-1a、HIF-2a后發(fā)現(xiàn)，低表達HIF-1a的胃癌細胞的增殖水平顯著降低，而低表達HIF-2a的胃癌細胞的增殖水平無顯著變化，提示HIF-1a可能影響著胃癌細胞的增殖能力，從而提示胃癌細胞中HIF-1a表達水平在胃癌診斷及預(yù)后評價中可能有著一定的作用。研究認為，HIF-1a被激活后可以調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)的基因，尤其是VEGF等[16-19]，從而使細胞對缺氧環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)、更好地適應(yīng)缺氧環(huán)境。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，低表達HIF-1a的胃癌細胞的VEGF表達水平顯著降低，而低表達HIF-2a的胃癌細胞的VEGF表達水平無顯著變化，提示HIF-1a可能通過調(diào)節(jié)VEGF基因參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，HIF-1a的表達水平在胃癌的發(fā)生、進展、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程中起著重要的作用。胃癌組織中HIF-1a呈高表達，可能的機制是通過調(diào)節(jié)VEGF以及促進癌細胞的增殖實現(xiàn)的，因此研究高原藏族胃癌患者組織中的HIF-1a的表達水平可能對高原地區(qū)胃癌患者診斷、治療及其預(yù)后具有一定的臨床意義。

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（張蕾 編輯）

Level of hypoxia inducible factor-1a and-2a in Tibetan Plateau patients with gastric cancer and its mechanism*

Xiao-li LIU1,Ke LIU2,Min-xia ZHU1
(1.Basic Laboratory of Life Sciences,Tibet National University,Xianyang,Shanxi 712082, P.R.China;2.Department of General Surgery,the General Hospital of Tibet Military Command,Lhasa,Tibet 850000,P.R.China)

【Objective】To study hypoxia inducible factor(HIF)-1a and HIF-2a levels in the tissues of patients with gastric cancer in the Tibetan Plateau,and to explore its molecular mechanism.【Methods】Realtime-PCR was used to detect the expression of HIF-1a and HIF-2a in gastric cancer tissue and pericancerous tissue and the correlation of HIF-1a and HIF-2a with the clinical staging was explored.Small interfering RNA(siRNA)was used to inhibit the expression of HIF-1a and HIF-2a in gastric cancer cells SGC7901,the expression level of VEGF was detected by RT-PCR and proliferation of the cells was detected by CCK-8.【Results】In the patients with gastric carcinoma,HIF-1a and HIF-2a mRNA levels were significantly higher in the cancerous tissue than in the adjacent tissue,the difference was statistically significant(P＜0.05).The HIF-1a mRNA level in the gastric cancer tissue was significantly and positively correlated with gastric cancer staging(P＜0.05).After knockdown of HIF-1a in gastric cancer cells,VEGF expression and the cell proliferation were significantly decreased(P＜0.05)；however,after knockdown of HIF-2a in gastric cancer cells,the VEGF mRNA level and cell proliferation did not significantly change(P＞0.05).【Conclusions】The level of HIF-1a has a promoting effect on the formation of gastric cancer in Tibetan Plateau,which may be related topromoted VEGF expression and cancer cell proliferation.

hypoxia inducible factor(HIF)-1a；HIF-2a；gasrtric cancer；VEGF

R735.2

A

1005-8982（2015）30-0023-05

2015-06-10

2015年西藏自治區(qū)科技廳自然科學(xué)基金立項項目（No：2015ZR-13-15）