陳紹占，劉麗萍，杜振霞，馬 輝

（1．北京市疾病預防控制中心，北京 100013；2．北京化工大學理學院，北京 100029；3．石家莊市疾病預防控制中心，河北石家莊 050011）

高效液相色譜－電感耦合等離子體質譜聯(lián)用技術測定畜禽肉制品中八種砷形態(tài)化合物

陳紹占1，2，劉麗萍1，杜振霞2，馬 輝3

（1．北京市疾病預防控制中心，北京 100013；2．北京化工大學理學院，北京 100029；3．石家莊市疾病預防控制中心，河北石家莊 050011）

建立了畜禽肉制品中三價砷［As（Ⅲ）］、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、五價砷［As（Ⅴ）］、阿散酸（p－ASA）、洛克沙砷（ROX）、4－羥基苯砷酸（4－HPAA）和4－硝基苯砷酸（4－NPAA）等砷形態(tài)化合物的高效液相色譜－電感耦合等離子體質譜（HPLC－ICP－MS）分析方法。以甲醇－水（1∶1，V／V）作為提取劑，采用超聲水浴對樣品進行前處理，選取Dionex IonPac AS14陰離子交換柱作為分析柱，50mmol／L（NH4）2HPO4（pH 7．3）為流動相，對畜禽肉制品中的砷形態(tài)化合物進行分析測定。結果表明，8種砷形態(tài)化合物的線性范圍為1～300μg／L，相關系數(shù)（R2）均大于0．999，檢出限為0．1～0．5μg／L。以精密度考察方法重現(xiàn)性，相對標準偏差（RSD）均小于5％，方法加標回收率在80．8％～105．7％之間。通過對實際樣品的分析測定，發(fā)現(xiàn)在畜禽肉制品中的有機砷制劑主要為三價砷阿散酸和洛克沙砷，另外還有一種未知的砷化合物，有待進一步研究確認。

高效液相色譜－電感耦合等離子質譜（HPLC－ICP－MS）；畜禽肉制品；砷形態(tài)

1996年，我國農業(yè)部批準了有機砷制劑的使用，隨后逐漸開始大量生產，并廣泛用于畜禽飼養(yǎng)業(yè)［1］。阿散酸（p－ASA）、洛克沙砷（ROX）、4－羥基苯砷酸（4－HPAA）和4－硝基苯砷酸（4－NPAA）等有機砷制劑作為飼料添加劑，可以促進畜禽生長、提高飼料轉化率、提高產蛋量并增加色素沉著［2］。但是，有機砷制劑具有一定的毒性，過量添加可使動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調，促使腦病和視神經(jīng)萎縮的發(fā)病率升高；而且在動物體內的代謝過程中，有機砷制劑可能產生殘留或降解為其他砷形態(tài)化合物，對動物產生毒害作用，殘留了這些藥物的畜禽肉制品如果進入到食物鏈，將會對人體健康［1，3］造成威脅。因此，檢測畜禽肉制品中有機砷制劑殘留及其他砷形態(tài)化合物的含量具有重要的意義。

日本肯定列表規(guī)定，禽肉產品中洛克沙砷和硝基苯砷酸的允許殘留量分別為0．15mg／kg和0．20mg／kg［4］。Lasky等［5］研究發(fā)現(xiàn)，美國市場上仔雞肉中砷的平均殘留量為0．39mg／kg。而我國由于檢測方法的局限性，對有機砷制劑的殘留量還沒有明確規(guī)定。

砷形態(tài)化合物的檢測方法主要有高效液相色譜法［1，6－9］、氣相色譜－質譜法［10］、液相色譜－質譜法［11］、液相色譜－氫化物發(fā)生－原子熒光法［12－14］和高效液相色譜－電感耦合等離子體質譜（HPLC－ICP－MS）法［3，15］。目前，最常用的檢測方法是HPLC－ICP－MS法，主要采用陰離子交換色譜柱檢測As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、DMA、MMA和AsB等砷形態(tài)。Liu等［17］建立了陰離子交換色譜柱同時分離As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、DMA、MMA、p－ASA和ROX 6種砷化合物的方法。

本實驗擬采用Dionex IonPac AS14陰離子交換柱，建立一種有效分離檢測畜禽肉制品中As（Ⅲ）、As（Ⅴ）、DMA、MMA、p－ASA、ROX、4－HPAA和4－NPAA等8種砷形態(tài)化合物的HPLC－ICP－MS方法，旨為相關食品的監(jiān)督檢驗提供方法參考。

1 實驗部分

1．1 主要儀器與裝置

1200型高效液相色譜儀，7500a型電感耦合等離子體質譜儀：美國Agilent公司產品；Dionex IonPac AS14陰離子交換柱（250mm× 4mm×10μm）：美國Thermo－Fisher公司產品；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)：美國Millipore公司產品；數(shù)控超聲清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產品；高速冷凍離心機：美國貝克曼公司產品；冷凍干燥機：德國Marin Christ公司產品；電熱板：LabTech公司產品。

1．2 主要材料與試劑

超純水（電阻率18．2MΩ·cm）：由超純水處理系統(tǒng)制備；（NH4）2HPO4（ACS 98％）：Alfa Aesar（天津）化學有限公司產品；（NH4）2CO3（分析純），氨水和冰醋酸（優(yōu)級純）：國藥集團化學試劑有限公司產品；甲醇（HPLC級）：北京迪馬科技有限公司產品；亞砷酸根離子［As（Ⅲ）］、砷酸根離子［As（Ⅴ）］、一甲基砷（MMA）和二甲基砷（DMA）：由中國計量科學研究院提供；洛克沙砷（ROX，99．0％）、4－硝基苯砷酸（4－NPAA，98％）：德國Dr．Ehrenstorfer公司產品；阿散酸（p－ASA，99％）：美國United States Pharmacope公司產品；4－羥基苯砷酸（4－HPAA，98％）：日本東京株式會社產品。

1．3 實驗條件

1．3．1 色譜條件 Dionex IonPac AS14陰離子交換柱（250mm×4mm×10μm）；流動相：

A為H2O，B為50mmol／L（NH4）2HPO4（pH 7．3）；柱溫為室溫；進樣體積25μL。梯度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1．3．2 質譜條件 入射功率1 450W，載氣（高純氬氣）流速0．65L／min，輔助氣流速0．45L／min，射頻電壓1．72V，采樣深度7．8mm，泵速0．3r／s，監(jiān)測離子m／z75（As）、m／z35（Cl）。

1．4 樣品的制備和前處理方法

在當?shù)爻须S機購買雞胗、豬腰、豬肝等樣品，冷凍干燥后，存放于干燥處。

稱取0．4g（精確到0．001g）凍干樣品于15mL離心管中，用10mL甲醇－水溶液（1∶1，V／V）作為提取液，60℃水浴超聲2h，以9 000r／min離心5min，將上清液轉移至100mL燒杯中。向殘渣中加入5mL甲醇－水溶液（1∶1，V／V），60℃水浴超聲0．5h，以9 000r／min離心5min，合并上清液，此操作重復2次。然后，用電熱板于60℃蒸至近干，再用超純水復溶至10mL，過0．45μm濾膜后，上機測定。

2 結果與討論

2．1 色譜條件的優(yōu)化

2．1．1 色譜柱的選擇 選用Dionex IonPac－AS19、AS16及AS14陰離子交換柱進行實驗條件優(yōu)化，以50mmol／L（NH4）2CO3（pH 9．2）作流動相，1mL／min等度洗脫。選用AS19作分析柱時，在35min內，7種待測砷形態(tài)化合物可完全分離，但ROX未能被洗脫出來，其色譜圖示于圖1；以1．2、1．5mL／min流速洗脫時，仍不能將ROX洗脫出來。選用AS16作分析柱時，在40min內，6種待測砷形態(tài)化合物可完全分離，但4－HPAA和ROX未能被洗脫出來，其色譜圖示于圖2；嘗試加大流速，仍不能將4－HPAA和ROX洗脫出來。選用AS14作分析柱時，在14min內，8種待測砷形態(tài)均被洗脫出來，但As（Ⅲ）、DMA和MMA不能達到基線分離，且p－ASA和As（Ⅴ）的出峰位置重疊。因此，選擇AS14陰離子交換柱作為分析柱，并進一步優(yōu)化實驗條件。

圖1 Dionex IonPac AS19作為分析柱，7種砷形態(tài)化合物的色譜圖（10μg／L）Fig．1 Chromatogram of 7 arsenic species compounds with Dionex IonPac AS19 as analytical column

圖2 Dionex IonPac AS16作為分析柱，6種砷形態(tài)化合物的色譜圖（10μg／L）Fig．2 Chromatogram of 6 arsenic species compounds with Dionex IonPac AS16 as analytical column

2．1．2 流動相的選擇 選用AS14作為分析柱，以50mmol／L（NH4）2CO3（pH 9．2）作為流動相，采用梯度洗脫不能實現(xiàn)目標物的分離；選用20mmol／L（NH4）2HPO4作為流動相，以1mL／min流速等度洗脫，30min內可完全洗脫8種砷形態(tài)化合物，但As（Ⅲ）、DMA和

MMA不能達到基線分離，且p－ASA和As（Ⅴ）的出峰位置重疊。為了實現(xiàn)目標化合物的分離，并縮短分析時間，采用50mmol／L（NH4）2HPO4（pH 7．3）和H2O作為流動相，梯度洗脫，優(yōu)化后的洗脫程序已于表1中列出。此時，8種砷形態(tài)化合物可完全分離，其色譜圖示于圖3。

2．2 樣品前處理條件的選擇

目前，分析砷形態(tài)化合物常用的提取劑為水、甲醇、甲醇－水溶液（1∶1，V／V）等。水作為提取劑可用于簡單基質樣品的前處理，不適于脂肪或蛋白含量高的樣品。甲醇可用于提取有機砷形態(tài)和沉淀蛋白，適合高效液相色譜法，但若儀器無加氧裝置，則不能直接用于HPLCICP－MS分析。甲醇－水溶液（1∶1，V／V）可保持各化合物形態(tài)，避免形態(tài)之間的轉化，提取后一般需采用旋轉蒸發(fā)法、氮吹法或電熱板蒸干法去除甲醇，稀釋后上機測定。

本實驗參考文獻［16］進行實驗條件優(yōu)化，選擇甲醇－水溶液（1∶1，V／V）作為提取液，于60℃水浴中超聲提取，提取液用電熱板蒸干法去除甲醇。結果表明，提取液澄清，蛋白沉淀較好，可滿足實驗要求。

2．3 方法的線性范圍及檢出限

分別配制0．5、1、5、10、25、50、100、200、300μg／L的8種砷形態(tài)化合物混合標準系列溶液，在優(yōu)化的實驗條件下進行分析，在1～300μg／L范圍內，相關系數(shù)（R2）均大于0．999。采用逐級稀釋法，在0．2μg／L時，As（Ⅲ）的信噪比（S／N）大于3；在0．1μg／L時，DMA，MMA和As（Ⅴ）的信噪比大于3；在0．3μg／L時，p－ASA，4－HPAA和ROX的信噪比大于3；在0．5μg／L時，4－NPAA的信噪比大于3。因此，確定8種砷形態(tài)化合物的檢出限分別為0．1～0．5μg／L；如果稱樣量為0．4g，定容體積為10mL，8種砷形態(tài)化合物的線性范圍、檢出限、最低檢出濃度等數(shù)據(jù)列于表2。

圖3 Dionex IonPac AS14作為分析柱，8種砷形態(tài)化合物的色譜圖（10μg／L）Fig．3 Chromatogram of 8 arsenic species compounds with Dionex IonPac AS14 as analytical column

表2 方法的線性范圍與檢出限Table 2 Linear range and detection limit of the method

2．4 方法的精密度及加標回收率

以精密度考察方法重現(xiàn)性。由于未檢測到同時存在8種砷形態(tài)化合物的畜禽肉樣品，因此向一市售豬肝樣品中分別加入3個質量濃度水平的8種砷形態(tài)混合標準溶液，制成6個模擬樣品進行精密度實驗，同時進行加標回收率實驗，結果列于表3。在3個質量濃度水平下，8種砷形態(tài)化合物的加標回收率在80．8％～105．7％之間，相對標準偏差（RSD）均小于5％。

2．5 實際樣品的測定

按照所建立的方法對豬肝、豬腎、豬心、雞胗等實際樣品進行測定，結果列于表4。結果表明，從畜禽肉樣品中檢出有機砷制劑主要為As（Ⅲ）、DMA、p－ASA和ROX，另外還有一種未知的砷形態(tài)化合物，而4－HPAA和4－NPAA均未檢出。其中，豬腎2樣品中砷形態(tài)的色譜圖示于圖4。

表3 方法的加標回收率與精密度Table 3 Spike recoveries and precision of eight arsenic species compounds（n＝6）

表4 實際樣品中砷形態(tài)化合物的測定結果Table 4 Analysis results of arsenic species in the real samples（n＝3）

圖4 豬腎2樣品中砷形態(tài)化合物的色譜圖Fig．4 Chromatogram of arsenic species compounds in kidney 2 sample

3 結論

本實驗建立了HPLC－ICP－MS聯(lián)用技術同時測定畜禽肉制品中As（Ⅲ）、MMA、DMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX、4－HPAA和4－NPAA等8種砷形態(tài)化合物的分析方法。采用甲醇－水溶液（1∶1，V／V）作提取劑超聲提取樣品，以Dionex IonPac AS14陰離子交換柱作為分析柱，50mmol／L（NH4）2HPO4（pH 7．3）為流動相，8種砷形態(tài)化合物的檢出限為0．1～0．5μg／L，方法RSD均小于5％，加標回收率在80．8％～105．7％之間。通過對實際樣品的分析，發(fā)現(xiàn)畜禽肉樣品中殘留的砷形態(tài)化合物主要為三價砷、阿散酸和洛克沙砷，另外還有一種未知砷形態(tài)化物，有待進一步研究確認。

［1］ 陳冬梅，陶燕飛，王玉蓮，等．豬飼料中有機砷類藥物殘留檢測方法［J］．中國農業(yè)科技導報，2008，10（增刊2）：1－4．CHEN Dongmei，TAO Yanfei，WANG Yulian，et al．Residue determination of organic arsenic in pig feeds using high performance liquid chromatography［J］．Journal of Agricultural Science and Technology，2008，10（Suppl 2）：1－4（in Chinese）．

［2］ CHAPMAN H D，MARSLER P，LAVORGNA M W．The effects of salinomycin and roxarsone on the performance of broileraw hen included in the feed for four，five，or six weeks and infected with eimeria species during the starter or grower phase of production［J］．Poultry Science，2004，83（5）：761－764．

［3］ 楊麗君，劉玉敏，崔鳳杰，等．高效液相色譜－電感耦合等離子體質譜同時分析雞肉中洛克沙生，阿散酸和硝苯砷酸［J］．食品科學，2011，32（18）：202－204．YANG Lijun，LIU Yumin，CUI Fengjie，et al．Simultaneous determination of roxarsone，arsanilic and nitarsone in chicken by high performance liquid chromatography／inductively coupled plasma mass spectrometry［J］．Food Science，2011，32（18）：202－204（in Chinese）．

［4］ 食品中農業(yè)化學品殘留限量編委會．食品中農業(yè)化學品殘留限量［M］．北京：中國標準出版社，2006：893，1 108．

［5］ LASKY T，SUN W，KADRY A，et al．Mean total arsenic concentrations in chicken 1989—2000and estimated exposures for consumers of chicken［J］．Environmental Health Perspectives，2004，112（1）：18．

［6］ 徐錦萍，何珩，徐夢依，等．反相高效液相色譜法測定飼料添加劑阿散酸中的阿散酸及摻假物質對氨基苯磺酸［J］．色譜，2010，28（2）：218－220．XU Jinping，HE Heng，XU Mengyi，et al．Determination of arsanilic acid and sulfanilic acid as adulterant in feed additives by reversed－phase high performance liquid chromatography［J］．Chinese Journal of Chromatography，2010，28（2）：218－220（in Chinese）．

［7］ 肖亞兵，韋瑋，高健會，等．固相萃?。咝б合嗌V法對飼料中阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的同時測定［J］．分析測試學報，2008，27（9）：964－967．XIAO Yabing，WEI Wei，GAO Jianhui，et al．Simultaneous determination of arsanilic，nitarsone and roxarsone in animal feed by solid－phase extraction and high performance liquid chromatography［J］．Journal of Instrumental Analysis，2008，27（9）：964－967（in Chinese）．

［8］ 曹慶云，顏惜玲，周武藝，等．高效液相色譜測定雞肝中洛克沙砷的方法研究［J］．應用化學，2005，34（10）：640－643．CAO Qingyun，YAN Xiling，ZHOU Wuyi，et al．Determination of roxarsone in chicken livers by high performance liquid chromatography［J］．Applied Chemical Industry，2005，34（10）：640－643（in Chinese）．

［9］ CHEN D，ZHANG H，TAO Y，et al．Development of a high－performance liquid chromatogra－

phy method for the simultaneous quantification of four organoarsenic compounds in the feeds of swine and chicken［J］．Journal of Chromatography B，2011，879（11）：716－720．

［10］ROERDINK A R，ALDSTADTⅢJ H．Sensitive method for the determination of roxarsone using solid－phase microextraction with multi－detector gas chromatography［J］．Journal of Chromatography A，2004，1 057（1）：177－183．

［11］PERGANTIS S A，WINNIK W，BETOWSKI D．Determination of ten organoarsenic compounds using microbore high－performance liquid chromatography coupled with electrospray mass spectrometry－mass spectrometry［J］．J Anal At Spectrom，1997，12（5）：531－536．

［12］SáNCHEZ－RODAS D，GóMEZ－ARIZA J L，OLIVEIRA V．Development of a rapid extraction procedure for speciation of arsenic in chicken meat［J］．Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，385（7）：1 172－1 177．

［13］LIU J，YU H，SONG H，et al．Simultaneous determination of p－arsanilic acid and roxarsone in feed by liquid chromatography－h(huán)ydride generation online coupled with atomic fluorescence spectrometry［J］．Journal of Environmental Monitoring，2008，10（8）：975－978．

［14］MONASTERIO R P，LONDONIO J A，F(xiàn)AR－IAS S S，et al．Organic solvent－free reversedphase ion－pairing liquid chromatography coupled to atomic fluorescence spectrometry for organoarsenic species determination in several matrices［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（8）：3 566－3 574．

［15］肖亞兵，高健會，曾宇，等．HPLC－ICP－MS法對動物源性食品中阿散酸，硝苯砷酸與洛克沙砷殘留量的同時測定［J］．分析測試學報，2008，27（11）：1 206－1 209．XIAO Yabing，GAO Jianhui，ZENG Yu，et al．Simultaneous determination of arsanilic，nitarsone and roxarsone residues in foods of animal origin by HPLC－ICP－MS［J］．Journal of Instrumental Analysis，2008，27（11）：1 206－1 209（in Chinese）．

［16］NAM S H，OH H J，MIN H S，et al．A study on the extraction and quantitation of total arsenic and arsenic species in seafood by HPLC－ICP－MS［J］．Microchemical Journal，2010，95（1）：20－24．

［17］LIU X P，ZHANG W F，HU Y N，et al．Extraction and detection of organoarsenic feed additives and common arsenic species in environmental matrices by HPLC－ICP－MS［J］．Microchemical Journal，2013，108：38－45．

Determination of Eight Arsenic Species Compounds in Livestock and Poultry Meat Products by HPLC－ICP－MS

CHEN Shao－zhan1，2，LIU Li－ping1，DU Zhen－xia2，MA Hui3
（1．Beijing Center for Disease Prevention and Control，Beijing100013，China；2．Science Faculty，Beijing University of Chemical Technology，Beijing100029，China；3．Shijiazhuang Center for Disease Prevention and Control，Shijiazhuang050011，China）

As（Ⅲ），MMA，DMA，As（Ⅴ），p－ASA，ROX，4－HPAA and 4－NPAA in livestock and poultry meat products were determined by high performance liquid chromatography－inductively coupled plasma mass spectrometry（HPLC－ICP－MS）．Ultrasonic water bath was used to pretreat the samples with methanol－water（1∶1，V／V）as extraction agent．Dionex IonPac AS14anion exchange column was used as analytical column，50mmol／L（NH4）2HPO4（pH 7．3）was used as mobile phase，and the method was used to detect arsenic species compounds in livestock and poultry meat products．

high performance liquid chromatography－inductively coupled plasma mass spectrometry（HPLC－ICP－MS）；livestock and poultry meat product；arsenic species compounds

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0033－07

10．7538／zpxb．youxian．2014．0049

2014－02－25；

2014－04－21

陳紹占（1987—），男（漢族），河北邯鄲人，碩士研究生，從事無機元素分析及形態(tài)研究。E－mail：csz1987buct＠163．com

劉麗萍（1965—），女（漢族），北京人，主任技師，從事元素及形態(tài)分析研究。E－mail：llp9312＠163．com

時間：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0049．html

The results show that the linear range of eight arsenic compounds is 1－300μg／L，the correlation coefficient（R2）is greater than 0．999，the detection limit is 0．1－0．5μg／L．The reproducibility of this method was inspected by precision，RSD is less than 5％，the recovery is between 80．8％and 105．7％．Through the analysis of actual samples，As（Ⅲ），p－ASA and ROX are checked out in livestock and poultry meat products，and an unknown arsenic compounds is also checked out．