陳肖東，蘇 峰，畢東輝，桂雙英，何廣衛(wèi)

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230031;2.合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，安徽合肥 230088)

癲癇是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是由大腦神經(jīng)細(xì)胞異常放電導(dǎo)致的突發(fā)性、反復(fù)性和短暫性的大腦功能失調(diào)。世界衛(wèi)生組織 (WHO)估計(jì)全世界大約有5 000多萬患者，我國(guó)癲癇發(fā)病率約為1‰，患病率約為5‰［1］。癲癇的反復(fù)發(fā)作對(duì)家庭和社會(huì)都造成極大的負(fù)擔(dān)和危害。

雙丙戊酸鈉(Divalproex Sodium)是目前抗癲癇治療的一線藥物。藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)各種癲癇的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?(全身性和部分性)均有抗驚厥作用。對(duì)人的各種類型癲癇發(fā)作有抑制作用。其主要的作用機(jī)制可能是抑制了γ-氨基丁酸 (GABA)降解過程中GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶活性，從而使腦內(nèi)GABA含量增高所致［2］。與丙戊酸鈉相比，雙丙戊酸鈉由于胃腸道副反應(yīng)更輕、毒性更小、藥物相互作用較少，已取代了傳統(tǒng)丙戊酸鈉的市場(chǎng)地位［3］。雙丙戊酸鈉腸溶片治療癲癇每日用量600 ～1 200 mg，服用2～3次，服藥頻率較高，導(dǎo)致患者依從性較差。目前國(guó)外已有雙丙戊酸鈉緩釋片上市，國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道。

國(guó)內(nèi)制劑工藝優(yōu)化和處方篩選常用均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)，但該兩種方法實(shí)驗(yàn)精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較差。采用固定其他因素改變某一因素的單因素考察法能收到一定效果，但條件優(yōu)選憑經(jīng)驗(yàn)，且無法考察各因素間的相互作用［4］。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)常用于考察多個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響，優(yōu)選主要影響因素;星點(diǎn)設(shè)計(jì)具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高等特點(diǎn)，常結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化考察因素。目前三者聯(lián)合應(yīng)用較成熟［5－9］，可以為制劑處方篩選提供依據(jù)。

本文用美國(guó)雅培公司 (Abbott)生產(chǎn)的雙丙戊酸鈉緩釋片 (商品名:Depakote?)為參比制劑，基于Plackett-Burman試驗(yàn)優(yōu)選的主要影響因素，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)選雙丙戊酸鈉緩釋片處方，制成每天給藥一次的雙丙戊酸鈉緩釋片(每片250 mg)，避免普通制劑服用后，血藥濃度的波峰波谷現(xiàn)象，同時(shí)減少服藥次數(shù)，方便臨床用藥，為骨架緩釋片的處方篩選提供新思路。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 ZRS-8G智能溶出儀 (天津市天大天發(fā)科技有限公司);安捷倫8453紫外分光光度計(jì) (安捷倫科技有限公司);島津LC-15C高效液相色譜儀、SPD-15C紫外檢測(cè)器及LCsolution Lite色譜工作站(島津制作所);ZDY-8重型單沖壓片機(jī)(上海遠(yuǎn)東制藥機(jī)械總廠);Delta 320pH計(jì) (Mettler-Toledo儀器有限公司);XS105分析天平(Mettler-Toledo儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 雙丙戊酸鈉原料藥 (合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，含量99.37%，批號(hào)20130601);雙丙戊酸鈉緩釋片 (美國(guó)雅培公司，批號(hào):1015725);HPMC K100M、HPMC K15M(上海卡樂康包衣技術(shù)有限公司);乳糖 (安徽山河藥用輔料股份有限公司);微晶纖維素 (安徽山河藥用輔料股份有限公司);PEG6000(天津天成制藥);鹽酸(上海振企化學(xué)試劑有限公司);氫氧化鈉 (天津星馬克科技有限公司);乙腈(百靈威科技有限公司，色譜純);甲醇(百靈威科技有限公司，色譜純)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 釋放度分析方法的建立 按照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)官方網(wǎng)站上公布的“固體制劑溶出曲線數(shù)據(jù)庫(kù)”關(guān)于原研制劑雙丙戊酸鈉緩釋片的溶出方法，同時(shí)依據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心關(guān)于仿制藥體外溶出實(shí)驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則，本次研究選擇FDA推薦的pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液作為本品釋放度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)，體積為900 mL，轉(zhuǎn)速為100 r·min－1。

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取雙丙戊酸鈉對(duì)照品適量，用標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)溶解并定量稀釋成每1 mL中約含雙丙戊酸鈉10 μg的溶液，照紫外—可見分光光度法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄IV A)，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱定雙丙戊酸鈉對(duì)照品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)溶解至刻度，得濃度為1 g·L－1的貯備液。精密量取5 mL貯備液至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，再分別精密量取上述溶液 1、2、3、5、10、25 mL 于100 mL容量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)稀釋到刻度，以標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)為空白，照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版二部附錄V D)測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。

2.1.3 精密度及中間精密度試驗(yàn) 取雙丙戊酸鈉緩釋片劑細(xì)粉適量，精密稱定，加標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)稀釋成每1 mL約含雙丙戊酸鈉0.2 mg的溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，考察方法的精密度，同時(shí)在此操作條件下，分別由不同實(shí)驗(yàn)人員在不同天進(jìn)行測(cè)定，考察方法的中間精密度。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取雙丙戊酸鈉片劑細(xì)粉適量，精密稱定，加入標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)溶解并稀釋成每1 mL含雙丙戊酸鈉0.2 mg的溶液，分別于0、2、4、6 和8 h測(cè)定，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。

2.1.5 回收率試驗(yàn) 按處方量的80%、100%、120%分別精密稱取雙丙戊酸鈉對(duì)照品，按處方比例加入輔料混勻，置200 mL容量瓶中，加入標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1 mL置50 mL容量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，進(jìn)高效液相色譜儀并計(jì)算回收率，記錄峰面積，計(jì)算回收率。

2.2 雙丙戊酸鈉緩釋片的制備 將雙丙戊酸鈉原料過100目篩與HPMC K100M、HPMC K15M、乳糖、PEG6000充分混合，以乙醇作為潤(rùn)濕劑制軟材，20目篩制粒、烘干、20目篩整粒，混合均勻后壓片，片重約650 mg。

2.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選主要影響因素 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種兩水平的析因設(shè)計(jì)，可從較多因素中篩選出少數(shù)重要因素。每個(gè)因素取兩水平，通過比較兩水平之間的差異性來確定因子的顯著性，對(duì)于N次實(shí)驗(yàn)至多可研究N－1個(gè)因子，但實(shí)際因子應(yīng)該不多于N－4個(gè)，保留3個(gè)以上虛擬變量用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

因素及水平范圍:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用HPMC K100M和HPMC K15M作為緩釋片的骨架材料，微晶纖維素和乳糖作為填充劑，乙醇作為潤(rùn)濕劑，PEG6000作為潤(rùn)滑劑，選取7個(gè)實(shí)驗(yàn)因素(A:HPMC K15M用量、B:HPMC K100M用量、C:微晶纖維素的用量、D:乳糖用量、E:乙醇濃度、F:干燥時(shí)間、G:硬度)和 4個(gè)空白因素 (H、I、J、K)，合計(jì) 12 次實(shí)驗(yàn)［4］。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定每個(gè)因素高、低兩個(gè)水平。用Design-expert 8.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素與水平

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化處方 雙丙戊酸鈉緩釋片的規(guī)格是每片250 mg，主藥占40%。Plackett-Burman試驗(yàn)表明HPMC K100M和HPMC K15M的量和潤(rùn)濕劑乙醇的濃度是影響片劑釋放的主要因素。

根據(jù) Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，采用HPMC K100M 用量(X1，mg)、HPMC K15M 用量(X2，mg)和乙醇濃度(X3，%)作為考察因素，查詢FDA規(guī)定HPMC K100M和HPMC K15M作為口服緩釋片處方最高用量分別為320 mg和80.25 mg，作為骨架材料的常規(guī)用量為不低于片重的25%。故其范圍為:X1:162.5～320 mg;X2:0 ～80.25 mg;X3:10%～90%。為與原研制劑的片重保持一致，自研片重應(yīng)在合理范圍內(nèi)波動(dòng)，不足部分用乳糖填充。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，各因素設(shè)置5水平，該設(shè)計(jì)是在兩水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上極值和中心點(diǎn)構(gòu)成的，其代碼分別為 0、±1、±α，α=(F)1/4，F(xiàn)=2k(k為因素?cái)?shù))為析因設(shè)計(jì)部分試驗(yàn)次數(shù)［4］。對(duì)于三因素的星點(diǎn)設(shè)計(jì)，以緩釋片的綜合評(píng)分L值和相似因子f2值作為考察指標(biāo)，采用Design Expert 8.0安排實(shí)驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。因素及水平表見表2，具體實(shí)驗(yàn)方案見表5。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的因素和水平

參照《中國(guó)藥典》2010版二部附錄XIX D緩釋、控釋和遲釋制劑指導(dǎo)原則的規(guī)定，采用累積釋放度綜合評(píng)分法，對(duì)不同處方3、9、12、18 h四點(diǎn)的釋放度進(jìn)行評(píng)分，將評(píng)分結(jié)果進(jìn)行加權(quán)相加后得出總分，各點(diǎn)的評(píng)分方法參照美國(guó)藥典(USP)標(biāo)準(zhǔn)，3、9、12、18 h 的釋放度以 15%、55%、65%、75%，各點(diǎn)權(quán)重均設(shè)為1，總分的計(jì)算公式為:

L=︱P3－15%︱+︱P9－55%︱+︱P15－61%︱+︱P18－75%︱，L值越小，因素的水平數(shù)越佳。

采用相似因子法［10］，是指實(shí)驗(yàn)制劑與對(duì)照制劑的累積釋放度差的平方和最小。計(jì)算公式如下:

式中n為取樣點(diǎn)總數(shù)，Rt和Tt分別為參比、實(shí)驗(yàn)制劑的在t時(shí)的平均釋放度。f2值越接近100，曲線的相似性越好，f2大于50(50～100)說明兩條曲線相似。

對(duì)于因變量L值要求越小越好，而對(duì)于f2值則要求越大越好?？紤]到當(dāng)f2值最大時(shí)L值并不一定最小，選擇總評(píng)“歸一值”法 (overall desirability，OD)，即將每個(gè)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的數(shù)值，各指標(biāo)“歸一值”求算幾何平均數(shù)，得總評(píng)“歸一值”。對(duì)于綜合評(píng)分法和相似因子法采用Hassan方法分別進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”［11］。OD值越大，因素水平數(shù)越佳。

以HPMC K100M和HPMC K15M用量和乙醇濃度為自變量，總評(píng)“歸一值”為因變量，進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式回歸，并以擬合優(yōu)度(r)和置信度(P)作為模型判定標(biāo)準(zhǔn)。擬合方程為

多元線性模型:

二次多項(xiàng)式模型:

由擬合所得到的模型繪制因素X1、X2、X3對(duì)指標(biāo)的效應(yīng)面圖和等高線圖。通過固定三個(gè)自變量中之一為中值，以總評(píng)“歸一值”為因變量相對(duì)于另外兩個(gè)自變量繪制效應(yīng)面三維圖，最后根據(jù)效應(yīng)面優(yōu)選處方［12］。

3 結(jié)果和討論

3.1 釋放度分析方法 雙丙戊酸鈉對(duì)照溶液均在210 nm附近有最大吸收，且輔料在此范圍內(nèi)無明顯吸收，對(duì)主藥測(cè)定無干擾。以吸光度A對(duì)濃度C進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程 A=2.17 ×10－2C －1.7×10－3，r=0.999 8 結(jié)果表明雙丙戊酸鈉在濃度 0.410～12.64 mg·L－1線性關(guān)系良好，精密度、中間精密度、溶液穩(wěn)定性均較好，回收率在96% ～104%范圍內(nèi)，說明本研究所采用的釋放度方法學(xué)準(zhǔn)確度高。

3.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 7個(gè)因素與4個(gè)空白因素合計(jì)12次實(shí)驗(yàn)，按照Plackett-Burman設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)試驗(yàn)號(hào)重復(fù)3次，計(jì)算f2值。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值見表3。運(yùn)用Design-expert 8.0軟件對(duì)各因素進(jìn)行顯著性分析，見表4。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析

結(jié)果顯示P＜0.05的因素為主要影響因素［6］。結(jié)論:對(duì)各因素的顯著性分析可以看出，各因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性順序?yàn)锽＞A＞E＞G＞C＞D＞F，顯著性因素為 B(HPMC K100M)、A(HPMC K15M)和E(乙醇濃度)。

3.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法

3.3.1 模型擬合 根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，確定因素水平見表2，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及研究結(jié)果，如L值、f2值和OD值，見表5。

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用多元線性模型對(duì)各影響因素和指標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，其方程如下:

采用二次多項(xiàng)式對(duì)各影響因素和指標(biāo)進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合，方程如下:

為了保證模型擬合良好，需要檢查回歸模型的顯著性、模型系數(shù)的顯著性和失擬項(xiàng)的顯著性［13］。方差分析結(jié)果見表6，通常情況下，F(xiàn)值越大，P值越小，對(duì)應(yīng)的模型系數(shù)就越顯著，F(xiàn)值的失擬項(xiàng)為2.34相對(duì)于純誤差不顯著，校正擬合度和預(yù)測(cè)擬合度相關(guān)性良好，信噪比為20.501＞4等均表明回歸方程可以很好的預(yù)測(cè)因素和效應(yīng)值的關(guān)系。由擬合模型的r值可以看出多元線性模型擬合較差，二次多項(xiàng)式模型擬合較好，對(duì)系數(shù)采用置信度P＞0.05為不顯著，剔除不顯著的模型系數(shù)，由表6可知剔除系數(shù)A、B。優(yōu)化后模型的r值沒有明顯減小，所以模型仍具有較高可信度，優(yōu)化后的方程為:

表6 二次模型響應(yīng)面的方差分析

3.3.2 效應(yīng)面優(yōu)化 選擇優(yōu)化后的方程為模型，應(yīng)用Design Expert 8.0軟件，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，固定3個(gè)自變量中1個(gè)為中值，其他2個(gè)自變量為橫坐標(biāo)，繪制三維效應(yīng)面 (response surface)圖［15］，如圖1～3。

由圖1可見，在一定范圍內(nèi)，隨著 HPMC K100M用量增大，OD值增大，HPMC K15M對(duì)OD值有先增大后減小的趨勢(shì)。圖2中乙醇濃度增大，OD值增大，HPMC K100M增大，OD值增大，增大到某一值后，HPMC K100M反而減小，這是因?yàn)殡S著HPMC K100M用量增大所占片重比例增大，此時(shí)HPMC K15M和乙醇濃度已經(jīng)不能調(diào)節(jié)藥物的釋放，圖3中隨著K15M和乙醇濃度增大，OD值先增大后減小，但乙醇濃度對(duì)OD值的影響較HPMC K15M、HPMC K100M小，這也驗(yàn)證了 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果。

由效應(yīng)面優(yōu)化的基本原理選取較佳處方區(qū)域回推至因素的取值范圍［16］，由軟件自動(dòng)優(yōu)化后得到最佳處方結(jié)果為 HPMC K100M 286.72 mg，HPMC K15M 16.96 mg，乙醇濃度 27%。

3.3.3 處方驗(yàn)證 按優(yōu)化的處方制備3批雙丙戊酸鈉緩釋片，每批1 000片，按公式“偏差=(預(yù)測(cè)值－實(shí)際值)/預(yù)測(cè)值×100%”計(jì)算偏差，結(jié)果見表7，考察自研片三批與原研片在標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)中的累積釋放度，見圖4，說明所建模型具有很好的預(yù)測(cè)能力。

表7 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較(n=3)

4 討論

利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)用于固體制劑處方與工藝優(yōu)化的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。由于影響緩釋片釋放度的因素較多，如骨架材料的黏度和用量、填充劑的種類和用量、黏合劑的種類和用量、制備工藝、壓片的壓力等。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用了Plackett-Burman設(shè)計(jì)并運(yùn)用相似因子f2值為指標(biāo)篩選了影響雙丙戊酸鈉緩釋片的主要影響因素，并運(yùn)用多因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行非線性擬合，此種方法具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)［16］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二次多項(xiàng)式回歸對(duì)實(shí)驗(yàn)中各因素和指標(biāo)進(jìn)行擬合，優(yōu)化后相關(guān)系數(shù)(r)較佳，可以作為分析及預(yù)測(cè)的模型。同時(shí)通過效應(yīng)面優(yōu)化，從三維效應(yīng)面圖和二維等高線圖中可以得到較佳處方，按照較佳處方制備3批雙丙戊酸鈉緩釋片，各批的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的偏差均較小。

親水凝膠型骨架緩釋片研發(fā)的核心問題是骨架材料的種類以及用量的選擇。通過分別考察不同黏度的羥丙基甲基纖維素，發(fā)現(xiàn)采用單一的骨架材料難以滿足溶出實(shí)驗(yàn)的需求，因此本實(shí)驗(yàn)選取了HPMC K100M和HPMC K15M聯(lián)合作為骨架材料，其中HPMC K100M用于控制后半段藥物釋放速率，HPMC K15M用于提高前半段藥物釋放速率，使其能迅速達(dá)到治療窗口血藥濃度，兩者聯(lián)合可以有效的控制藥物的釋放［17－19］。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)潤(rùn)濕劑乙醇濃度對(duì)藥物釋放行為影響較大，不同濃度乙醇對(duì)溶出度的影響主要是通過影響顆粒的比表面積來影響藥物的釋放行為，高濃度的乙醇制粒，由于乙醇的揮發(fā)速率較快，顆粒表面的致孔作用較為明顯，使顆粒的比表面積增大，從而促進(jìn)藥物的釋放。

以往的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的考察都是以某個(gè)點(diǎn)或者某幾個(gè)點(diǎn)的釋放度作為指標(biāo)，這不能反應(yīng)出藥物的體內(nèi)外相關(guān)性，也不能完全體現(xiàn)原研制劑和自研制劑在內(nèi)在品質(zhì)的差異，給接下來的生物等效性實(shí)驗(yàn)埋下了隱患。目前通用的藥物溶出度評(píng)測(cè)指標(biāo)為相似因子f2，它反應(yīng)的是自研與原研樣品溶出曲線在圖形上的相似性，為了更好的比較原研與自研的差別，反映出兩者在內(nèi)在品質(zhì)上的相似性，本實(shí)驗(yàn)引入了L值作為第二個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，L值反映的是每個(gè)點(diǎn)自研和原研相比的波動(dòng)情況。由于相似因子f2值的最佳與L值最佳不一定完全吻合，因此本實(shí)驗(yàn)選擇總評(píng)“歸一值”進(jìn)行最終評(píng)價(jià)。

在骨架型緩釋片的研究中引入Plackett-Burman設(shè)計(jì)聯(lián)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以大大的減少處方實(shí)驗(yàn)的數(shù)量，同時(shí)對(duì)藥物的溶出特性有了科學(xué)而全面的認(rèn)識(shí)，對(duì)于提高我國(guó)的仿制藥行業(yè)的水平有著重要意義。

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