錢衛(wèi)清 陳梅玉 仇惠英 鄭積富 魏計(jì)鋒 朱明清 岑建農(nóng) 潘金蘭 孫愛寧 吳德沛

惡性淋巴瘤是淋巴結(jié)和結(jié)外部位淋巴組織的免疫細(xì)胞腫瘤，目前淋巴瘤的診斷主要依靠病理切片檢查。但是惡性淋巴瘤的診斷和分型一直是病理學(xué)有爭議的領(lǐng)域之一，尤其是非霍奇金淋巴瘤組織學(xué)的改變復(fù)雜，與淋巴結(jié)的多種良性病變在常規(guī)染色形態(tài)學(xué)多有交叉，一定情況下鑒別困難，誤診率較高。本研究在常規(guī)染色形態(tài)學(xué)檢查同時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，以提高惡性淋巴瘤的確診率，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

1.標(biāo)本來源:筆者醫(yī)院2008 ～2011 年29 例門診及住院疑似淋巴瘤患者淋巴組織標(biāo)本，其中男性23 例，女性6 例，患者年齡13 ～80 歲，中位年齡58 歲。本研究29 例標(biāo)本全部采用病理學(xué)檢查和流式細(xì)胞術(shù)測定，其中24 例標(biāo)本另外采用細(xì)胞遺傳學(xué)檢查。

2.流式細(xì)胞術(shù)檢測:標(biāo)本的制備:新鮮的淋巴組織標(biāo)本置于生理鹽水中，剪切成直徑2 ～3mm 的小塊，放在特制的帶旋轉(zhuǎn)刀片的盒子中，加1ml 生理鹽水，以一定的速度旋轉(zhuǎn)刀片2～3min，將組織分散成單個(gè)細(xì)胞或極小的組織塊，然后用50μm 直徑的尼龍網(wǎng)過濾后，再用含0.1%牛血清白蛋白的PBS 低速(1000 ～1200r/min)離心5min，洗滌兩次，懸浮單個(gè)核細(xì)胞在洗液中備用。采用多個(gè)細(xì)胞系列的抗體(T 系、B系、髓系)和細(xì)胞發(fā)育早期和后期的抗體，利用三色免疫熒光染色，CD45/SSC 設(shè)門鑒別幼稚和成熟細(xì)胞，獲得較多參數(shù)分析。具體步驟如下:使用流式細(xì)胞儀，開機(jī)后以CaliBRITE3熒光微球和FACSComp 自動(dòng)檢查儀器靈敏度，并自動(dòng)設(shè)定實(shí)驗(yàn)的獲取條件，包括PMT 電壓和熒光補(bǔ)償?shù)龋缓筮M(jìn)入Multi-SET 自動(dòng)分析軟件或CellQuest 分析軟件，按軟件的提示自動(dòng)或手動(dòng)設(shè)置各T 淋巴細(xì)胞亞群門，獲取15000 個(gè)細(xì)胞，自動(dòng)分析各樣本管淋巴細(xì)胞免疫表型。

3.細(xì)胞遺傳學(xué)檢測:所有標(biāo)本按照常規(guī)方法制備染色體標(biāo)本及R 顯帶進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查。按上述方法制備細(xì)胞懸液后置37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，早晚定期搖勻培養(yǎng)物1 次。于終止培養(yǎng)前1h 加入秋水酰胺，終濃度為0.05μg/ml，阻留中期分裂相。將培養(yǎng)物1000r/min 離心10min，棄去上清，沿管壁緩慢加入37℃的0.075mol/L 的KCl 溶液6 ～8ml，混勻后至37℃恒溫箱30min。然后加入3∶1 甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混勻，1000r/min 離心10min 后棄上清，加新鮮配置的3∶1甲醇、冰醋酸固定液6 ～8ml，吹打混勻后再次離心10min，重復(fù)上述兩步，使細(xì)胞經(jīng)過3 次固定，制成合適濃度的細(xì)胞懸液。用吸管將細(xì)胞懸液吸取少量，從10cm 高處滴至一端傾斜15°的經(jīng)冰水或20%乙醇浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每張玻片2 ～3 滴，過火數(shù)次后使其干燥。將干燥的玻片放入預(yù)溫87.5℃的Earle's 溶液中，溫浴時(shí)間在60 ～120min 之間。然后用新鮮配制的10%Giemsa 染色液染色8 ～10min，取出水洗待干。核型異常根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2009)》的規(guī)定進(jìn)行描述。正常核型者至少分析20 個(gè)分裂象，異常核型者至少分析10 個(gè)分裂象，2 個(gè)或2 個(gè)以上具有相同的核型異常定為異?？寺?。

4.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):FCM 測定免疫表型分析參照WHO 2000 年惡性淋巴瘤分類法［1］。核型異常命名根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2009)》［2］的標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1.29 例患者最終診斷:29 例患者按照惡性淋巴瘤WHO 分類法最終診斷彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤6 例，間變大B 細(xì)胞淋巴瘤2 例，外周T 細(xì)胞性淋巴瘤2例，霍奇金淋巴瘤1 例，B 淋巴母細(xì)胞淋巴瘤1 例，T細(xì)胞血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤3 例，嗜酸細(xì)胞白血病1例，縱隔淋巴結(jié)大細(xì)胞癌1 例，巨球蛋白血癥1 例，脾邊緣區(qū)淋巴瘤1 例，淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤1 例，套細(xì)胞淋巴瘤2 例，濾泡性淋巴瘤3 例，未能明確分型的淋巴瘤4 例。其中有8 例病理診斷為反應(yīng)性增生或慢性炎癥，通過流式細(xì)胞儀和細(xì)胞遺傳學(xué)檢測而最終確診為外周T 細(xì)胞淋巴瘤1 例，霍奇金淋巴瘤1 例，T細(xì)胞血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤1 例，濾泡性淋巴瘤1例，嗜酸性白血病1 例，巨球蛋白血癥1 例，未明確分型的淋巴瘤2 例。

2.流式細(xì)胞儀對淋巴瘤診斷作用:流式細(xì)胞儀對表面抗原檢測，如果分析發(fā)現(xiàn)較多細(xì)胞群體有克隆性B 淋系或T 淋系，往往提示有惡性克隆的存在。另外可區(qū)分B 淋系還是T 淋系，7 例為T 淋系抗原表達(dá)，如例22，流式細(xì)胞儀檢測到CD30 陽性的成熟異常T淋系表達(dá)，而且染色體也發(fā)現(xiàn)異常，最終診斷T 細(xì)胞淋巴瘤。通過不同抗原檢測對區(qū)分不同亞型有指導(dǎo)意義，如例6 有強(qiáng)陽性CD20 表達(dá)，與病理切片提示濾泡性惡性淋巴瘤相符合，提示臨床上可采用抗CD20 單抗美羅華治療;例9 流式檢測符合MCL 表型，同時(shí)染色體也發(fā)現(xiàn)t(11;14)，支持套細(xì)胞淋巴瘤診斷。

3.核型分析意義:12 例患者檢測到異常核型，其中4 例淋巴結(jié)病理提示淋巴結(jié)炎或者增生但核型發(fā)現(xiàn)異常染色體改變，肯定了為惡性改變。例9 和例13 檢測到t(11;14)(p13;q11)，而例9 病理檢查為成熟克隆性B 淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀也檢測到異常的淋系表達(dá)符合套細(xì)胞淋巴瘤CD5+、CD10-、CD23-，核型分析肯定了套細(xì)胞淋巴瘤的診斷，例13 病理診斷為T 淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤，核型分析也肯定了病理診斷。例28 核型檢測到t(14;18)(q32;q21)，該易位是濾泡性淋巴瘤的特征性改變，但是病理提示右頸淋巴結(jié)反應(yīng)性增生，最后臨床診斷濾泡性淋巴瘤，經(jīng)過美羅華聯(lián)合CHOP 方案治療得到緩解。核型分析顯示9 例患者為復(fù)雜核型，提示預(yù)后不良。

討 論

惡性淋巴瘤分為霍奇金病和非霍奇金病兩大類，臨床以無痛性淋巴結(jié)腫大為典型特征，晚期有惡病質(zhì)、發(fā)熱及貧血。淋巴瘤的發(fā)生率近年來呈上升的趨勢，病死率為1.5/10 萬，占所有惡性腫瘤死亡位數(shù)的第11 ～13 位。淋巴瘤診斷依據(jù)淋巴組織活檢，通過病理切片形態(tài)和免疫病理診斷。流式細(xì)胞術(shù)是一種高通量的主要針對細(xì)胞的檢測方法，通過物理特性和其他熒光標(biāo)記方法達(dá)到對細(xì)胞分類篩選的目的。染色體異常與一些特異淋巴瘤類型有關(guān)，如套細(xì)胞淋巴瘤可見t(11;14)(q13;q32)，間變性大細(xì)胞淋巴瘤中可見t(2;5)(q23;q32)，Burditt 淋巴瘤有t(8;14)(q24;q32)，濾泡性淋巴瘤可見t(14;18)(p32;q21)。但因淋巴瘤診斷很多情況下在各個(gè)科室因懷疑其他疾病比如扁桃腺腫大、鼻咽部腫瘤或者胃腸道腫瘤行手術(shù)切除，病理切片后診斷，而標(biāo)本已經(jīng)固定石蠟包埋，無法再次得到新鮮標(biāo)本行染色體和流式細(xì)胞儀檢查，另外有時(shí)因取材較少比如是穿刺標(biāo)本或者小淋巴結(jié)，不能實(shí)施多種方法檢測，因此目前國內(nèi)較少同時(shí)開展淋巴組織的分子生物學(xué)的多項(xiàng)檢測。筆者在3年期間有意識留取29 例疑似淋巴瘤的病例，結(jié)果顯示標(biāo)本中病理學(xué)檢查與FCM 檢查結(jié)果符合的有21例(72.4%)，不符合的有8 例(27.6%)。

雖然病理學(xué)檢查是疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是病理學(xué)檢查鏡下分析細(xì)胞少，同時(shí)受到主觀判斷影響，不難發(fā)現(xiàn)病理學(xué)檢查對淋巴瘤的診斷存在一定的漏診率和誤診率;而且單純的形態(tài)學(xué)檢查只能描述惡性細(xì)胞在淋巴結(jié)的位置和特殊形態(tài)，無法提示分化階段，對臨床醫(yī)生治療方案的選擇以及患者的預(yù)后評估也不能提供有效的依據(jù)。Lanne 等［3］通過組織樣本穿刺的方法獲得424 例淋巴組織樣本，采用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)方法檢測，證實(shí)兩種檢測方法對低度惡性B-NHL 的一致性為95%，淋巴濾泡增生為97%，而高度惡性的B-NHL 及T-NHL 一致性稍低，分別為78%及53%。NHL 是惡性淋巴系單克隆增生，80%起源于B 細(xì)胞，20%起源于T 細(xì)胞或非B 非T 細(xì)胞。FCM 通過激光照射細(xì)胞產(chǎn)生FSC 和SSC 來區(qū)分細(xì)胞群體，其中FSC 的數(shù)值和細(xì)胞大小呈正比，SSC 的數(shù)值和細(xì)胞顆粒度的多少呈正比。

免疫熒光法測定細(xì)胞表面抗原對淋巴瘤的免疫分型有重要的意義。例如套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)為B淋巴克隆性疾病，表達(dá)CD19、CD20、CD22、CD43，IgM 中度表達(dá)，IgD 弱表達(dá)或陰性，多數(shù)病例CD5+/CD23-、CD10 陰性。濾泡性淋巴瘤(FL)CD19、CD20、CD22 陽性，經(jīng)常表達(dá)CD23、FMC7、CD10，缺乏CD5、CD43、CD11c 和CD103，因此可以利用細(xì)胞表面抗原表達(dá)的特異性進(jìn)行淋巴瘤類型的區(qū)別。本研究中1 例套細(xì)胞淋巴瘤患者染色體檢查出t(11;14)異常并伴有其他染色體異常的復(fù)雜核型，這與多數(shù)學(xué)者所報(bào)道的MCL 具有t(11;14)(q13;q32)特異的細(xì)胞遺傳學(xué)改變是符合的。t(11;14)(q13;q32)改變引起B(yǎng)CL-1/PRAD -1 重排，導(dǎo)致原癌基因CyclinD1蛋白的表達(dá)。Bosch 等報(bào)道PRAD - 1/CyclinD1 是MCL 敏感及特異的的分子標(biāo)志，F(xiàn)CM 檢測該蛋白可以為MCL 提供診斷依據(jù)，因病例數(shù)少筆者未開展此項(xiàng)檢測。有報(bào)道證實(shí)，淋巴瘤的標(biāo)本產(chǎn)生特異的細(xì)胞群的概率與炎性增生等非淋巴瘤標(biāo)本產(chǎn)生特異細(xì)胞群的概率比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，但是不能排除淋巴結(jié)內(nèi)細(xì)胞種類多而復(fù)雜，特異細(xì)胞較少產(chǎn)生的假陽性和假陰性結(jié)果，所以FCM 不能取代病理學(xué)檢查。

Colorado 等［4］對223 個(gè)淋巴組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)FCM 敏感度和特異性分別為87. 25% 和95.95%，對霍奇金淋巴瘤和富于T 細(xì)胞/組織細(xì)胞大B 細(xì)胞淋巴瘤的診斷，F(xiàn)CM 診斷較為困難，這可能與兩者的生物學(xué)特性相似，＜10%的克隆性B 細(xì)胞亞群會(huì)伴隨有T 淋巴細(xì)胞毒性的改變。排除霍奇金淋巴瘤后，F(xiàn)CM 診斷的敏感度明顯提高。病理上確診的淋巴瘤患者考慮骨髓或中樞侵犯，可行骨髓或腦脊液FCM 檢測可以明確診斷，尤其是區(qū)分細(xì)胞發(fā)育早期和晚期，淋巴母細(xì)胞淋巴瘤、ALL 均是淋巴細(xì)胞發(fā)育早期階段，相應(yīng)的早期抗原和系列抗原陽性。彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤和彌漫性小無裂細(xì)胞淋巴瘤是淋巴細(xì)胞發(fā)育晚期階段的腫瘤，相應(yīng)的晚期抗原和系列抗原陽性。

一項(xiàng)多中心研究報(bào)道，對174 例初診高危NHL患者行FCM 及腦脊液細(xì)胞學(xué)檢測，F(xiàn)CM 發(fā)現(xiàn)10%(18/174)患者腦脊液陽性，而細(xì)胞學(xué)檢測4%(P ＜0.001)［5］。FCM 檢測腦脊液陽性的患者無論兩年無病生存率及總生存率均低于陰性患者。對高危NHL患者通過FCM 行腦脊液檢查降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)及改善預(yù)后有重要意義。而Alvarez 等［6］也做了相應(yīng)的研究，認(rèn)為雖然FCM 檢測比傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)更為敏感和特異，但是并未減低中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)發(fā)率。而染色體檢查對淋巴瘤的診斷有進(jìn)一步補(bǔ)充的作用。不同的淋巴瘤有特異的性的染色體改變，如t(14;18)(q32;q21)和t(11;14)(q13;q32)分別有助于FL和MCL 的診斷［4］。許多染色體的異位又引起一些新的融合基因和蛋白表達(dá)，這些融合基因和蛋白反應(yīng)淋巴瘤的發(fā)生機(jī)制，對淋巴瘤的診斷和分型，特別是形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)難以確定的病例的診斷和分型有重要意義。

本研究通過3 種方法組合檢測對29 例患者進(jìn)行了精確的分類，各種類型均有，這單憑病理學(xué)檢查是做不到的。特別是8 例病理診斷為反應(yīng)性增生或慢性炎癥，通過流式細(xì)胞儀和細(xì)胞遺傳學(xué)檢測而最終確診為外周T 細(xì)胞淋巴瘤1 例，霍奇金淋巴瘤1 例，T細(xì)胞血管免疫母細(xì)胞淋巴瘤1 例，濾泡性淋巴瘤1例，嗜酸性白血病1 例，巨球蛋白血癥1 例，未明確分型的淋巴瘤2 例，避免了漏診。流式細(xì)胞儀對表面抗原檢測可以發(fā)現(xiàn)是否有克隆性B 淋系或T 淋系異常表達(dá)，本研究病例7 例(24.1%)為T 淋系抗原表達(dá)與文獻(xiàn)報(bào)道的80%起源于B 細(xì)胞，20%起源于T 細(xì)胞或非B 非T 細(xì)胞結(jié)果相類似，同樣FCM 檢測到一些病例有強(qiáng)陽性CD20 表達(dá)，為治療上選擇抗CD20單抗提供了依據(jù)。本研究細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析12 例患者檢測到異常核型，肯定了患者為惡性改變，同時(shí)一些特異性染色體改變?nèi)鐃(11;14)(p13;q11)和t(14;18)(q32;q21)對特定亞型診斷具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，淋巴組織病理學(xué)檢查是診斷惡性淋巴瘤的基礎(chǔ)，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)以及染色體檢查可以提高惡性淋巴瘤的診斷率，并對淋巴瘤亞型分型以及預(yù)后判斷具有指導(dǎo)意義，值得臨床開展。

1 Evans LS，Hancook BW.Non -hodgkin lymphoma［J］. Lancet，2003，362(9378):139 -146

2 Shaffer LG，Slovak ML，Campbell LJ. ISCN(2009):an international system for human cytogenetic nomenclature［M］.Basel:S.Karger，2009

3 Laane E，Tani E，Bjorklund E，et al. Flow cytometric immunophenotyping including Bcl-2 detection on fine needle aspirates in the diagnosis of reactive lymphadenopathy and non-Hodgkin＇s lymphoma［J］.Cytometry B Clin Cytom，2005，64(1):34 -42

4 Colorado M，Cuadrado MA，Insunza A，et al. Simultaneous cytomorphologic and multiparametric flow cytometric analysis on lymph node samples is faster than and as valid as histopathologic study to diagnose most non-Hodgkin lymphomas［J］. Am J Clin Pathol，2010，133(1):83 -91

5 Benevolo G，Stacchini A，Spina M，et al. Final results of a multicenter trial addressing role of CSF flow cytometric analysis in NHL patients at high risk for CNS dissemination［J］. Blood，2012，120(16):3222 -32228

6 Alvarez R，Dupuis J，Plonquet A，et al. Clinical relevance of flow cytometric immunophenotyping of the cerebrospinal fluid in patients with diffuse large B-cell lymphoma［J］. Ann Oncol，2012，23(5):1274 -1279