鐘萬芳，李雪萍，郭慧芳*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南京 210014;2.云南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明 650091)

甜菜夜蛾 Spodoptera exigua 屬鱗翅目Lepidoptera 夜蛾科Nocruidae，是世界性分布、間歇性大發(fā)生的、以危害蔬菜為主的雜食性害蟲。甜菜夜蛾寄主范圍很廣，主要危害茄子、黃瓜、豇豆、花椰菜等35 科108 屬170 余種植物。由于該蟲對(duì)化學(xué)農(nóng)藥抗藥性的不斷增強(qiáng)，近年來在我國(guó)南方發(fā)生有加重趨勢(shì)(文禮章等，2014)。真菌是唯一能在自然條件下通過體壁接觸侵染昆蟲的病原微生物。在害蟲防治過程中，蟲生真菌是替代傳統(tǒng)農(nóng)藥的最佳選擇，這是因?yàn)橄x生真菌對(duì)人、畜、植物及環(huán)境安全，并能在適宜的環(huán)境條件下引起流行病，在自然調(diào)節(jié)昆蟲種群過程中起著重要作用(Ali et al.，2010)。萊氏野村菌Nomuraea rileyi 屬于半知菌亞門絲孢綱Hyphomycetes 叢梗孢目Miniliales 野村菌屬Nomuraea 是一種世界性廣泛分布的重要蟲生真菌。其可以侵染30 多種鱗翅目害蟲，尤其是對(duì)夜蛾科害蟲，如斜紋夜蛾Spodoptera litura、甜菜夜蛾、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、煙青蟲Helicoverpa assulta、棉鈴蟲H.armigera等的致病力強(qiáng)，在自然界常常引發(fā)高強(qiáng)度的昆蟲流行病，故受到各國(guó)科學(xué)工作者的重視(Srisukchayakul ＆ Pantuwatana，2005;Perinotto et al.，2012;Song et al.，2013)。和昆蟲病毒、細(xì)菌必須攝入到昆蟲體內(nèi)不同，真菌可直接通過產(chǎn)生附著孢等特殊結(jié)構(gòu)從害蟲體壁侵入，在此期間會(huì)分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶等多種酶(Santi et al.，2010)。在侵入后，菌絲體會(huì)利用昆蟲體液進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖，同時(shí)產(chǎn)生的毒素及代謝物會(huì)干擾和破壞害蟲的生理機(jī)能，最終導(dǎo)致害蟲死亡(Schrank ＆ Vainstein，2010)。

我們從南京六合大豆田罹病斜紋夜蛾幼蟲蟲體上分離獲得一株萊氏野村菌新菌株，測(cè)定了其對(duì)甜菜夜蛾的毒力，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌開展生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基與昆蟲

實(shí)驗(yàn)用萊氏野村菌菌株于2013年9月在江蘇省南京市六合大豆田罹病斜紋夜蛾幼蟲蟲體上分離得到。培養(yǎng)基選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。供試甜菜夜蛾幼蟲為本實(shí)驗(yàn)室利用人工飼料飼養(yǎng)多年的室內(nèi)種群。養(yǎng)蟲條件為26℃，相對(duì)濕度75%，光照時(shí)間14 h。

1.2 試劑

基因組DNA 提取試劑盒說明書提取DNA 為Promega 公司產(chǎn)品，瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Omega Biotek 公司產(chǎn)品，pEASY T3 為Transgen 公司產(chǎn)品，LA Taq 聚合酶為TAKARA 公司產(chǎn)品，X-gal、IPTG、氨芐青霉素等為BBI 公司產(chǎn)品，其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 菌株DNA 的提取及鑒定

將PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)好的萊氏野村菌分生孢子接種于液體培養(yǎng)基中，180 rpm，26℃，振蕩培養(yǎng)72 h，將菌液轉(zhuǎn)移至50 mL 無菌離心管中，10000 rpm離心10 min，收集菌體，依據(jù)基因組DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。

1.4 菌株的ITS 鑒定

采用真菌核糖體rDNA 區(qū)通用引物ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴(kuò)增ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 全序列及部分18S 和28S rDNA 序列。引物由上海生工合成。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后，克隆到pEASY T3載體中，陽性克隆由南京金斯瑞公司測(cè)序。

1.5 菌株的擴(kuò)繁及孢子計(jì)數(shù)

將萊氏野村菌接種在PDA 培養(yǎng)基上在人工氣候箱26℃下培養(yǎng)10 d 供試驗(yàn)用。分生孢子液的制備:將分生孢子粉刮到一個(gè)三角瓶中，加入10 mL的0.05%吐溫-80 及少量的玻璃珠，充分振蕩后過濾，除去菌絲和雜質(zhì)。利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，把分生孢子按照10×稀釋法配成不同的濃度。

1.6 甜菜夜蛾幼蟲接種感染方法

采用浸漬法接種甜菜夜蛾幼蟲。用鑷子將甜菜夜蛾3 齡幼蟲放入待測(cè)萊氏野村菌分生孢子液中浸5 s，然后移入盛有人工飼料的六孔板中，每孔放置5 頭，每處理120 頭，重復(fù)4 次，以0.05%吐溫-80 作為對(duì)照，連續(xù)觀察8 d，記錄死亡數(shù)。實(shí)驗(yàn)條件為26℃，光照時(shí)間14 h，施藥后第一天相對(duì)濕度90%，之后為75%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用幾率值分析法，將蟲體死亡率進(jìn)行幾率值轉(zhuǎn)換后用DPS 進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)，并分別對(duì)劑量和時(shí)間作線性回歸分析建立直線回歸模型，分別估計(jì)劑量效應(yīng)LC50和時(shí)間效應(yīng)LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的ITS 鑒定

電泳結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照，供試菌株目的片段長(zhǎng)度約為600 bp (圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示其長(zhǎng)度為619 bp，其中31-182 bp、183-370 bp、371-561 bp 分別為ITS1、5.8S rRNA、ITS2。BLAST 分析發(fā)現(xiàn)其與萊氏野村菌的同源性高達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)特征觀察，確定其為萊氏野村菌Nomuraea rileyi。圖2 為測(cè)序結(jié)果(GenBank登錄號(hào)為KM396227)。

圖1 真菌鑒定電泳圖片F(xiàn)ig.1 Electrophoresis of amplified DNA fragment

2.2 萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾幼蟲的毒力

由表1 可知，第3 天出現(xiàn)少量死亡的甜菜夜蛾幼蟲，孢子濃度為2.25×107個(gè)孢子/mL 和2.25×108個(gè)孢子/mL 時(shí)對(duì)幼蟲的感染效果較好，第3 天就有幼蟲死亡，5-8 d 的死亡率分別為76.67%、85.83%，87.50%、94.17%，93.33%、96.67%，97.5%、100%。孢子濃度為2.25×104個(gè)孢子/mL 的萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾的感染效果較差，直到第5 天幼蟲才開始死亡，而且到第8 天死亡率也不超過50%。

表2 和表3 表明，該菌對(duì)甜菜夜蛾幼蟲有較高的殺蟲活性，第5-8 天的LC50由3.6488×106降低到6.2180×104，而且差異顯著，LC95也從6.6605×108降低到1.2714×106。在2.25×105-2.25×108個(gè)孢子/mL 濃度下的LT50隨著濃度增加而逐漸縮短，即由7.4165 縮短到4.3292 d。

圖2 萊氏野村菌ITS 及5.8S rRNA 序列Fig.2 The ITS and 5.8S ribosomal RNA sequences of Nomuraea rileyi

表1 萊氏野村菌分生孢子液對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲的感染死亡率Table 1 Toxicity of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

表2 萊氏野村菌分生孢子對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲的致死中時(shí)Table 2 Median lethal time of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

表3 萊氏野村菌分生孢子對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲的致死中濃度Table 3 Median lethal concentration of Nomuraea rileyi to 3rd instar larvare of Spodoptera exigua

3 結(jié)論與討論

在害蟲防治中利用生物防治技術(shù)，可降低化學(xué)農(nóng)藥的使用量，減輕對(duì)環(huán)境的污染，保護(hù)利用天敵，促進(jìn)自然抑制能力的發(fā)揮而降低蟲口密度。目前使用的甜菜夜蛾的生物防治制劑包括蘇云金芽孢桿菌、甜菜夜蛾核型多角體病毒等(呂善運(yùn)等1997;郭慧芳等2003)，而真菌殺蟲劑使用報(bào)道尚少，仍然處于研究階段。本研究利用萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲進(jìn)行致病性測(cè)定，對(duì)其最高死亡率達(dá)100%，致死中濃度為6.2180×104個(gè)孢子/mL，當(dāng)孢子濃度為2.25×108個(gè)孢子/mL 致死中時(shí)為4.3292 d。周立峰等(2012)測(cè)定的5 株萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾的毒力偏低 (死亡率都未超過50%)，無法滿足應(yīng)用。朱春燕等(2011)測(cè)定的萊氏野村菌對(duì)甜菜夜蛾的LC50為2.43×105個(gè)孢子/mL，比本研究略高。因此，本研究獲得的萊氏野村菌具有較大的應(yīng)用前景。

真菌對(duì)害蟲的寄生必須有一個(gè)最小數(shù)量的入侵單位與寄主接觸，才能誘發(fā)疾病。如果低于這個(gè)數(shù)量，寄主就不能染病或者發(fā)病極低，起不到防治作用(包建中和古德祥，1998)。本研究中的萊氏野村菌在濃度為2.25×104個(gè)孢子/mL 時(shí)對(duì)甜菜夜蛾3 齡幼蟲的毒力偏低，甜菜夜蛾第8 天的死亡率僅為43.33%，即便第14 天死亡率也未超過50% (未發(fā)表數(shù)據(jù))。萊氏野村菌處理的甜菜夜蛾3 齡幼蟲 LC50、LC95分別為2.1721×105、9.5152×107，田間防治的防效一般應(yīng)在80% 以上，因此，萊氏野村菌用于甜菜夜蛾的防治濃度應(yīng)在1×106以上。

本研究致病力試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，甜菜夜蛾被萊氏野村菌菌株侵染后蟲體發(fā)硬，初期在僵蟲上產(chǎn)生白色菌絲，后期產(chǎn)生大量綠色的分生孢子。應(yīng)當(dāng)指出，上述萊氏野村菌處理前3 天，甜菜夜蛾幼蟲的死亡率都很低，4 d 后防治效果明顯提高。提高萊氏野村菌的殺蟲速度是突破制約其廣泛應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

隨著對(duì)食品安全問題的日益關(guān)注，國(guó)內(nèi)外越來越重視害蟲綜合治理(IPM)，主張以生物防治作為綜合防治的重要要素之一，而使用微生物農(nóng)藥是生物防治的手段。在各種殺蟲微生物中，真菌因能持續(xù)控制害蟲種群數(shù)量、生物安全性高、易于人工培養(yǎng)、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)而在害蟲種群控制方面具備很大的發(fā)展?jié)摿?，必將?1 世紀(jì)可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好型的理想農(nóng)藥。

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