桑婷婷，高曉平，李光武，阮 元

(1.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院康復運動科，安徽合肥 230022;2.安徽醫(yī)科大學神經(jīng)生物研究所，安徽合肥 230032)

自閉癥，又稱孤獨癥，是以社會交往障礙和局限性、刻板性、重復性行為為主要特征，是廣泛性發(fā)育障礙中最有代表性的疾病之一［1］，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。其中社會交往障礙也是自閉癥患者達到最終康復目標回歸社會的最大阻礙，目前暫無針對性的有效藥物。丁香酚精油是由丁香中提取，為其主要活性成分，是一種抗氧化劑，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗抑郁［2］、改善認知［3］等功效。本研究通過觀察丁香酚精油通過嗅覺通路對丙戊酸鈉(VPA)自閉癥模型鼠社交行為的影響，從而進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 自閉癥模型制備及評定 健康成年清潔級Sprague-Dawy(SD)雄性(280～300 g)、雌性(220～250 g)大鼠，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，充足水和食物飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周，依據(jù)文獻［4］的造模方法，按雌雄比2∶1于下午5時合籠，次日早晨8時行陰道涂片檢查是否存在精子，存在時記錄為妊娠第1天(E1)，孕鼠分籠飼養(yǎng)，于E12.5 d時給予模型組孕鼠腹腔注射 (VPA)600 mg·kg－1(用生理鹽水配成250 g·L－1溶液);對照組給予等量生理鹽水(NS)注射。模型組及鹽水對照組孕鼠產(chǎn)下仔鼠分別記為 VPA組、NS組;以出生當天為生后第1天(P1)。記錄自閉癥模型組及對照組發(fā)育學情況:P7，P14，P21體重、P12～16睜眼時間，P8、P10、P12、P16 游泳能力及 P7 ～10 趨向能力等行為表現(xiàn)，21 d斷奶后適應(yīng)飼養(yǎng)1周，采用社交實驗中社交次數(shù)和持續(xù)時間的記錄評估各組鼠社交情況。參照Schneider［5］，評估發(fā)育學及行為學確定造模是否成功。

1.2 社交行為 一個60 cm×40 cm×40 cm的黑色木箱，置于安靜的環(huán)境內(nèi)，用40 W紅光照明，分別對模型組和對照組大鼠進行檢測，要求參與測試的兩只鼠來自同一組，不同飼養(yǎng)箱，月齡、性別相同，體質(zhì)量差距控制在15 g內(nèi)，觀察10 min，記錄社交行為次數(shù)包括跟隨、追逐同伴、嗅生殖器、打斗、趴在鼠身上及頭—頭接觸等發(fā)生次數(shù)及持續(xù)時間，為減少對新環(huán)境的不適，實驗鼠在實驗前2 d放置于檢測籠內(nèi)5 min適應(yīng)，每天2次;為了激發(fā)出更多的社交行為，測試前1 d單獨隔離至少3.5 h。

1.3 實驗分組和干預方式 選擇成功造模的自閉癥模型鼠20只，隨機分為模型吸嗅組(VPA-E)和模型對照組(VPA-C)。吸嗅方法參考文獻［6］，丁香酚溶劑均勻地灑在密閉的實驗盒底部，上面放置一帶有許多孔的薄鐵欄柵。給藥時，首先使精油充分揮發(fā)，彌漫整個實驗盒內(nèi)，后將實驗動物放入，蓋上盒蓋，吸嗅30 min后取出動物，每天3次，共持續(xù)4周。丁香酚、蒸餾水以1∶999濃度配置，吸嗅組給予稀釋后丁香酚精油(安徽醫(yī)科大學神經(jīng)生物研究所提供)吸嗅，對照組吸嗅清潔空氣。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間不同時間點定量數(shù)據(jù)的比較采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析方法，多組間采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法，計數(shù)資料采用秩和檢驗，以P＜0.05，為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 發(fā)育及行為表現(xiàn)情況

2.1.1 發(fā)育情況 與NS組相比，VPA組鼠表現(xiàn)為各時間點低體重，差異具有統(tǒng)計學意義 P7［(11.29±1.48)g vs(9.92 ±1.26)g］、P14［(20.71 ±3.05)g vs(13.87 ± 1.86)g］、P21［(37.9 ± 4.88)g vs(30.8 ±2.39)g］，睜眼時間延遲，P12 天兩組仔鼠均未睜眼，P13～15自閉癥模型組的睜眼情況評分均低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義 P13［(0.00±0.00)分 vs(0.41 ±0.69)分］、P14［(0.45 ±0.69)分 vs(1.18 ±0.60)分］、P15［(1.18 ±0.75)分 vs(2.00 ±0.00)分］，P16 時兩組仔鼠雙眼均已睜眼。

2.1.2 行為表現(xiàn) VPA組趨向能力實驗中轉(zhuǎn)身所用時間較NS組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義 P7［(27.09 ±3.96)s vs(18.18 ±3.03)s］、P8［(23.3±5.20)s vs(13.18 ± 2.40)s］、P9［(17.18 ±3.573)s vs(8.6 ±1.80)s］、P10［(14.91 ±3.42)s vs(6.82 ±1.40)s］;游泳能力評分低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義 P8［(1.09 ±0.70)分 vs(2.27 ±0.65)分］、P12［(2.45 ±0.52)分 vs(3.45 ±0.52)分］，P10、P16天兩組仔鼠游泳能力無差異;社交試驗中P28天VPA組仔鼠在接觸次數(shù)及持續(xù)時間上均低于 NS組，P ＜0.05，接觸次數(shù)［(35.75 ±3.31)次 vs(19.58 ±4.87)次］、持續(xù)時間［(64.42 ±6.02)s vs(35.58 ±8.12)s］。

2.2 精油吸嗅后社交行為的變化情況 與NS組相比，VPA-C組接觸次數(shù)減少明顯，接觸持續(xù)時間明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與VPA-C組相比，VPA-E組接觸次數(shù)增加，持續(xù)時間延長，P ＜0.05。結(jié)果見表1，2。

表1 各組大鼠社交行為中接觸次數(shù)的比較(±s，次)

表1 各組大鼠社交行為中接觸次數(shù)的比較(±s，次)

注:與 VPA-C 組相比，#P ＜0.05;與 VPA-E 組比較，※P ＜0.05。

組別 N 干預后NS 10 55.41 ±3.23#※VPA-E 10 46.92 ±4.72#VPA-C 10 33.17 ±4.86

表2 各組大鼠社交行為中接觸持續(xù)時間的比較(±s，s)

表2 各組大鼠社交行為中接觸持續(xù)時間的比較(±s，s)

注:與 VPA-C 組相比，#P ＜0.05;與 VPA-E 組比較，※P ＜0.05。

組別 N 干預后NS 10 91.00 ±5.41#※VPA-E 10 82.83 ±5.89#VPA-C 10 61.08 ±9.10

3 討論

丙戊酸鈉是目前使用最廣泛的一種抗癲癇藥物，在雙向情感障礙及偏頭痛的治療中也有涉及。然而，VPA也是一種已知的致畸藥物，孕期尤其是器官形成期使用可引起胎兒神經(jīng)發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為認知功能障礙、行為問題和交流的障礙［7］。動物研究發(fā)現(xiàn)在胎鼠的神經(jīng)管閉合時間內(nèi)給予孕鼠單VPA干預可引起仔鼠發(fā)育及行為學異常，這與自閉癥患者臨床表現(xiàn)相近。本研究參照Schneider等［4］造模方法制備自閉癥動物模型，實驗結(jié)果顯示模型鼠存在明顯的發(fā)育學及行為學異常。與NS組相比，VPA組表現(xiàn)為低體重，睜眼時間延遲，游泳能力評分低水平，趨向?qū)嶒炛修D(zhuǎn)身所用時間明顯延長，社交實驗中表現(xiàn)為接觸次數(shù)的減少及持續(xù)時間縮短。與崔利軍等［8］的研究結(jié)果一致，本實驗自閉癥模型制備成功，證實VPA動物模型具有重復性好、良好的表面效度。

嗅覺是最原始的感覺之一，參與生物多種行為，如覓食、交流、情感等，其通路在腦內(nèi)投射范圍廣泛。氣味分子與嗅上皮的特異性G蛋白偶聯(lián)受體神經(jīng)元結(jié)合產(chǎn)生動作電位，沿軸突傳遞至嗅球，經(jīng)嗅覺通路到達情緒相關(guān)中樞下丘腦、杏仁核等［9］，產(chǎn)生對氣味的感受。杏仁核在社會行為和調(diào)整情緒中有著重要的作用，其相關(guān)結(jié)構(gòu)的功能紊亂可能參與自閉癥的神經(jīng)病理學［10］。研究表明芳香類物質(zhì)可通過嗅覺通路，調(diào)節(jié)自主神經(jīng)及生理功能［11］;影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量緩解抑郁樣癥狀［2，12］、改善空間學習記憶能力［3］等。所以我們推測芳香物質(zhì)可通過嗅覺通路改善自閉癥的社交行為。本研究以VPA腹腔注射建立自閉癥模型，使用丁香酚吸嗅干預VPA大鼠，發(fā)現(xiàn)丁香酚吸嗅組社交實驗結(jié)果明顯優(yōu)于模型組，說明丁香酚吸嗅對VPA大鼠的社交障礙有一定的治療作用。

5－羥色胺(5-HT)作為人類大腦系統(tǒng)最早開發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在腦內(nèi)分布廣泛，其神經(jīng)元胞體多數(shù)位于中縫核群，其中起自中縫背核與中縫正中核的纖維，向上投射到下丘腦、杏仁體、海馬等腦區(qū)。臨床研究發(fā)現(xiàn)約1/3自閉癥患者在發(fā)育關(guān)鍵時期存在高5-HT血癥［13］，因幼兒早期血腦屏障系統(tǒng)不完善，高水平5-HT可進入腦內(nèi)［14］，通過負反饋作用抑制自身神經(jīng)元的發(fā)展和靶器官的發(fā)育［15］。因此5-HT系統(tǒng)發(fā)育異?？赡芘c自閉癥患者腦發(fā)育異常有關(guān)［16］。動物研究中發(fā)育早期使用血清素受體激動，幼崽表現(xiàn)出“孤獨癥樣”行為，如社交障礙和刻板重復行為等［17］。非典型抗精神病藥可改善自閉癥刻板、社交障礙等行為［18］。本實驗證實VPA自閉癥模型存在社會交往障礙，早期丁香酚吸嗅干預后社交行為有所改善，推測丁香酚通過嗅覺通路調(diào)節(jié)腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，影響靶器官杏仁核及其相關(guān)結(jié)構(gòu)的發(fā)育，從而改善社交行為。

綜述所述，丁香酚精油吸嗅可一定程度上改善VPA自閉癥大鼠社交障礙，其具體可能的作用機制需進一步探索。

［1］Lauritsen MB.Autism spectrum disorders［J］.Eur Child Adolesc Psychiatry，2013，22(1):37 －42.

［2］Do Amaral JF.Antidepressant-like effect of bis-eugenol in the mice forced swimming test:evidence for the involvement of the monoaminergic system［J］.Fundam Clin Pharmacol，2013，27(5):471 －482.

［3］宋 娟，高曉平，李光武，等.丁香酚吸嗅對血管性癡呆模型大鼠學習記憶障礙改善的實驗研究［J］.安徽醫(yī)藥，2012，16(3):299－301.

［4］Schneider T，Przewlocki R.Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid:Animal model of autism ［J］.Neuropsychopharmacology，2005，30:80 －89.

［5］Schneider T，Przewlocki R.Environmental enrichment reverses behavioral alteration in rats prenatally exposed to valproic acid:Issues for a therapeutic approach in autism［J］.Neuropsychopharmacology，2006，31:36 －46.

［6］劉莉茵，方文恒，陳 君，等.薄荷醇吸嗅對大鼠學習記憶及海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶及谷氨酸受體1表達的影響［J］.國際藥學研究雜志，2012，39(3):238 －241.

［7］Bromley RL，Mawer GE，Briggs M，et al.The prevalence of neurodevelopmental disorders in children prenatally exposed to antiepileptic drugs［J］.Journal of Neurology，Neurosurgery ＆ Psychiatry，2013，84(6):637 －643.

［8］崔利軍，郭嵐敏，郭 津，等.丙戊酸鈉誘導孤獨癥大鼠模型復制的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學，2013，5(2):122－125.

［9］Adam Y，Mizrahi A.Circuit formation and maintenance-perspectives from the mammalian olfactory bulb.［J］.Curr Opin Neurobiol，2010，20(1):134 －140.

［10］Thayne L.The amygdala and related structures in the pathophysiology of autism［J］.Pharmacology Biochemistry and Behavior，2002，71(3):449－455.

［11］Nagai K，Niijima A，Horii Y，et al.Olfactory stimulatory with grapefruit and lavender oils change autonomic nerve activity and physiological function［J］.Auton Neurosci，2014，6(5):29 －35.

［12］陳 軍，徐金勇，徐 蓉，等.花梨木精油通過嗅覺通路改善小鼠抑郁樣行為及其神經(jīng)遞質(zhì)［J］.江蘇醫(yī)藥，2012，38(6):657－659.

［13］Mulder EJ.Platelet serotonin levels in pervasive developmental disorders and mental retardation:Diagnostic group differences，within-group distribution，and behavioral correlates［J］.J Am Acad Child Adolesc Psychiatry，2004，43(4):491 －499.

［14］Blazevic S，Colic L，Culig L，et al.Hranilovic D.Anxiety-like behavior and cognitive flexibility in adult rats perinatally exposed to increased serotonin concentrations［J］.Behav Brain Res，2012，230(1):175－181.

［15］Whitaker-Azmitia PM.Behavioral and cellular consequences of increasing serotonergic activity during brain development:a role in autism?［J］.Int J Devl Neuroscience，2005，23(1):75 －83.

［16］Yang CJ，Tan HP，Du YJ.The developmental disruptions of serotonin signaling may be involved in autism during early brain development［J］.Neuroscience，2014，16(267):1 －10.

［17］Kahne D，Tudorica A.Behavioral and magnetic resonance spectroscopic studies in the rat hyperserotonemic model of autism［J］.Physiol Behav，2002，75(3):403 －410.

［18］Sharma A，Shaw SR.Efficacy of risperidone in managing maladaptive behaviors for children with autistic spectrum disorder:A Meta analysis［J］.J Pediatr Health Care，2012，26(4):291 －299.