孫雪晴，胡高飛，宋德偉，田亞平，顏光濤，徐 蓓，李紅梅

（1．北京化工大學(xué)，北京 100029；2．中國計量科學(xué)研究院，北京 100013；3．解放軍總醫(yī)院生化科，北京 100853）

高效液相色譜－同位素稀釋－串聯(lián)質(zhì)譜法測定人源瘦素的含量

孫雪晴1，2，胡高飛1，宋德偉2，田亞平3，顏光濤3，徐 蓓2，李紅梅2

（1．北京化工大學(xué)，北京 100029；2．中國計量科學(xué)研究院，北京 100013；3．解放軍總醫(yī)院生化科，北京 100853）

為準(zhǔn)確測定人源瘦素的含量，建立了蛋白水解－高效液相色譜－同位素稀釋－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCIDMS）測定人源瘦素純品絕對含量的方法，并對人源瘦素蛋白水解時間進行優(yōu)化。結(jié)果表明，人源瘦素中的被測氨基酸在溫度為110℃，6mol／L HCl溶液中水解40h可達平衡。水解樣品通過高效液相色譜分離后，使用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）分別檢測脯氨酸m／z 116＞m／z 70（Pro）和m／z 121＞m／z 74（標(biāo)記Pro）離子對，纈氨酸m／z 118＞m／z 72（Val）和m／z 123＞m／z 76（標(biāo)記Val）離子對，亮氨酸m／z132＞m／z86（Leu）和m／z142＞m／z96（標(biāo)記Leu）離子對，根據(jù)檢測結(jié)果計算得出人源瘦素純品的含量為0．582g／g，擴展不確定度為0．014g／g（k＝2），這與純度扣除法測定結(jié)果基本一致，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4．8％。該方法提高了人源瘦素含量測定的準(zhǔn)確度和精密度，使測量結(jié)果可溯源至SI單位，為人源瘦素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制奠定了基礎(chǔ)。

人源瘦素；準(zhǔn)確定量；同位素稀釋質(zhì)譜法；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；溯源性

人源瘦素（leptin，LP）是一種由肥胖基因編碼的蛋白質(zhì)類激素［1－2］，其原型包含167個氨基酸殘基，在分泌人血的過程中，去除21個N－末端信號肽中的殘基，形成含有146個氨基酸殘基的分泌型成熟瘦素，其相對分子質(zhì)量為16 ku［3－5］，無糖基化［4］。人源瘦素主要產(chǎn)生于脂肪組織，并在胎盤、卵巢、乳腺上皮細胞、骨髓和淋巴組織中表達［6－8］，至少有6種受體，這些受體在脂肪細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、睪丸間質(zhì)細胞、脈絡(luò)叢、下丘腦和骨骼肌細胞中均有表達［9］。人源瘦素通過與其特異性受體結(jié)合，可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在涉及肥胖、食欲、食物攝取、能量消耗和維持機體能量平衡中起重要作用［10］。自發(fā)現(xiàn)瘦素以來，科研工作者做了大量的基礎(chǔ)和臨床研究，發(fā)現(xiàn)瘦素在肺癌［11］、結(jié)腸癌［12］、乳腺癌［13］等惡性腫瘤及睡眠障礙［3］中高表達，有誘激腫瘤細胞增殖，促進腫瘤血管生成及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等作用［14］。

目前，人源瘦素在許多疾病中的作用及機理研究仍處于起步階段，臨床常用酶聯(lián)免疫法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）體外檢驗人源瘦素［10－11］，但此方法耗時長、費用高、操作復(fù)雜，且不同廠家提供的試劑盒檢測結(jié)果不具有跨時空的可比性。因此，亟需建立人源瘦素的參考測量方法，并研制出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以使人源瘦素的標(biāo)準(zhǔn)化檢測得以實現(xiàn)。

同位素稀釋質(zhì)譜法是目前國際公認的測量微量、痕量和超痕量元素的權(quán)威方法［15］。將已知質(zhì)量和豐度的穩(wěn)定同位素作為稀釋劑加入樣品中，混合均勻后用質(zhì)譜測定混合前后同位素豐度的變化，由此可計算出樣品中該元素的含量。目前，此方法已應(yīng)用于前列腺特異抗原［16－17］、C－反應(yīng)蛋白等定量工作中，并獲得了與酶聯(lián)免疫法一致的檢測結(jié)果，線性相關(guān)系數(shù)R2＝0．97，且檢測限可降低10倍［18－19］。

本工作擬建立同位素稀釋質(zhì)譜法定量測定人源瘦素的絕對含量，使檢測結(jié)果可溯源至SI單位制，為建立人源瘦素的標(biāo)準(zhǔn)定值體系及研制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1．1 主要儀器與裝置

Agilent 6410型高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；XP26型分析天平（最大量程22g，精度0．001mg）：瑞士Mettler－Toledo公司產(chǎn)品；ME235S型分析天平（最大量程230g，精度0．01mg）：德國Sartorius公司產(chǎn)品；UFE500型烘箱：德國Memmert公司產(chǎn)品；Vacucell型真空干燥箱：德國MMM公司產(chǎn)品；N－EVAP111型氮吹儀：美國Organomation公司產(chǎn)品；渦旋震蕩儀：美國Scilogex公司產(chǎn)品；垂直電泳槽：美國伯樂公司產(chǎn)品；KS260型搖床：德國IKA公司產(chǎn)品；Milli－Q型超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI－TOF－MS）：德國Bruker公司產(chǎn)品。

1．2 主要材料與試劑

人源瘦素（純度98％）：美國Pepro Tech公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純）：美國J．T Baker公司產(chǎn)品；三氟乙酸（色譜純）、全氟庚酸：美國Sigma公司產(chǎn)品；甲酸（分析純）、鹽酸（優(yōu)級純）、冰醋酸（優(yōu)級純）：北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；纈氨酸（Val，純度99．0％，GBW（E）100055）、脯氨酸（Pro純度99．0％，GBW（E）100084）、亮氨酸（Leu純度99．0％，GBW（E）100058）：由中國計量科學(xué)研究院提供；13C5－L－纈氨酸、13C5－L－

脯氨酸、13D10－L－亮氨酸（純度98％）：美國CIL公司產(chǎn)品；蛋白預(yù)制膠：美國伯樂公司產(chǎn)品；Tris base（優(yōu)級純）：美國Angus公司產(chǎn)品；甘氨酸（優(yōu)級純）：中國Solarbio公司產(chǎn)品；十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；蛋白銀染試劑盒：中國康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；彩虹預(yù)染寬分子質(zhì)量蛋白Marker（10－260KD）：中國中科泰瑞公司產(chǎn)品。

1．3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）實驗

將蛋白質(zhì)預(yù)制膠放入垂直電泳槽內(nèi)，倒入電泳緩沖液，充分浸泡預(yù)制膠后，將人源瘦素樣品和上樣緩沖液以1∶1的比例加入1．5mL離心管中，混勻，離心，然后在100℃水浴鍋中煮10min，取出后離心；將彩虹預(yù)染寬分子質(zhì)量蛋白Marker從－20℃取出，放至室溫，離心待用。

加入人源瘦素樣品和蛋白Marker后，設(shè)置電泳電壓100V，時間50min。電泳完成后，按照蛋白銀染試劑盒說明書進行銀染。

1．4 MALDI－TOF－MS檢測人源瘦素的相對分子質(zhì)量

配制基質(zhì)溶液1：芥子酸（sinapic acid，SA）在乙醇中的飽和溶液，離心后取上清液；配制基質(zhì)溶液2：SA溶于TA30（30％乙腈溶于0．1％ TFA）的飽和溶液，離心后取上清液。取0．5μL基質(zhì)溶液1點板，自然晾干后，取1μL樣品與基質(zhì)的等比混合液點板，待測。

1．5 同位素稀釋質(zhì)譜法定量測定人源瘦素

1．5．1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的配制 1）精確稱取0．49mg人源瘦素于958．29mg水中，配制成濃度為0．511 1mg／g的人源瘦素儲備液；2）分別配制脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸混合儲備液及其同位素標(biāo)記的氨基酸混合儲備液；3）取25μL人源瘦素儲備液并稱重，加入一定量標(biāo)記的混合氨基酸儲備液，使之與人源瘦素水解后的氨基酸含量比值約為1；4）配制低標(biāo)溶液：分別量取非標(biāo)記的氨基酸和標(biāo)記的氨基酸混標(biāo)溶液并稱重，使兩者含量比值約為0．8；5）配制高標(biāo)溶液：分別量取非標(biāo)記的氨基酸和標(biāo)記的氨基酸混標(biāo)溶液并稱重，使兩者含量比值約為1．2。

1．5．2 樣品水解條件 將準(zhǔn)確稱量的1．5．1節(jié)中的樣品（3）置于40℃真空干燥箱中烘干，待樣品冷卻至室溫后，加入500μL 6mol／L鹽酸，通氮除氧，密封，置于（110±0．5）℃烘箱中水解40h；水解后的樣品用氮吹儀吹干，用1 000μL 0．1％甲酸水溶液復(fù)溶；經(jīng)0．22μm濾膜過濾后，用液相色譜－質(zhì)譜儀測定。

1．5．3 色譜條件 色譜柱：Agilent SB－Aq C18柱（150mm×2．1mm×5μm）；進樣量8μL；柱溫40℃；流動相：0．8mmol／L全氟庚酸和0．05％三氟乙酸的水溶液（A），乙腈（B）；流動相梯度列于表1。

表1 定量測定人源瘦素的流動相梯度Table 1 The gradient solutions for human leptin quantitation

1．5．4 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI），正離子掃描模式，干燥氣流速8L／min，毛細管溫度350℃，毛細管電壓4 000V，多離子監(jiān)測模式（MRM）。對于脯氨酸，分別監(jiān)測m／z 116＞m／z70（Pro）和m／z121＞m／z74（標(biāo)記Pro）離子對；對于纈氨酸，分別監(jiān)測m／z 118＞m／z 72（Val）和m／z123＞m／z 76（標(biāo)記Val）離子對；對于亮氨酸，分別監(jiān)測m／z132＞m／z86（Leu）和m／z142＞m／z 96（標(biāo)記Leu）離子對，通過同位素稀釋質(zhì)譜法進行定量測定。

1．5．5 人源瘦素含量的計算 采用同位素稀釋質(zhì)譜法測定人源瘦素的含量，氨基酸的濃度ca（μg／g）按式（1）進行計算：

式中：P為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度；PH為人源瘦素的水解效率（實驗?zāi)J人源瘦素在最優(yōu)化條件下完全水解）；m標(biāo)為所加標(biāo)記氨基酸的質(zhì)量（g）；R樣為樣品中氨基酸和同位素標(biāo)記氨基酸的峰面積比；I1為低標(biāo)溶液中氨基酸和同位素標(biāo)記氨基酸的質(zhì)量比；I2為高標(biāo)溶液中氨基

酸和同位素標(biāo)記氨基酸的質(zhì)量比；R1為低標(biāo)溶液中氨基酸和同位素標(biāo)記氨基酸的峰面積比；R2為高標(biāo)溶液中氨基酸和同位素標(biāo)記氨基酸的峰面積比；M為所加樣品質(zhì)量（g）。

將ca代入式（2），計算人源瘦素的濃度cLP（μg／g）：

式中：NLP為人源瘦素的分子質(zhì)量；n為人源瘦素蛋白序列中對應(yīng)的氨基酸個數(shù)（其中，脯氨酸6個，纈氨酸11個，亮氨酸23個）；Na為氨基酸的分子質(zhì)量。

按照式（3）計算人源瘦素的質(zhì)量分數(shù)A：

式中：A為人源瘦素蛋白的質(zhì)量分數(shù)（g／g）；mLP為稱取人源瘦素蛋白的質(zhì)量（g）；m水為溶解人源瘦素蛋白的水的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

2．1 人源瘦素的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

人源瘦素的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果示于圖1。可以看出，在樣品點樣通道上除了人源瘦素條帶外并無其他明顯的條帶出現(xiàn)，表明樣品中人源瘦素蛋白的純度較高，無其他雜質(zhì)蛋白質(zhì)存在，因此，利用蛋白水解－同位素稀釋質(zhì)譜法進行定量檢測的結(jié)果較為可信。由于蛋白形態(tài)的不同，會導(dǎo)致其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移速率不同，因此，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的人源瘦素相對分子質(zhì)量的結(jié)果會有偏差。

2．2 MALDI－TOF－MS檢測人源瘦素樣品相對分子質(zhì)量的結(jié)果

通過MALDI－TOF－MS對人源瘦素樣品進行檢測，得到樣品的分子質(zhì)量為16 160u，示于圖2。該結(jié)果與人源瘦素的理論相對分子質(zhì)量一致，這為下一步的同位素稀釋－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測人源瘦素樣品的計算奠定了基礎(chǔ)。

圖1 人源瘦素的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig．1 SDS－PAGE of the human leptin

圖2 MALDI－TOF－MS檢測人源瘦素分子質(zhì)量的質(zhì)譜圖Fig．2 Mass spectrogram of the human leptin detected by MALDI－TOF－MS

2．3 人源瘦素水解后的氨基酸的高效液相色譜分離結(jié)果

采用MRM監(jiān)測人源瘦素水解后的脯氨酸、纈氨酸和亮氨酸離子對，3種氨基酸可被高效液相色譜完全分離，譜圖示于圖3。

2．4 人源瘦素的水解時間

水解時間過長或者過短都會導(dǎo)致樣品水解不完全，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。對9個平行樣品檢測不同水解時間的氨基酸含量，結(jié)果示于圖4?？梢钥闯觯鈺r間為40h時，人源瘦素蛋白水解達到平衡，進一步水解會導(dǎo)致氨基酸含量的略微降低。因此，確定水解時間為40h。

2．5 同位素稀釋質(zhì)譜法測定人源瘦素的含量

分別測定6個平行樣品，根據(jù)檢測結(jié)果，按式（4）分別由3種氨基酸濃度計算人源瘦素蛋白的含量，結(jié)果列于表2。

由表2可知，6個樣品中由脯氨酸、纈氨酸和亮氨酸計算得到的人源瘦素質(zhì)量分數(shù)的平均值分別為0．638、0．531、0．577g／g，取三者的平均值得到高效液相色譜－同位素稀釋－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人源瘦素的質(zhì)量分數(shù)為0．582g／g，

6個樣品測定結(jié)果的RSD為5．2％，說明此方法檢驗人源瘦素的重復(fù)性較好。

圖4 人源瘦素水解效率隨時間的變化Fig．4 The hydrolysis efficiency of human leptin changes with time

表2 由同位素稀釋質(zhì)譜法檢測所得的氨基酸濃度計算人源瘦素蛋白的質(zhì)量分數(shù)Table 2 Human leptin mass fraction calculated by the concentration of amino acids determined through IDMS

采用高效液相色譜法檢測人源瘦素樣品的純度為94．01％，其中包括水分、灰分等無紫外吸收的成分，因此取6個樣品于真空干燥箱中，每隔4h稱重至恒重，計算得出樣品中的水分為28％；使用ICP－MS法對樣品中的無機元素進行半定量檢測，得出人源瘦素樣品中的無機元素含量為15．8％；利用純度扣除法按式（4）計算得出人源瘦素的質(zhì)量分數(shù)為52．8％。由同位素稀釋－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測計算得出人源瘦素的質(zhì)量分數(shù)為58．2％，該結(jié)果與純度扣除法相比，相對偏差為4．8％。由于純度扣除法并非準(zhǔn)確定量的方法，存在無法避免和校正的操作誤差和系統(tǒng)誤差，而同位素稀釋質(zhì)譜法是根據(jù)蛋白序列中水解得出的氨基酸來進行檢測和計算，通過加入同位素標(biāo)記物，利用括弧法，即高標(biāo)－樣品－低標(biāo)－樣品的順序進樣檢測，可有效地降低樣品前處理及儀器信號漂移對結(jié)果造成的影響，且在定量過程中通過準(zhǔn)確稱量和采用氨基酸國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使檢測結(jié)果可溯源至SI單位制，因此，同位素稀釋質(zhì)譜法具有更高的準(zhǔn)確度。

2．6 人源瘦素含量測定結(jié)果的不確定度評價

2．6．1 人源瘦素相對分子質(zhì)量的不確定度

人源瘦素由146個氨基酸構(gòu)成，其中含有709個C原子，1 168個H原子，190個N原子、218個O原子和5個S原子。根據(jù)IUPAC給出的各元素的原子質(zhì)量及其不確定度，可以計算出其標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果列于表3。

表3 人源瘦素中含有元素的原子質(zhì)量及其標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 3 Standard uncertainties of the elements in human leptin

根據(jù)表3可計算人源瘦素蛋白摩爾質(zhì)量的不確定度，示于式（5）。

該結(jié)果與人源瘦素的相對分子質(zhì)量相比遠小于0．1％，因此可忽略不計。

2．6．2 人源瘦素蛋白濃度c的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（c）

1）由脯氨酸濃度計算得出的人源瘦素蛋白濃度值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（cpro）可由式（6）計算。

式中，urA（cPro）是脯氨酸濃度測量結(jié)果引入的A類不確定度，由為測量次（B類不確定度）是由水解效率引入的不確定度，由水解時間優(yōu)化實驗可知，當(dāng)水解時間達到40h時，水解達到平衡，計算水解40、48、63、72 h所得的人源瘦素質(zhì)量分數(shù)的RSD值為1％，即ur（HPro）為1％；ur（PPro）（B類不確定度）是由脯氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對不確定度，由脯氨酸國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)證書得到其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1．5％。

經(jīng)計算，ur（cPro）＝2．0％。

需要說明的是，用精度為0．001mg的天平稱量（0．5～1）mg樣品，用精度為0．01mg的天平稱量（100～200）mg樣品，天平稱量的相對不確定度小于0．1％，可忽略不計。

2）同上計算出纈氨酸和亮氨酸濃度值的相對不確定度ur（cVal）和ur（cLeu）。

3）人源瘦素蛋白濃度c的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由式（7）計算：

4）計算得出人源瘦素蛋白濃度c的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1．4％，結(jié)果列于表4。

2．6．3 人源瘦素的質(zhì)量分數(shù)定值的不確定度

人源瘦素的質(zhì)量分數(shù)A由式（3）計算得出，其中mLP和m水由精度為0．01mg的天平稱量得出，稱量質(zhì)量為（25～200）mg，其不確定度小于0．1％，可忽略不計，得到其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（A）＝ur（c）＝1．4％。因此，人源瘦素蛋白質(zhì)量分數(shù)的相對擴展不確定度為ur（A）＝k×ur（A）＝2×1．4％＝2．8％（k＝2），標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（A）＝ur（A）×A＝1．4％× 0．474＝0．007（g／g），其擴展不確定度U（A）＝u（A）×k＝0．014g／g?？傻玫饺嗽词菟氐鞍椎馁|(zhì)量分數(shù)為0．474g／g，其擴展不確定度為0．014g／g。所得擴展不確定度約為人源瘦素質(zhì)量分數(shù)的2．9％，誤差較小，表明利用高效液相色譜－同位素稀釋－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人源瘦素樣品的結(jié)果較為準(zhǔn)確。

表4 同位素稀釋質(zhì)譜法檢測人源瘦素含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 4 Standard uncertainties of human leptin quantified by IDMS

3 結(jié)論

建立了蛋白水解－高效液相色譜－同位素稀釋－串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確測定人源瘦素純品絕對含量的方法。結(jié)合人源瘦素的氨基酸序列，選擇了較為經(jīng)濟、穩(wěn)定且易于購買的脯氨酸、亮氨酸和纈氨酸及其同位素標(biāo)記物來定量人源瘦素樣品。在110℃條件下，人源瘦素在6mol／L鹽酸溶液中水解40h可達到完全水解。利用同位素稀釋－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測瘦素的質(zhì)量分數(shù)為0．582g／g，對定值結(jié)果進行不確定度評估，得到測量結(jié)果的擴展不確定度為0．014g／g（k＝2），約為人源瘦素樣品質(zhì)量分數(shù)的2．9％，誤差較小。與純度扣除法檢測人源瘦素的結(jié)果相比，相對偏差為4．8％。該定值方法可使人源瘦素蛋白的定值結(jié)果通過氨基酸溯源至SI單位，為人源瘦素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究及標(biāo)準(zhǔn)測量方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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Quantification of Human Leptin by HPLC－IDMS

SUN Xue－qing1，2，HU Gao－fei1，SONG De－wei2，TIAN Ya－ping3，YAN Guang－tao3，XU Bei2，LI Hong－mei2
（1．Beijing University of Chemical Technology，Beijing100029，China；2．National Institute of Metrology，Beijing100013，China；3．Department of Clinical Biochemistry，PLA General Hospital，Beijing100853，China）

A method for the absolute quantification of human leptin was established by high performance liquid chromatography－isotope dilution mass spectrometry（HPLCIDMS）．The hydrolysis conditions optimized were 40hwith 6mol／L HCl at 110℃．After hydrolysis，the sample was separated by HPLC，the transitions of proline（m／z116＞m／z70）and proline－C5（m／z121＞m／z 74），valine（m／z 118＞m／z 72）and valine－C5

human leptin；absolutely quantification；isotope dilution mass spectrometry（IDMS）；certified reference material（CRM）；traceability

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0016－07

10．7538／zpxb．youxian．2014．0048

2014－02－08；

2014－05－08

科技部重大項目863計劃（2011AA02A111）；國家自然科學(xué)基金（21275134）；科技部基礎(chǔ)性工作專項（2011FY130100）資助

孫雪晴（1990—），女（漢族），河南人，碩士研究生，化學(xué)專業(yè)。E－mail：sunxq＿89＠163．com

宋德偉（1976—），男（漢族），黑龍江人，副研究員，從事蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究。E－mail：songdw＠nim．a(chǎn)c．cn胡高飛（1977—），男（漢族），安徽人，副教授，從事色譜、波譜分析方法及應(yīng)用研究。E－mail：hugf＠m(xù)ail．buct．edu．cn

時間：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0048．html

（m／z123＞m／z76），leucine（m／z 132＞m／z 86）and leucine－D10（m／z 142＞m／z 96）were monitored for quantitation by MRM mode．The content of human leptin was calculated to be 0．582g／g with the uncertainty of 0．014g／g（k＝2）．The calculated results are further validated by the purity deduction assay．It shows good consistency between the results of the two methods．In conclusion，application of this method for quantification of leptin will improve the precision，accuracy and lay the foundation for the future research of reference material of leptin．