楊堯，周瑤，郁彭，滕玉鷗

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

白三烯A4水解酶及其抑制藥研究進展*

楊堯，周瑤，郁彭，滕玉鷗

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

白三烯是從花生四烯酸代謝產(chǎn)物中分離得到的具有共軛三烯結(jié)構(gòu)的二十碳不飽和酸，白三烯A4水解酶是水解白三烯A4產(chǎn)生白三烯B4的關(guān)鍵酶,具有環(huán)氧化物水解酶及氨肽酶雙重活性。白三烯B4是許多急性和慢性炎癥的重要化學(xué)遞質(zhì)，廣泛參與諸多炎癥性疾病的發(fā)生。除了在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，近期的研究表明，白三烯A4水解酶與多種惡性腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。因此，新型白三烯A4水解酶抑制藥的研發(fā)工作對研制新型抗炎抗腫瘤藥物具有十分重要的意義。該文就白三烯A4水解酶及其抑制藥的研究進展作一綜述。

白三烯A4水解酶抑制藥；白三烯A4；白三烯A4水解酶

花生四烯酸代謝是一個在生物體內(nèi)廣泛存在并具有強大生物活性的代謝體系，花生四烯酸代謝主要有兩條路徑：①在環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)作用下生成各種前列腺素(prostaglandin，PGs)；②在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)作用下生成白細胞三烯(leukotrienes，LTs)、脂質(zhì)過氧化物。其中代謝途徑中的白三烯A4水解酶(leukotriene A4 Hydrolase，LTA4H)、磷脂酶A2 (phospholipase A2，PLA2)、COX、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)等是抗炎藥物設(shè)計的重點靶標。

LTs是從花生四烯酸代謝產(chǎn)物中分離得到的具有共軛三烯結(jié)構(gòu)的二十碳不飽和酸，LTA4H是水解白三烯A4(leukotriene A4，LTA4)產(chǎn)生白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)的關(guān)鍵酶，具有環(huán)氧化物水解酶及氨肽酶雙重活性。LTB4是許多急性和慢性炎癥的重要化學(xué)遞質(zhì)，廣泛參與諸多炎癥性疾病的發(fā)生。除了在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，近期的研究表明，LTA4H與多種惡性腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。因此，新型LTA4H抑制藥的研發(fā)工作對研制新型抗炎抗腫瘤藥物具有十分重要的意義。

1 LTA4H

LTA4H存在于多種哺乳類動物組織細胞質(zhì)中。其生物活性是催化5-(s)-反-5、6-環(huán)氧-7、9-反-11、14-順-廿碳四烯酸(LTA4)生成5(S)，12(R)-三羥-6、14順8、10-反廿碳四烯酸(LTB4)。1984年RADMARK等首先從人白細胞中提取此酶獲得成功[2]。隨后有些作者分別從大鼠白細胞和人紅細胞中提取了此酶。由于LTB4具有強大的白細胞趨化作用，促進白細胞集聚和附著，促進白細胞溶酶體內(nèi)酶的釋放和白細胞過氧化物的生成。目前認為LTB4和炎癥、過敏等關(guān)系密切。因此研究LTA4H的活性在生物醫(yī)學(xué)研究中越來越受到人們的關(guān)注。

1.1 LTA4H的結(jié)構(gòu) LTA4H是一種由610個氨基酸分子組成的含鋅的雙功能金屬蛋白酶，廣泛存在于包括細菌在內(nèi)的多種生物中，并且是M1家族同源序列的成員。其晶體結(jié)構(gòu)于2001年確定，其活性特點是：①埋于蛋白質(zhì)深處的活性中心有一個小的開口，溶劑可由此處滲入；②有3個水分子處于活性中心的疏水口袋端；③活性中心的親水部分附近有鋅原子與周圍水分子以螯合物形式存在；④活性中心的疏水袋以L形的空間構(gòu)型與親水端相連[3]。

1.2 LTA4H的作用機制 LTA4H具有環(huán)氧化物水解酶及氨肽酶雙重活性。環(huán)氧化物水解酶催化LTA4生成LTB4；氨肽酶的立體結(jié)構(gòu)中疏水性腔穴和二價鋅離子能催化蛋白質(zhì)和多肽底物氨基端的裂解[4-5]。

從LTA4H晶體結(jié)構(gòu)及其定點突變研究看出，特定位點的氨基酸與LTA4H的水解酶及氨肽酶的活性有關(guān)。鋅離子(Zn2+)及氨基酸Glu271、Glu296和Tyr383會影響其氨肽酶活性；Zn2+及Glu271，Arg563，Asp375，Glu296會影響其水解酶活性。

1.2.1 LTA4H在炎癥發(fā)生過程中的作用 LTA4H能夠催化LTA4產(chǎn)生LTB4，LTB4是體內(nèi)產(chǎn)生的最強的白細胞趨化因子之一，僅以納摩爾濃度即可激發(fā)白細胞與內(nèi)皮細胞粘附、聚集，誘導(dǎo)溶酶體酶與活性氧釋放，介導(dǎo)血管損傷，參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮膚、關(guān)節(jié)及腎臟等組織的炎癥反應(yīng)及組織損傷。

1.2.2 LTA4H在腫瘤發(fā)病機制中的作用 近年來，在炎癥中扮演重要角色的LTA4H被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，LTA4H與慢性炎癥相關(guān)的癌變機制可能有兩種：①炎癥細胞擴增影響受體和下游信號分子介導(dǎo)的正反饋，從而誘發(fā)癌癥前期細胞和癌癥細胞的生成；②表皮細胞以及炎癥細胞產(chǎn)生的LTB4刺激和加速癌癥前期細胞和癌癥細胞的生長[6]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌、胰腺癌、直腸癌和惡性淋巴瘤等腫瘤細胞中，LTA4H的表達水平明顯高于正常細胞。因此人們推測，LTA4H異常表達同樣具有誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用。

LTA4H的氨肽酶功能已被證實能調(diào)控腫瘤生長。LTA4H的Glu271氨基酸殘基突變在導(dǎo)致其氨肽酶功能完全喪失的同時，LTA4H促進腫瘤細胞生長的活性也受到一定抑制。

2 LTA4H抑制藥

來源于花生四烯酸和LTA4脂氧素，脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)和脂氧素B4(lipoxin B4，LXB4)都是參與炎癥消退的抗炎性遞質(zhì)。LTB4參與炎癥等多種疾病的發(fā)生，因此抑制細胞內(nèi)LTB4活性或減少LTB4合成成為治療炎癥等多種疾病的一種手段，而作為生成LTB4的關(guān)鍵酶，LTA4H抑制藥的研究就至關(guān)重要[7-11]。

在花生四烯酸的代謝網(wǎng)絡(luò)中，5-LOX、5-脂氧合酶激活蛋白(5-lipoxygenase activating protein，F(xiàn)LAP)抑制藥及LTA4H抑制藥都可以達到減少LTB4的目的。5-LOX、FLAP抑制藥是通過減少LTA4來達到減少LTB4的目的，這樣會導(dǎo)致LTA4下游產(chǎn)物脂氧素形成減少，從而影響到與其相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)。而LTA4H抑制藥直接作用于產(chǎn)生LTB4的通路上，并不會影響其他產(chǎn)物的合成，所以LTA4H抑制藥在一定程度上優(yōu)于5-LOX或FLAP抑制藥。

2.1 底物類似物 由于LTA4自身可以作為LTA4H抑制藥，所以之前抑制藥的研究主要集中在底物類似物方面。并推出了一系列環(huán)氧苯甲酸化合物及一系列帶有苯基或噻吩的LTA4類似物作為LTA4H的抑制藥，在大鼠及HL-60細胞中對LTA4H有很好的抑制作用。

2.2 鋅離子螯合劑 異羥酸類及硫醇類化合物能夠抑制LTA4H環(huán)氧水解酶的活性；異羥肟酸類化合物在較低濃度時會充分抑制LTA4H活性。例如已經(jīng)報道的血管緊張肽抑制藥卡托普利(甲巰丙脯酸)能抑制環(huán)氧水解酶的活性。但由于卡托普利抑制活性較弱，所以以此為基礎(chǔ)合成了其他硫醇化合物，如N-[(2S)-3-巰基-2-甲丙酰]-L-脯氨酸衍生物相對于卡托普利有較好的水解酶抑制活性[12]。

苯丁抑制素(bestatin)是一種傳統(tǒng)的氨肽酶抑制藥，與296位保留谷氨酸的LTA4H 結(jié)合，從而抑制環(huán)氧水解酶和氨肽酶的活性；苯丁抑制素可有效地抑制大鼠和人食管腺癌細胞的生長。

2.3 非螯合型抑制藥 所推出的化合物包括咪唑類似物、脒類似物、氨基酸衍生物類似物、SC-57461A類似物等，以上幾種系列對重組人LTA4H及細胞中LTA4H具有很好的抑制活性。

引入功能基團的吡咯烷或者哌啶類衍生物提高了LTA4H抑制藥的口服活性，一些含有哌啶基的化合物表現(xiàn)出了進一步的生物學(xué)特征，并作為潛在的臨床候選化合物，其中4-羧哌啶衍生物有著較好的應(yīng)用前景。同時帶有酸或酸等電子、酯和各種酰胺類的化合物在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出了很好的口服活性。

氨基酸類的衍生物如N-烷基甘氨酸酰胺[13]，N-烷基甘氨酸酰胺類、芳基的二連胺類都是潛在的口服LTA4H抑制藥，具有很好的抑制活性。N-巰基酰胺酸的衍生物是一類新的LTA4H抑制藥，其中S-(4-二甲氨基)芐基-L-半胱氨酸的衍生物表現(xiàn)出了LTA4H抑制藥的活性并且其選擇性多于除血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶以外的其他金屬酶。同時苯環(huán)上用芳香取代基修飾可以提高抑制藥活性，選擇性同樣高于血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶。

一價陰離子和清蛋白可以激活LTA4H氨肽酶活性，但有機化合物是否能夠促使氨肽酶活性增強，尚有待進一步研究。一系列二苯醚衍生物可以激活或者抑制LTA4H氨肽酶活性，但并不會影響LTA4H水解酶活性。另外，研究表明苯氧基-乙胺基的類似物是潛在LTA4H抑制藥。

2.4 新型的LTA4H抑制藥 生姜中的姜辣素是具有抗腫瘤活性的天然物質(zhì)，研究表明，姜辣素可通過抑制LTA4H來抑制結(jié)腸癌細胞生長[14]；紅酒中的多酚類成分白藜蘆醇有良好抗腫瘤活性，繼2009年DAVIES等通過計算機模擬預(yù)測白藜蘆醇能夠與LTA4H結(jié)合之后，OI等[15]在2010年報道，白藜蘆醇能與LTA4H結(jié)合，抑制LTB4產(chǎn)生，并控制胰腺癌細胞生長。

香豆酮系列能夠減少小鼠和人類血液中LTB4產(chǎn)生，以香豆酮為基礎(chǔ)合成了LTA4H抑制藥。在體外實驗，此類化合物表現(xiàn)出了LTA4H抑制藥活性和較好的藥動學(xué)特性，采用香豆酮中心替代模式合成的化合物在體外和小鼠體內(nèi)都表現(xiàn)出較好的抑制活性。在小鼠體內(nèi)，在一定范圍內(nèi)隨著其劑量的增加，合成LTB4的量逐漸減小。此類化合物有著很好應(yīng)用前景，能夠更好地抑制人血中LTB4的產(chǎn)生，為LTA4H抑制藥的合成提供了很好的基礎(chǔ)[16]。

以PLA2和LTA4H為靶位點的雙功能抑制藥可能會平衡花生四烯酸網(wǎng)絡(luò)并且可以用作新的抗炎癥藥物。之前的研究表明，對于hnps-PLA2和LTA4H的雙功能抑制藥已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。以此化合物為基礎(chǔ)，通過分子嵌合技術(shù)所設(shè)計的全新雙靶位點抑制藥，并以此為基礎(chǔ)合成5-羥基色胺等一系列化合物，在體外對兩種酶的抑制效果優(yōu)于之前的雙功能抑制藥[17]。

目前國外對于LTA4H抑制藥的研究多用于炎癥相關(guān)的傳統(tǒng)疾病及心腦血管疾病防治。由于LTA4H是完全不同于現(xiàn)有抗癌藥物靶標的目標蛋白，以LTA4H抑制藥作為新型抗癌藥物的研究是該領(lǐng)域新的研究方向。

3 結(jié)束語

LTA4H既是調(diào)控機體炎癥反應(yīng)的重要蛋白酶，同時也可能成為具有全新作用機制的抗腫瘤藥物靶點。通過闡明LTA4H異常表達誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的具體作用機制，既能為開發(fā)具有高度特異性的高效LTA4H抑制藥的設(shè)計與開發(fā)提供一種新思路、新靶點和新的技術(shù)平臺，也為臨床炎癥與癌癥的關(guān)聯(lián)研究提供新的思路。

[1] 劉瑩，陳政，尚爾昌，等.花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)研究：從關(guān)鍵酶的單靶標抑制劑到多靶標抑制劑[J].藥學(xué)學(xué)報，2009，44 (3)：231-241.

[2] 李鳳林.白三烯的研究現(xiàn)狀[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1984，18(1)：69-76.

[3] THUNNISSEN M M，NORDLUND P，HAEGGSTROM J Z.Crystal structure of human leukotriene A(4) hydrolase, a bifunctional enzyme in inflammation[J].Nat Struct Biol，2001，8(2)：131-135.

[4] PORAS H，DUQUESNOY S，F(xiàn)OURNIE-ZALUSKI M C，et al.A sensitive fluorigenic substrate for selectiveinvitroandinvivoassay of leukotriene A4 hydrolase activity[J].Anal Biochem，2013，441(2)：27376-27382.

[5] JIANG X，ZHOU L，WU Y，et al.Modulating the substrate specificity of LTA4 H aminopeptidase by using chemical compounds and small-molecule-guided mutagenesis[J].Chem Bio Chem，2010，11(8)：1120-1128.

[6] CHEN X，WANG S，WU N，et al.Leukotriene A4hydrolase as a target for cancer prevention and therapy[J].Curr Cancer Drug Targets，2004，4(3)：267-283.

[7] SANDANAYAKA V，MAMAT B，MISHRA R K，et al.Dis-covery of 4-[(2S)-2-{[4-(4-Chlorophenoxy)phenoxy]methyl}-1-pyrrolidinyl]-butanoic acid (DG-051) as a novel leukotriene A4 hydrolase inhibitor of leukotriene B4 biosynthesis[J].J Med Chem，2010，53(2)：573-585.

[8] JIANG X，ZHOU L，WEI D，et al.Activation and inhibition of leukotriene A4 hydrolase aminopeptidase activity by diphenyl ether and derivatives[J].Bioorg Med Chem Lett，2008，18(24)：6549-6552.

[9] ENOMOTO H，MORIKAWA Y，MIYAKE Y，et al.Synthesis and biological evaluation ofN-mercaptoacylcysteine derivatives as leukotriene A4 hydrolase inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett，2009，19(2)：442-446.

[10] WEI D，JIANG X，ZHOU L，et al.Discovery of multitarget inhibitors by combining molecular docking with common pharmacophore matching[J].J Med Chem，2008，51(24)：7882-7888.

[11] SANDANAYAKA V，MAMAT B，BHAGAT N，et al.Disco-very of novel leukotriene A4 hydrolase inhibitors based on piperidine and piperazine scaffolds[J].J Med Chem，2010，20(9)：2851-2854.

[12] ENOMOTO H，MORIKAWA Y，MIYAKE Y，et al.Synthesis and biological evaluation ofN-mercaptoacylproline andN-mercaptoacylthiazolidine-4-carboxylic acid derivatives as leukotriene A4 hydrolase inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett，2008，18(16)：4529-4532.

[13] BIN Y E，JOHN B，MING C，et al.Synthesis ofN-alkyl gly-cine amides as potent inhibitors of leukotriene A4 hydrolase[J].Bioorg Med Chem Lett，2008，18(14)：3891-3894.

[14] JEONG C H，BODE A M，PUGLIESE A，et al.[6]-Gin-gerol suppresses colon cancer growth by targeting leukotriene A4 hydrolase[J].Cancer Res，2009，69(13)：5584-5591.

[15] OI N，JEONG C H，NADAS J，et al.Resveratrol，a red wine polyphenol，suppresses pancreatic cancer by inhibiting leukotriene A4 hydrolase[J].Cancer Res，2010，70(23)：9755-9764.

[16] TANIS V M，BACANI G M，BIEVITT J M，et al.Azabenz-thiazole inhibitors of leukotriene A4 hydrolase[J].Bioorg Med Chem Lett，2012，22(24)：7504-7511.

[17] MENG H，LIU Y，ZHAI Y，et al.Optimization of 5-hydro-xytryptamines as dual function inhibitors targeting phospholipase A2 and leukotriene A4 hydrolase[J].Eur J Med Chem，2013，59：160-167.

2013-10-13

2013-11-20

*天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃自然科學(xué)基金一般項目(12JCYBJC31600)

楊堯(1988-)，女，山西大同人，在讀碩士，研究方向：藥學(xué)和細胞生物學(xué)。電話：(0)18322695857，E-mail：yangyao2009.cool@163.com。

滕玉鷗(1976-)，女，吉林長春人，副教授，研究方向：藥學(xué)和細胞生物學(xué)。E-mail：tyo201485@tust.edu.cn。

R965

A

1004-0781(2015)02-0225-03