李 彥，劉 鋒，王鴻麗，梁 艷，劉 煜，楊松成，何 昆

（1．武警總醫(yī)院藥劑科，北京 100039；2．國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850；3．武警總醫(yī)院肝臟移植研究所，北京 100039）

肝移植并免疫抑制劑聯(lián)合用藥后人血清差異蛋白質(zhì)的鑒定

李 彥1，劉 鋒2，王鴻麗2，梁 艷1，劉 煜3，楊松成2，何 昆2

（1．武警總醫(yī)院藥劑科，北京 100039；2．國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850；3．武警總醫(yī)院肝臟移植研究所，北京 100039）

建立了基于質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用免疫抑制劑肝移植后人血清中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分析方法。肝移植前后的人血清用雙向凝膠電泳分離，硝酸銀染色，選取的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)用表面活性劑Rapigest SF變性和胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解后，采用納升超高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（nanoUPLC－ESI－MS／MS）進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)明確鑒定了9個(gè)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，對應(yīng)8個(gè)不同的蛋白質(zhì)，所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)多與免疫調(diào)節(jié)和肝病有關(guān)，可為深入研究肝移植術(shù)后免疫抑制劑抗排斥作用的分子機(jī)理提供線索。關(guān)鍵詞：肝移植；血清；免疫抑制劑；納升超高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（nanoUPLC－ESI－MS／MS）

肝臟移植術(shù)（liver transplantation）后如何減少免疫排斥反應(yīng)等并發(fā)癥，如何選擇有效的治療方法是目前肝移植領(lǐng)域中的重點(diǎn)問題［1－2］。免疫抑制劑FK506可用于治療器官移植術(shù)后，其他免疫抑制藥物無法控制的移植排斥反應(yīng)，已成為臨床抗排斥反應(yīng)的首選藥物，常與驍悉和激素聯(lián)合治療術(shù)后的抗排斥反應(yīng)，但其體內(nèi)作用機(jī)制還在研究中。近幾年，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)、闡明藥物作用機(jī)理等方面發(fā)揮了極大的優(yōu)勢［3－4］，但還未見免疫抑制劑在肝移植后抗排斥作用的蛋白質(zhì)組學(xué)方面的報(bào)道。本研究利用納升超高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（NanoUPLC－ESI－MS／MS）技術(shù)對二維凝膠電泳分離的肝移植前和移植后，服用免疫抑制劑治療表達(dá)顯著的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)硝酸銀染色后進(jìn)行鑒定，以期為從蛋白質(zhì)組學(xué)角度探索FK506聯(lián)合用藥抗排斥反應(yīng)的作用機(jī)制提供線索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Synapt G2質(zhì)譜儀（nanoUPLC－ESI－MS／MS），Rapigest SF：美國Waters公司產(chǎn)品；經(jīng)修飾的測序級胰蛋白酶（Trypsin）：德國Roche公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）等：美國Sigma公司產(chǎn)品。

1．2 樣品

5例移植前和移植后24h、10d、30d、90d、180d的血清樣品：來自武警總醫(yī)院肝移植研究所的乙肝肝硬化肝癌移植病人，年齡27～65歲。移植后采用三聯(lián)用藥，即FK506＋驍悉＋激素，3個(gè)月時(shí)停用激素，F(xiàn)K506在3個(gè)月內(nèi)濃度為8～10μg／L，3～6個(gè)月為6～8μg／L。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 傳統(tǒng)膠內(nèi)酶解方法［5］從雙向電泳分離的銀染色凝膠中切取差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，利用30mmol／L K3Fe（CN）6－100mmol／L Na2S2O3脫色液（1∶1，V／V）完全脫色，再用10mmol／L DTT和55mmol／L IAA進(jìn)行還原和烷基化，然后加入0．01g／L胰蛋白酶液進(jìn)行酶解，37℃孵育過夜，分別用5％TFA、2．5％TFA與ACN溶液（1∶1，V／V）和ACN，于37℃孵溫1h后，提取肽段，真空離心干燥。

1．3．2 加入表面活性劑的酶解方法［6］脫色后，用10mmol／L DTT和55mmol／L IAA進(jìn)行還原和烷基化，加入0．01g／L胰蛋白酶液和0．03％Rapigest SF進(jìn)行酶解，于37℃孵育2h，肽段提取方法同傳統(tǒng)方法。

1．3．3 質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索 用1％甲酸溶解樣品，進(jìn)樣5μL。富集柱：Symmetry C18（180μm×20mm×5μm）；分析柱：nano Acquity UPLC超高效液相色譜鍵合乙烷雜顆粒柱BEH C18（75μm×250mm×1．7μm）；柱溫度35℃；流速200nL／min；流動相：含0．1％甲酸的水溶液（A）和含0．1％甲酸的乙腈（B）。

納升電噴霧正離子數(shù)據(jù)采集模式：DDA方式，每次掃描2個(gè)強(qiáng)度最高的離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析；毛細(xì)管電壓2 500V；錐孔電壓35V；離子源溫度90℃；采集范圍：m／z350～1 600（一級質(zhì)譜），m／z50～2 000（二級質(zhì)譜）。通過數(shù)據(jù)庫Mascot檢索。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 傳統(tǒng)酶解方法和加入表面活性劑變性酶解效率的比較

從凝膠上取同等量標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA條帶，分成2組，分別用傳統(tǒng)酶解方法和加入表面活性劑Rapigest SF酶解方法膠內(nèi)酶解后進(jìn)行nano UPLC－ESI－MS／MS分析，利用部分肽段測序進(jìn)行Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)果列于表1。結(jié)果顯示，加入Rapigest SF酶解方法的匹配肽段數(shù)、氨基酸覆蓋率和檢索分值比傳統(tǒng)方法分別提高了約40％、30％、65％。因此，本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用加入表面活性劑的酶解方法。

2．2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的LC－ESI－MS／MS鑒定及數(shù)據(jù)庫檢索

凝膠上的表達(dá)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)nano UPLC－ESI－MS／MS分析和數(shù)據(jù)庫檢索，獲得

差異蛋白質(zhì)信息，結(jié)果列于表2。從9個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定出8個(gè)有意義的蛋白質(zhì)，質(zhì)譜的質(zhì)量偏差均小于1×10－6。其中，蛋白質(zhì)點(diǎn)487為表達(dá)下調(diào)蛋白，其余均為表達(dá)上調(diào)蛋白，點(diǎn)576和578鑒定為同一蛋白質(zhì)haptoglobin Hp2，詳細(xì)信息示于圖1。

表1 兩種酶解方法的LC－ESI－MS／MS分析結(jié)果比較Table 1 The comparison of two kinds of digestion methods

表2 nanoUPLC－ESI－MS／MS鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 2 Identification of differentially expressed protein spots by nanoUPLC－ESI－MS／MS

2．3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用LC－MS／MS技術(shù)建立了免疫抑制劑FK506聯(lián)合用藥在肝移植后人血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定方法。血清中高豐度蛋白質(zhì)的濃度與低豐度蛋白質(zhì)的濃度比值可達(dá)109倍，這使得許多低豐度蛋白在電泳中被掩蓋。為獲得更多蛋白質(zhì)點(diǎn)信息，采用靈敏度低于1ng的硝酸銀染色。而相對低的蛋白質(zhì)濃度則直接影響蛋白質(zhì)鑒定的靈敏度和可靠性。為提高銀染凝膠中低豐度蛋白質(zhì)的鑒定率，本研究使用酸性不穩(wěn)定表面活性劑Rapigest SF來提高蛋白溶解率，濃度小于0．1％的Rapigest SF完全不影響胰蛋白酶的活性，且與質(zhì)譜兼容。結(jié)果表明，加入表面活性劑能夠明顯提高銀染色后蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的肽段提取率和氨基酸序列覆蓋率，同時(shí)酶解時(shí)間可由原來的過夜縮短至2h。此方法與MALDI－TOF MS兼容性較差，不建議使用。鑒定的8個(gè)蛋白質(zhì)多與免疫反應(yīng)或肝病有關(guān)，如：Haptoglobin（Hp，結(jié)合珠蛋白）具有結(jié)合血紅蛋白、促進(jìn)血管生成和參與免疫反應(yīng)等功能，體內(nèi)結(jié)合珠蛋白數(shù)量明顯的變化，有助于對肝臟疾病的診斷，判斷疾病的預(yù)后［78］。有研究報(bào)道，Hp通過激活天然免疫能增強(qiáng)小鼠急性移植排斥反應(yīng)［9］。Retinol－binding protein4（RBP4，視黃醇結(jié)合蛋白）是體內(nèi)視黃醇從肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)到靶組織的特異轉(zhuǎn)載蛋白，肝功能受損，RBP表達(dá)會明顯下調(diào)，血清中RBP的表達(dá)水平可以幫助評價(jià)肝臟功能的損害程度［10］。鑒定的這些差異點(diǎn)將為從蛋白質(zhì)組學(xué)角度深入研究移植后，免疫抑制劑FK506聯(lián)合用藥抗排斥反應(yīng)的作用機(jī)制、臨床合理選擇和使用免疫抑制劑等提供線索。

圖1 nanoUPLC－ESI－MS／MS分析蛋白質(zhì)斑點(diǎn)576Fig．1 The analysis of No．576 protein spot by nanoUPLC－ESI－MS／MS

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Identification of the Differentially Expressed Proteins in Human Serum after Liver Transplantation and Immunosuppressant Combination Therapy

LI Yan1，LIU Feng2，WANG Hong－li2，LIANG Yan1，LIU Yu3，YANG Song－cheng2，HE Kun2
（1．Department of Pharmacy，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing100039，China；2．National Center of Biomedical Analysis，Beijing100850，China；3．Institute of Liver Transplantation，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing100039，China）

The mass spectrometry method was established for analysis of differentially expressed protein in human serum after liver transplantation with immunosuppressive agent．The proteins in serum before and after liver transplantation were separated by two－dimensional gel electrophoresis with silver staining，the differentially expressed proteins on the gel were digested with surfactant Rapigest SF and trypsin and then identified by nanoUPLC－ESI－MS／MS．In the experiment，9differentially expressed protein spots were identified clearly，corresponding to 8different proteins．It was found that differentially expressed proteins are mostly related to immune regulation and liver dis－

liver transplantation；serum；immunosuppressive agent；nanoUPLC－ESIMS／MS

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0029－04

10．7538／zpxb．youxian．2014．0056

2013－12－23；

2014－06－23

武警總醫(yī)院二類課題（wz2011019）資助

李 彥（1965—），女，副主任藥師，從事藥劑和臨床藥學(xué)研究。E－mail：lyanbjing＠126．com

何 昆（1973—），男，副研究員，從事蛋白質(zhì)組學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究。E－mail：hk＠proteomics．cn

時(shí)間：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0056．html

ease，and it may provide clues for the in－depth study the anti－rejection effect of immunosuppressive agent after liver transplantation．