任翠麗，夏倫洋，尹情勝，王世亮，3，吳永貴，周春霞

(1.合肥工業(yè)大學(xué)控釋藥物研究室;2.安徽中人科技有限責(zé)任公司;3.安徽四維藥業(yè)有限公司，安徽合肥 230009;4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥 230022)

地塞米松為糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，臨床主要用于替代療法、自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、嚴(yán)重感染、抗休克、血液系統(tǒng)疾病等。本研究小組研發(fā)的新劑型新產(chǎn)品—地塞米松植入劑，該植入劑體積較小(呈圓柱體，直徑0.8 ～0.9 mm，長(zhǎng) 2 ～4 mm)，為白色或類(lèi)白色，用于治療腎病綜合證，可通過(guò)一定的技術(shù)手段植入腎囊，藥物到達(dá)局部后，緩慢釋放，周期長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月。這樣局部藥物濃度較高，殺死病灶，全身血藥濃度較低，使不良反應(yīng)大大的減少［1－3］。這樣可以避免或減少地塞米松傳統(tǒng)給藥的方式導(dǎo)致的全身不良反應(yīng)(滿(mǎn)月臉、水牛背、向心性肥胖、高血壓、低血鉀等)。本文查閱了一些相關(guān)文獻(xiàn)［4－13］并在相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，建立了高效液相色譜法測(cè)定地塞米松植入劑的有關(guān)物質(zhì)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平(METTLER TOLEDO，型號(hào)XA105)、數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)KQ－100DE)、高效液相色譜儀(日本島津，型號(hào)LC－15C)。

1.2 試藥 地塞米松植入劑(批號(hào):20131225，20140113，20140216，標(biāo)示量 2 mg)、對(duì)照品地塞米松、倍他米松購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)分別為 100129－200804、100118－200803)、甲醇(色譜純，SIGMA －ALDRICH.CO)、乙腈(色譜純，Product of Tedia United states of America)、聚乳酸(安徽中人科技有限責(zé)任公司合成組提供，分子量約17000，批號(hào)20131228)、聚乙二醇6000(北京市海淀區(qū)精細(xì)化工廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱:天津蘭博 Kromasil-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm，S/N:09253924);流動(dòng)相:乙腈—水(28∶72，V/V)，流速:2.0 mL ·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng):240 nm，柱溫:35 ℃，進(jìn)樣量:20 μL，取“2.2.4”項(xiàng)下的對(duì)照溶液 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，出峰順序依次為倍他米松峰與地塞米松峰，分離度應(yīng)符合要求［14］。

2.2 溶液的配制

2.2.1 制劑溶液配制 取本品約51 mg(相當(dāng)于地塞米松5 mg)，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度并搖勻，過(guò)濾，作供試品溶液。

2.2.2 地塞米松儲(chǔ)備溶液 取地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品約10.00 mg，精密稱(chēng)定，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.5 mg·L－1的儲(chǔ)備溶液。

2.2.3 倍他米松儲(chǔ)備溶液(雜質(zhì)溶液) 精密稱(chēng)取倍他米松標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.5 mg·L－1的儲(chǔ)備溶液。

2.2.4 0.5%自身對(duì)照品溶液(5 mg·L－1) 精密移取“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)溶液各 1 mL 于 100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 分別取地塞米松儲(chǔ)備溶液和雜質(zhì)倍他米松溶液適量，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。地塞米松在240 nm處有最大吸收，而雜質(zhì)倍他米松在此處也有吸收，并使用本實(shí)驗(yàn)中的色譜條件，使原料藥及其雜質(zhì)能有效分離。因此選240 nm為本品有關(guān)物質(zhì)檢查的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 空白輔料干擾實(shí)驗(yàn) 按制劑處方比例取各輔料適量(約88 mg)，混勻。置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度并搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液20 μL，照上述色譜條件，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，并記錄結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，空白輔料只有溶劑峰，未在主峰及雜質(zhì)峰處出峰，對(duì)主藥及各雜質(zhì)的測(cè)定無(wú)干擾。

2.5 線性關(guān)系 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)下的溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻。作線性?xún)?chǔ)備液(50 mg·L－1)，依次逐步稀釋成 10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1 mg·L－1的溶液。分別精密移取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度(X，mg·L－1)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得地塞米松、雜質(zhì)倍他米松的回歸方程分別為:Y=27 863X －682，r=0.999 8;Y=27 210X －660 ，r=1.0000。表明地塞米松及雜質(zhì)倍他米松在0.1～10 mg·L－1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.6 定量限 以信噪比為10∶1的濃度為定量限檢測(cè)溶液，進(jìn)樣20 μL，重復(fù)6次。結(jié)果地塞米松、雜質(zhì)倍他米松的最低定量限分別為 1.17、1.04 μg·L－1。

2.7 檢測(cè)限 以信噪比為3∶1的濃度為檢測(cè)限檢測(cè)溶液，進(jìn)樣20 μL，重復(fù)6次。結(jié)果地塞米松、雜質(zhì)倍他米松的最低檢測(cè)限分別為 0.39、0.34 μg·L－1。

2.8 重復(fù)性 按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法配制6份供試品溶液;取上述1份供試品溶液1 mL于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制對(duì)照溶液;另取系統(tǒng)適用性溶液分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果RSD為0.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 中間精密度 分別于d 2和d 3重復(fù)“2.8”項(xiàng)的操作，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果RSD分別為1.15%和2.17%，表明該方法精密度良好。

2.10 穩(wěn)定性 取供試品溶液、0.5%自身對(duì)照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液，室溫下放置8 h，分別于0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣 20 μL，記錄峰面積，計(jì)算 RSD。結(jié)果地塞米松和雜質(zhì)倍他米松的RSD分別為0.29%，0.78%，表明其溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 加樣回收率 精密量取上述“2.2.3”項(xiàng)溶液1 mL于20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)儲(chǔ)備液(25 mg·L－1);另取地塞米松植入劑9份(每份約相當(dāng)于地塞米松5 mg)，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷，分別加入 0.8、1.0 和 1.2 mL 的雜質(zhì)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液制成含雜質(zhì)倍他米松量分別為80%、100%和120%的低、中、高三組供試液，每組三份。分別取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計(jì)算各濃度下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.12 耐用性 在本實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，分別改變流速(1.8 mL·min–1和 2.2 mL·min–1)、柱溫(30℃和40℃)、流動(dòng)相中乙腈的比例(25%和30%)、不同色譜柱(Kromasil-C18)、取供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液，每個(gè)條件分別進(jìn)樣3次，考察本實(shí)驗(yàn)的耐用性。結(jié)果表明，地塞米松、雜質(zhì)倍他米松的出峰時(shí)間、柱效、出峰情況相似，不同條件下測(cè)定供試品溶液的有關(guān)物質(zhì)RSD為0.29%，表明本方法耐用性良好。

2.13 專(zhuān)屬性 按如下方法分別對(duì)地塞米松原料藥、自制地塞米松植入劑及空白輔料進(jìn)行破壞性試驗(yàn)。

2.13.1 酸破壞 稱(chēng)取樣品適量(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷后，加1.2 mL濃硫酸，室溫下放置2 min，用 1.0 mol·L－1氫氧化鈉溶液中和至pH值為中性，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾。

2.13.2 堿破壞 稱(chēng)取樣品適量(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理 30 min，取出，放冷后，加 1.0 mol·L－1氫氧化鈉溶液 0.5 mL，室溫下放置 5 min，用 1.0 mol·L－1鹽酸溶液中和至pH值為中性，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾。

2.13.3 氧化破壞 稱(chēng)取樣品適量(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷后，加30%雙氧水2 mL，加甲醇4 mL，60℃水浴下放置2 d，取出放冷后，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾。

2.13.4 高溫破壞 取樣品適量，置150℃烘箱中烘烤2 h，冷卻，稱(chēng)取適量樣品(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出放冷后，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾。

2.13.5 強(qiáng)光破壞 稱(chēng)取樣品適量(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷后，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾。置(4 500±500)Lx的低溫光照儀中3 d，依法檢查。試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品在強(qiáng)光破壞3 d、酸破壞、堿破壞、高溫、氧化破壞后，主峰均有所降解，雜質(zhì)峰均能與主峰分離，說(shuō)明本法的專(zhuān)屬性較好，見(jiàn)圖2。

2.14 樣品中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定 取3批自制樣品(批號(hào):20131225，20140113，20140216)按照“2.2.1”項(xiàng)方法配制供試品溶液，另取倍他米松對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.5 mg的溶液，分別精密量取倍他米松1 mL置100 mL各量瓶中，再分別精密加各供試品溶液1 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。取各供試品溶液及對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，記錄色譜圖。結(jié)果3批樣品總雜質(zhì)分別為 0.79%，0.87%，0.68%，最大單個(gè)雜質(zhì)分別為 0.015%，0.024%，0.019%，符合有關(guān)規(guī)定。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 分別用了甲醇—水(70∶30，V/V)和乙腈—水(32∶68，V/V)［1］作為流動(dòng)相，但對(duì)照溶液中倍他米松與地塞米松的分離度小于1.5。未達(dá)到《中國(guó)藥典》2010年版二部中提及地塞米松有關(guān)物質(zhì)測(cè)定項(xiàng)下的要求。參考文獻(xiàn)［14］資料，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)調(diào)整流動(dòng)相中乙腈的比例，當(dāng)流動(dòng)相調(diào)整為乙腈—水(28∶72，V/V)時(shí)，倍他米松與地塞米松的分離度大于1.5，供試品中的雜質(zhì)峰分離度、對(duì)稱(chēng)因子及保留時(shí)間較好。因選用其為流動(dòng)相。

3.2 流速的選擇 在做初始優(yōu)化階段選擇時(shí)，主要參考了文獻(xiàn)［13］，流速為 1.0 mL·min－1時(shí)，樣品分析時(shí)間太長(zhǎng)，經(jīng)逐步摸索。選擇2.0 mL·min－1時(shí)，柱壓:15～17 MPa，流動(dòng)相為乙腈—水(28∶72，V/V)，該流動(dòng)相仍可算做低柱阻良好性能溶劑。因此可選較高流速而不必?fù)?dān)心泵的損壞。研究實(shí)踐中觀察到:在進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，內(nèi)源性干擾組分較少，各組分能有效分離(分離度在1.5以上)。因此流速較高帶來(lái)的分離較差的影響，暫時(shí)可不考慮。綜合考慮選擇流速2.0 mL·min－1。

3.3 溶劑的選擇 剛開(kāi)始用流動(dòng)相溶解樣品時(shí)，肉眼觀察樣品溶解不了，有沉淀物，根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版二部中提及地塞米松略溶于乙醇，用無(wú)水乙醇溶解，肉眼觀察不到有沉淀物，但在錄制色譜圖時(shí)，發(fā)現(xiàn)地塞米松出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象;嘗試用乙腈溶解樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松、倍他米松的分離度及塔板數(shù)較低，達(dá)不到要求，經(jīng)摸索，先用少量乙腈(1 mL)超聲溶解樣品，再用甲醇(約9 mL)定容，這樣分離度及塔板數(shù)均能符合要求。

［1］任翠麗，尹情勝，俞 敏，等.HPLC法測(cè)定地塞米松植入劑的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(8):1294 －1295.

［2］劉干炎，王水華，劉永芳，等.地塞米松、鹽酸氮芥、降纖酶聯(lián)合治療紫癱性腎炎的療效觀察［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10(26):202－203.

［3］高大明，翟愛(ài)國(guó)，劉永紅，等.小劑量激素短療程輔助治療支原體肺炎臨床觀察［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14(6):713 －714.

［4］李 群.HPLC法測(cè)定醋酸地塞米松片有關(guān)物質(zhì)［J］.中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2012，2(5):99 －100.

［5］李 潔.地塞米松磷酸鈉注射液有關(guān)物質(zhì)檢查方法的探討［J］.中國(guó)藥事，2013，27(4):416 －419.

［6］孫 超，張昊天，尹燕杰，等.地塞米松磷酸鈉注射液有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)方法分析［J］.黑龍江醫(yī)藥，2013，126(3):392 －393.

［7］王國(guó)蘭，寇晉萍，王俊秋，等.反相 HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方氧氟沙星滴眼液中氧氟沙星和地塞米松磷酸鈉的含量及有關(guān)物質(zhì)［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11(3):195 －198.

［8］方海燕.地塞米松磷酸鈉注射液的質(zhì)量分析［J］.臨床合理用藥，2012，5(9):45.

［9］Zhang CL，Gao P，Yin WF，et al.Dexamethasone regulates differential expression of carboxylesterase 1 and carboxylesterase 2 through activation of nuclear receptors［J］.Huazhong Univ Sci Technol，2012，32(6):798 －805.

［10］林琪珊，洪淑華，余良鐘.復(fù)方醋酸地塞米松乳膏有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定及其雜質(zhì)的確定［J］.中國(guó)藥房，2013，24(9):843 －845.

［11］吳 燕，張福成，徐 榮，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方咽炎噴霧劑中3種藥物含量［J］.中國(guó)新藥雜志，2012，21(3):324－326.

［12］Zhang RL，Bo T，Shen L，et al.Effect of dexamethasone on intelligence and hearing in preterm infants:a meta － analysis［J］.Neural Regeneration Research，2014，9(6):637 －645.

［13］左志輝，唐素芳.HPLC法測(cè)定倍他米松及其乳膏的含量及有關(guān)物質(zhì)［J］.藥物分析雜志，2009，29(12):2162 －2165.

［14］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(二部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:249.