仲 飛，童鑄廷，范璐璐，姚夢群，孫國平

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230022)

小分子RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛存在于動物和植物等多細胞生物中約22個核苷酸左右的非編碼單鏈小分子RNA，它們通過介導轉錄后基因沉默，在生物許多重要的功能基因網絡中起著重要調控的作用［1］。沒藥為印度傳統(tǒng)草藥，數(shù)千年來被用作香料、食品、化妝品和藥品［2］。現(xiàn)代研究表明，沒藥甾酮(Guggulsterone)是沒藥中主要生物活性成分之一，具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤、改善認知行為等［3］。但沒藥甾酮抗腫瘤機制是否涉及miRNA尚無報道，本研究觀察了沒藥甾酮對膽管癌RBE細胞株移植瘤生長的影響，同時利用基因芯片技術檢測沒藥甾酮對移植瘤miRNA表達譜的影響，篩選得到差異表達的miRNAs，深化了對沒藥甾酮抗腫瘤機制的認識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 21只6～7周齡健康雌性SD大鼠，質量150～170 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號:SYXK(皖)2005－02。飼養(yǎng)于SPF動物實驗室。人膽管癌RBE細胞株購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。沒藥甾酮為美國Sigma公司產品。Trizol購自美國Invitrogen公司，GeneChip?miRNA芯片及試劑盒為美國Affymetrix公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 收集對數(shù)生長期的RBE細胞，PBS漂洗，RPMI1640培養(yǎng)基(不含血清)重懸細胞，調整細胞數(shù)至1 ×1010·L－1，每只 0.8 mL 右側后腿皮下注射，建立動物移植瘤模型。移植后72 h后，動物按完全隨機原則均分為3組:高劑量實驗組、低劑量實驗組與空白對照組。高、低劑量實驗組大鼠分別予 40、20 mg·kg－1·d－1沒藥甾酮，灌胃給藥，對照組大鼠灌胃給予等量生理鹽水。每5 d測量裸鼠質量和腫瘤體積，處理30 d后取材。

1.2.2 腫瘤體積檢測 游標卡尺測量腫瘤長、短徑，計算腫瘤體積，公式:V(cm3)=長徑×短徑2×0.5。

1.2.3 腫瘤組織總RNA的提取 高劑量實驗組和對照組每組取4只大鼠，每只鼠剪取腫瘤組織0.1 g，制備組織勻漿，進行標本混樣，Trizol試劑常規(guī)抽提總RNA。每個樣品取1 μL，雙蒸水稀釋200倍后用核酸蛋白定量儀測定RNA含量與純度，要求總RNA樣品的OD 260/280＞1.8，OD 260/230＞1.5。

1.2.4 miRNAs表達譜的檢測 使用 60 ～100 μg總RNA，miRNA Isolation Kit分離 miRNA，使用 Poly(A)聚合酶加尾，T4 RNA連接酶將其與帶生物素標記的信號分子連接、標記，后將miRNA溶于含25%甲酰胺的100 μL 6 ×SSPE 緩沖液(0.90 mol·L－1NaCl，60 mmol·L－1Na2HPO4，6 mmol·L－1EDTA，pH 6.8)進行雜交，于38℃與微陣列雜交過夜。雜交結束后，微陣列玻片于40℃下用2×SSC漂洗6 min，甩干后，GenePix 4000B雙通道激光掃描儀進行掃描，采用 SignificanceAnalysisofMicroarrays(SAM，version 2.1)軟件分析有統(tǒng)計學意義的差異表達位點。表達譜檢測由杭州聯(lián)川生物科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計學處理 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。三組之間裸鼠質量及腫瘤體積的不同時間點比較采用重復測量的方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，兩組miRNA芯片結果采用t檢驗進行分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 沒藥甾酮對裸鼠移植瘤生長的抑制作用 各組大鼠飼養(yǎng)期間生長狀態(tài)良好，移植瘤成瘤率100%，各組鼠間質量差異無顯著性。沒藥甾酮高、低劑量實驗組腫瘤體積分別在處理20 d和25 d后顯著低于對照組，提示沒藥甾酮干預抑制了移植瘤生長;作用25 d和30 d后，高劑量組移植瘤體積顯著低于低劑量實驗組，說明沒藥甾酮抑瘤作用呈劑量依賴性，見圖1。

2.2 沒藥甾酮對移植瘤miRNA表達譜的影響高劑量實驗組和對照組移植瘤組織進行miRNAs表達譜的基因芯片檢測分析，結果表明兩組間表達水平具有顯著差異的miRNAs有18個，其中較對照組顯著上調的有11個，顯著下調的有7個。見表1。

表1 沒藥甾酮對移植瘤組織miRNAs表達的影響

3 討論

沒藥原產印度，為橄欖科植物沒藥樹樹干皮部滲出的油膠樹脂，作為藥用已有數(shù)千年歷史，很早就傳入我國，古代中醫(yī)典籍中對其多有記載。沒藥甾酮是沒藥中主要生物活性成分之一，具有多種藥理活性，近年來其抗腫瘤作用逐漸引起關注［4］。實驗證明，沒藥甾酮對多種腫瘤細胞有明顯的抑制增殖、誘導分化或凋亡、降低侵襲轉移等作用，其抗腫瘤機制涉及多條細胞內分子信號通路，包括:Nrf2，NF-kB，STAT3，和 AP-1，MAPKs，PI3K/Akt等［4－10］。但是，這些機制相對分散，不同研究者的結果難以互相印證，因而有必要更深入的研究其抗腫瘤的關鍵機制，進而發(fā)現(xiàn)新的治療靶點及療效預測指標，充分開發(fā)利用沒藥甾酮的抗腫瘤潛力。

研究表明，miRNA家族是基因表達調控網絡中的關鍵因子，每個miRNA可能調控著數(shù)百個基因的表達，一個基因的表達又可能受多個miRNA的調控，提示miRNA可能以網絡的形式參與調控所有信號通路［1］，并有研究提示miRNA在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［11－13］。那么miRNA在沒藥甾酮的抗腫瘤作用中發(fā)揮怎樣的作用呢?

本實驗首次報道了沒藥甾酮在體內對膽管癌移植瘤有抑制作用，同時伴隨著miRNAs表達譜的改變，這提示沒藥甾酮可能通過調節(jié)miRNAs的表達進而影響某些關鍵靶蛋白的活性從而起到抗瘤作用。我們初步分析了藥物處理前后腫瘤組織中表達水平具有顯著差異的18個miRNAs，發(fā)現(xiàn)其中某些miRNAs具有重要的生物學功能，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，例如:miRNA-21是一個明確的腫瘤相關基因［14］，其可以通過調節(jié)多條細胞信號轉導途徑來影響腫瘤的生物學行為，沒藥甾酮完全可能通過下調miRNA-21來發(fā)揮抗腫瘤作用。進一步的研究將采用實時定量PCR技術對表達差異明顯的miRNAs進行驗證，結合生物信息學與實驗生物學方法對miRNAs可能在沒藥甾酮抗膽管癌中作用進行深入探討。

［1］Varol N，Konac E，Gurocak OS，et al.The realm of microRNAs in cancers［J］.Mol Biol Rep，2011，38(2):1079 －1089.

［2］Gujral ML，Sareen K，Tangri KK，et al.Antiarthritic and anti-in?ammatory activity of gum guggul(Balsamodendron mukul Hook)［J］.Indian J Physiol Pharmacol，1960，4:267 － 273.

［3］Shishodia S，Harikumar KB，Dass S，et al.The guggul for chronic diseases:ancient medicine，modern targets［J］.Anticancer Res，2008，28(6A):3647 －3664.

［4］Almazari I，Surh YJ.Cancer chemopreventive and therapeutic potential of guggulsterone［J］.Top Curr Chem，2013，329:35 －60.

［5］Singh SV，Choi S，Zeng Y，et al.Guggulsterone-induced apoptosis in human prostate cancer cells is caused by reactive oxygen intermediate dependent activation of c-Jun NH2-terminal kinase ［J］.Cancer Res，2007，67(15):7439 －7449.

［6］Shishodia S，Sethi G，Ahn KS，et al.Guggul-sterone inhibits tumor cell proliferation，induces S-phase arrest，and promotes apoptosis through activation of c-Jun N-terminal kinase，suppression of Akt pathway，and downregulation of antiapoptotic gene products［J］.Biochem Pharmacol，2007，74(1):118 －130.

［7］Samudio I，Konopleva M，Safe S，et al.Guggulsterones induce apoptosis and differentiation in acute myeloid leukemia:identification of isomer-specific antileukemic activities of the pregnadienedione structure［J］.Mol Cancer Ther，2005，4(12):1982 －1992.

［8］Singh SV，Zeng Y，Xiao D，et al.Caspase-dependent apoptosis induction by guggulsterone，a constituent of Ayurvedic medicinal plant Commiphora mukul，in PC-3 human prostate cancer cells is mediated by Bax and Bak ［J］.Mol Cancer Ther，2005，4(11):1747－1754.

［9］Shishodia S，Aggarwal BB.Guggulsterone inhibits NF-kappaB and IkappaBalpha kinase activation，suppresses expression of anti-apoptotic gene products，and enhances apoptosis［J］.J Biol Chem，2004，279(45):47148 －47158.

［10］An MJ，Cheon JH，Kim SW，et al.Guggulsterone induces apoptosis in colon cancer cells and inhibits tumor growth in murine colorectal cancer xenografts［J］.Cancer Letters，2009，279(1):93 －100.

［11］徐 璟，孫國平.miRNA對自噬的調控及其在腫瘤中的作用研究進展［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(10):1645 －1647.

［12］劉 莎，孫國平.miRNA145作為抑癌基因在胃癌中的表達及其功能研究［J］.安徽醫(yī)藥，2014，18(10):1817 －1820.

［13］郝 莉，孫國平.miRNA作為大腸癌生物標志物的研究進展［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(2):183 －185.

［14］Hong L，Han Y，Zhang Y，et al.MicroRNA-21:a therapeutic target for reversing drug resistance in cancer［J］.Expert Opin Ther Targets.2013，17(9):1073 －1080.