戴 瑩，劉金鳳，牛雪薇 綜述;張志民 審校

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，吉林長春130000)

DnaK是熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)的重要分子伴侶，對許多G+菌在應(yīng)激環(huán)境下的耐受以及蛋白質(zhì)的折疊、翻譯、合成和分解都有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，dnaK操縱子是參與編碼與熱休克反應(yīng)相關(guān)的保守蛋白質(zhì)，且在進(jìn)化過程中會(huì)發(fā)生改變［1］。dnaK 操縱子由 hrcA、grpE、dnaK、dnaJ基因組成，其中DnaK和DnaJ都被用于構(gòu)建各種生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。通過利用與grpE的氨基酸序列同源性得到一個(gè)G+菌基于部分蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹，該結(jié)果與從5S rRNA、16S rRNA、dnaK和dnaJ序列基因產(chǎn)生的進(jìn)化樹相比得出3種群集:由芽孢桿菌屬和金黃色葡萄球菌組成的低GMC DNA的G+菌(鏈球菌/乳酸乳球菌/腸球菌/清酒乳桿菌)，以及由分支桿菌和天藍(lán)色鏈霉菌屬高GMC DNA的G+菌組成的第3群集［2］。下面就己發(fā)現(xiàn)的danK操縱子的基因及其結(jié)構(gòu)、可能的作用機(jī)制、功能以及研究意義等方面作一綜述。

1 danK操縱子的基因結(jié)構(gòu)

dnaK 操縱子由 hrcA、grpE、dnaK、dnaJ 4個(gè)結(jié)構(gòu)基因組成，hrcA-grpE-dnaK-dna是 G+菌中dnaK操縱子的最基本也是最常見的結(jié)構(gòu)，例如枯草芽孢桿菌［3］、金黃色葡萄球菌［4］和丙酮丁醇梭菌［4-5］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在枯草芽孢桿菌中有3個(gè)額外基因被轉(zhuǎn)錄［6］，變異鏈球菌dnaK操縱子的長度與枯草芽孢桿菌相似［7］?？寺》治鍪塞}四聯(lián)球菌JCM5888的dnaK操縱子的結(jié)果表明，該操縱子同樣由4個(gè)開放閱讀框hrcA-grpE-dnaK-dnaJ組成;清酒乳桿菌LTH681的dnaK操縱子基因結(jié)構(gòu)也由 hrcA-grpE-dnaK-dnaJ組成［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，在一些G+菌中dnaK操縱子結(jié)構(gòu)基因的組成存在一定差異。利用巨大芽孢桿菌的dnaK操縱子的內(nèi)部片段作為探針進(jìn)行測序顯示，在序列orf39-grpE-dnaK-dnaJ中有4個(gè)開放閱讀框架，但開放閱讀框Orf39所編碼的多肽生物學(xué)功能未知，與數(shù)據(jù)庫中的蛋白也無顯著同源性［8］。Eaton［9］、Van Asseldonk［10］等報(bào)道，乳酸乳球菌的dnaK操縱子結(jié)構(gòu)基因不包括dnaJ基因［9-10］，枯草芽孢桿菌的dnaK操縱子為七順反子結(jié)構(gòu)，包含3個(gè)附加的熱休克基因均位于dnaJ基因的下游;而金黃色葡萄球菌和丙酮丁醇梭菌有1個(gè)下游基因。

在hrcA起始密碼子的上游有一個(gè)高度保守的反向重復(fù)序列，稱為CIRCE元件。此元件與dnaK操縱子的調(diào)控及轉(zhuǎn)錄機(jī)制密切相關(guān)。

2 danK操縱子的作用機(jī)制

dnaK操縱子的調(diào)控機(jī)制與CIRCE元件息息相關(guān)，通過HrcA蛋白與CIRCE元件相互作用而對其進(jìn)行調(diào)控［8］。目前，CIRCE元件在枯草芽孢桿菌［11］和金黃色葡萄球菌［12］中已被廣泛研究。大量研究表明，hrcA基因產(chǎn)物作為負(fù)調(diào)控因子，可通過與CIRCE元件結(jié)合而介導(dǎo)反饋抑制作用［13］。在低鹽、低溫等環(huán)境下，HrcA產(chǎn)物可抑制 dnaK操縱子相關(guān)結(jié)構(gòu)基因 dnaK、grpE及 dnaJ的表達(dá);當(dāng)鹽度、溫度升高后，這種抑制作用即得到解除，相關(guān)基因的表達(dá)量上升［14］。hrcA產(chǎn)物可充當(dāng)一類熱休克基因的負(fù)調(diào)控蛋白。對dnaK操縱子在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控，并使其轉(zhuǎn)錄由熱、鹽和乙醇等誘導(dǎo)［8］。

hrcA基因是枯草桿菌dnaK操縱子的第一個(gè)編碼基因，雖然枯草桿菌的3種熱休克基因由不同機(jī)制所調(diào)節(jié)，然而只有一個(gè)熱休克調(diào)節(jié)子是由瞬變的溫和的熱應(yīng)力所誘導(dǎo)的。有研究通過將枯草桿菌染色體上的dnaK操縱子第一個(gè)基因hrcA敲除，并構(gòu)建hrcA的無效突變體(null mutant)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):來自野生型枯草桿菌和突變菌株的hrcA基因所編碼的蛋白質(zhì)HrcA均可在轉(zhuǎn)錄水平上強(qiáng)烈抑制熱休克所誘導(dǎo)的dnaK操縱子mRNA的表達(dá)水平，低溫下實(shí)驗(yàn)時(shí)也得到了同樣的結(jié)果;提示，hrcA產(chǎn)物可充當(dāng)I類熱休克基因的負(fù)調(diào)控蛋白［15］。

對細(xì)菌熱休克操縱子的轉(zhuǎn)錄組織進(jìn)行分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，初級轉(zhuǎn)錄物可以進(jìn)行進(jìn)一步的處理。Segal、Ron 等［1］(1996)就已經(jīng)證實(shí)，在農(nóng)桿菌熱休克反應(yīng)中g(shù)roESL多順反子存在位點(diǎn)特異性裂解，而這個(gè)基因間隔區(qū)的裂解是二次加工的，以允許在多順反子操縱子內(nèi)基因的差別表達(dá)。Homuth等［6］(1997)研究枯草芽孢桿菌dnaK操縱子的特殊裂解初級轉(zhuǎn)錄物時(shí)，描述了hrcA基因和grpE基因之間的基因間加工位點(diǎn)，并認(rèn)為其可能在基因差別表達(dá)中發(fā)揮一定的作用;此外，該研究還描述了枯草芽孢桿菌dnaK操縱子的位于dnaK編碼序列內(nèi)的降解位點(diǎn)，并認(rèn)為這些位點(diǎn)的裂解是通過引入核糖核酸外切酶插入位點(diǎn)來加速RNA分子的分解;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌的dnak操縱子的初級轉(zhuǎn)錄物也同樣會(huì)裂解產(chǎn)生較小的裂解產(chǎn)物，其裂解位點(diǎn)位于dnaK編碼序列內(nèi)，并據(jù)此認(rèn)為，在清酒乳桿菌中該位點(diǎn)所充當(dāng)?shù)膽?yīng)是降解位點(diǎn)而不是加工位點(diǎn)。

大部分的I類熱休克基因均具有單一組的CIRCE元件?？莶菅挎邨U菌P23S啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)具有受滲透壓調(diào)節(jié)、高表達(dá)水平系統(tǒng)的特性［16］。清酒乳桿菌LTH681的dnaK操縱子的轉(zhuǎn)錄組織與丙酮丁醇梭菌［5］和枯草芽孢桿菌［6］相似。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的分析表明，清酒乳桿菌dnaK操縱子的上游是crA型啟動(dòng)子(P2)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)可根據(jù)所施加的應(yīng)力條件而發(fā)生改變;提示，該調(diào)節(jié)位點(diǎn)在DNA水平上起類似順式元件的作用，其可能參與mRNA在不同條件下的半衰期的調(diào)節(jié)［17］。另有研究發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌的啟動(dòng)子(P3)能假定位于dnaK基因和dnaJ基因之間，其序列與枯草芽孢桿菌的crB-依賴型啟動(dòng)子相似，并參與了Ⅱ類熱休克基因的誘導(dǎo)［18］。然而，清酒乳桿菌的啟動(dòng)子(P3)并不表現(xiàn)為功能性，因?yàn)樵赑2啟動(dòng)子調(diào)控下的，通過熱、鹽或乙醇等應(yīng)激誘導(dǎo)基因引物延伸的實(shí)驗(yàn)中并沒有檢測到轉(zhuǎn)錄起始［19］。因此，我們可以得出結(jié)論:清酒乳桿菌中位于dnaK操縱子遠(yuǎn)端的dnaJ基因的轉(zhuǎn)錄是由啟動(dòng)子P2和在終止子T2處的一段通讀所介導(dǎo)的。

3 dnaK操縱子的功能

dnaK操縱子對于細(xì)菌在各種環(huán)境壓力中生長具有重要意義。肉毒梭狀芽胞桿菌hrcA突變體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激后，hrcA突變體比野生菌株顯示出高水平的指數(shù)增長，而dnaK突變體在不同測試溫度、pH值、NaCl濃度條件下均顯示出生長抑制;提示，dnaK操縱子在肉毒梭狀芽孢桿菌應(yīng)對各種環(huán)境壓力時(shí)具有重要作用［11］。

嗜鹽四聯(lián)球菌是一種中度嗜鹽的 G+乳酸菌［20］，當(dāng)在高鹽濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其菌細(xì)胞內(nèi)不僅積累鈉離子，還積累大量的鉀離子和多種有機(jī)物質(zhì)作為相容性溶質(zhì)［21］。對嗜鹽四聯(lián)球菌dnaK操縱子在高細(xì)胞內(nèi)滲透壓條件下的功能表達(dá)，以及蛋白質(zhì)疏水性相互作用結(jié)構(gòu)的增加進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其dnaK操縱子的特性能更好的解釋該菌的高鹽度適應(yīng)機(jī)制。

dnaK操縱子所編碼的蛋白DnaK(伴侶蛋白DnaK)主要由α-螺旋和β-折疊組成，基本不含無規(guī)則卷曲，具有耐熱蛋白質(zhì)的特征［22］。嗜鹽四聯(lián)球菌dnaK的氨基酸序列與乳酸乳球菌、清酒乳桿菌和枯草芽孢桿菌相應(yīng)的Dank同系物具有較高的相似性。使用pET表達(dá)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，嗜鹽四聯(lián)球菌的dnaK在大腸桿菌中過度表達(dá)，而純化的DnaK參與形成ATP酶以及重折疊活動(dòng);在大腸桿菌的耐熱機(jī)制中DnaK有蛋白聚集的預(yù)防和復(fù)性作用［23］。Northern雜交分析表明，dnaK基因的轉(zhuǎn)錄被熱休克誘導(dǎo)，幾個(gè)檢測到的轉(zhuǎn)錄物均包括一個(gè)四順反子的mRNA，相當(dāng)于完整的dnaK操縱子的尺寸;在高濃度NaCl而KCl濃度不同的條件下，dnaK轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量增加約3.5倍;以上結(jié)果表明，克隆的DnaK可充當(dāng)功能分子伴侶，并在鹽度適應(yīng)過程中起重要作用［24］。Jovanovic 等［24］認(rèn)為，在嗜鹽四聯(lián)球菌dnaK操縱子啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)CIRCE元件可能有助于轉(zhuǎn)錄的精密調(diào)控，以制定適應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)對環(huán)境的壓力;大腸桿菌的熱休克蛋白70分子伴侶系統(tǒng)，因其許多功能而廣泛應(yīng)用于防止蛋白聚集，并可作為蛋白穩(wěn)定因子而適應(yīng)于脅迫條件。

另有研究發(fā)現(xiàn)，其他兩個(gè)熱休克蛋白DnaJ和GrpE可以激發(fā)DnaK伴侶的活性，在DnaJ和GrpE存在的條件下，DnaK的 ATPase活性可提高50倍［25］。目前，關(guān)于dnaK功能和高溫?fù)p傷之間的關(guān)系已被詳細(xì)研究［26］。近來有報(bào)道，大腸桿菌的dnaK突變株未能質(zhì)壁分離復(fù)原和適應(yīng)高鹽度，該突變株不能保持適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)K+濃度［27-28］。因此，dnaK操縱子對于大腸桿菌適應(yīng)高滲透壓十分重要。

4 dnaK操縱子的研究意義

盡管dnaK操縱子的分子機(jī)制尚未完全明了，但研究已發(fā)現(xiàn)了多種G+菌中dnaK伴侶蛋白的作用機(jī)制［29］，并分離和測定了許多細(xì)菌的dnaK操縱子以及與之相關(guān)的基因及其蛋白。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，dnaK基因編碼的熱休克蛋白DnaK蛋白(Hsp70)在保護(hù)微生物應(yīng)對環(huán)境壓力和食品保存中均扮演著重要的角色［30］。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對變異鏈球菌耐氟菌株的dnaK操縱子的研究也取得顯著成果。研究發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌耐氟菌株的耐酸性比親代菌株增強(qiáng)與dnaK操縱子有密切的聯(lián)系［31］。從而也為今后臨床更合理的應(yīng)用氟化物防齲，以及齲病預(yù)防藥物的研發(fā)提供了一定的理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)于肉毒梭狀芽胞桿菌的dnaK操縱子對該菌應(yīng)對各種環(huán)境壓力(溫度、pH 值、NaCl等)［11］的研究成果，對于應(yīng)對哺乳動(dòng)物腸道傷口以及食物加工過程中肉毒桿菌增長的問題具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，dnaK操縱子編碼的DnaJ蛋白對于豬鏈球菌2型的耐熱性及其對宿主粘附機(jī)制均具有重要作用，加之DnaJ蛋白具有良好的免疫原性，提示DnaJ可能是潛在亞單位疫苗的候選［32］。

相信隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)各項(xiàng)研究技術(shù)的發(fā)展，dnaK操縱子的反應(yīng)機(jī)制將得到進(jìn)一步詮釋，也將為分子水平的預(yù)防、基因治療等提供新思路和新方法。

［1］Segal G，Ron EZ.Regulation and organization of the groE and dnaK operons in Eubacteria［J］.FEMS Microbiol Lett，1996，138(1):1-10.

［2］Ahmad S，Selvapandiyan A，Bhatnagar RK.Phylogenetic analysis of gram-positive bacteria based on grpE，encoded by the dnaK operon［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2000，50(5):1761-1766.

［3］Wetzstein M，V?lker U，Dedio J，et al.Cloning，sequencing，and molecular analysis of the dnaK locus from Bacillus subtilis［J］.J Bacteriol，1992，174(10):3300-3310.

［4］Ohta T，Saito K，Kuroda M，et al.Molecular cloning of two new heat shock genes related to the hsp70 genes in Staphylococcus aureus［J］.J Bacteriol，1994，176(15):4779-4783.

［5］Narberhaus F，Giebeler K，Bahl H.Molecular characterization of the dnaK gene region of Clostridium acetobutylicum，including grpE，dnaJ，and a new heat shock gene［J］.J Bacteriol，1992，174(10):3290-3299.

［6］Homuth G，Masuda S，Mogk A，et al.The dnaK operon of Bacillus subtilis is heptacistronic［J］.J Bacteriol，1997，179(4):1153-1164.

［7］Jayaraman GC，Penders JE，Burne RA.Transcriptional analysis of the Streptococcus mutans hrcA，grpE and dnaK genes and regulation of expression in response to heat shock and environmental acidification［J］.Mol Microbiol，1997，25(2):329-341.

［8］Wetzstein M，V?lker U，Dedio J，et al.Cloning，sequencing，and molecular analysis of the dnaK locus from Bacillus subtilis［J］.J Bacteriol，1992，174(10):3300-3310.

［9］Eaton T，Shearman C，Gasson M.Cloning and sequence analysis of the dnaK gene region of Lactococcus lactis subsp.lactis［J］.J Gen Microbiol，1993，139(12):3253-3264.

［10］Van Asseldonk M，Simons A，Visser H，et al.Cloning，nucleotide sequence，and regulatory analysis of the Lactococcus lactis dnaJ gene［J］.J Bacteriol，1993，175(6):1637-1644.

［11］Selby K，Lindstr?m M，Somervuo P，et al.Important role of class I heat shock genes hrcA and dnaK in the heat shock response and the response to pH and NaCl stress of group I Clostridium botulinum strain ATCC 3502［J］.Appl Environ Microbiol，2011，77(9):2823-2830.

［12］Zuber U，Schumann W.CIRCE，a novel heat shock element involved in regulation of heat shock operon dnaK of Bacillus subtilis［J］.J Bacteriol，1994，176(5):1359-1363.

［13］Diamant S，Rosenthal D，zem A，et al.Dicarboxylic amino acids and glycine-betaine regulate chaperone-mediated protein-disaggregation under stress.［J］.Mol Microbiol，2003，49:401-410.

［14］盧良坤.嗜鹽四聯(lián)球菌 clpB，dnaK，hrcA基因在耐鹽機(jī)制中的相互作用［D］.廣州:華南理工大學(xué)，2013.

［15］Schulz A，Schumann W.hrcA，the first gene of the Bacillus subtilis dnaK operon encodes a negative regulator of class I heat shock genes［J］.J Bacteriol，1996，178(4):1088-1093.

［16］張煒煒.枯草芽孢桿菌滲透壓調(diào)控啟動(dòng)子的鑒定與功能分析［D］.咸陽:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

［17］Broadbent JR，Oberg CJ，Wei L.Characterization of the＜ i＞Lactobacillus helveticus groESL ＜ /i＞ operon［J］.Res Microbiol，1998，149(4):247-253.

［18］Ohta T，Nettikadan S，Tokumasu F，et al.Atomic force microscopy proposes a novel model for stem-loop structure that binds a heat shock protein in the＜ i＞ staphylococcus aureus＜/i＞HSP70 operon［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，226(3):730-734.

［19］Hecker M，Schumann W，V?lker U.Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis［J］.Mol Microbiol，1996，19(3):417-428.

［20］Collins MD1，Williams AM，Wallbanks S.The phylogeny of Aerococcus and Pediococcus as determined by 16S rRNA sequence analysis:description ofTetragenococcus gen.nov［J］.FEMS Microbiol Lett，1990 ，58(3):255-62.

［21］Robert H，Le Marrec C，Blanco C，et al.Glycine betaine，carnitine，and choline enhance salinity tolerance and prevent the accumulation of sodium to a level inhibiting growth of Tetragnococcus halophila［J］.Appl.Environ.Microbiol，2000，66(2):509-517.

［22］劉明鵬，焦凌霞，李剛，等.酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌 DnaK基因克隆及生物信息學(xué)分析［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2014(7):199-206.

［23］朱捷，楊成君，王軍.熒光定量PCR技術(shù)及其在科研中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2009，2:73-76.

［24］Jovahovic G，Lloyd LJ，Stumpf MPH，et al.Induction and function of the phage shock protein extracytoplasmic stress response in Escherichia coli［J］.J Biol Chem，2006，281(30):21147-21161.

［25］Boshoff A.The in vivo and in vitro characterization of DnaK from agrobacterium tumefaciens RUOR.［J］.Protein Expression and Purif，2004，38(2):161-169.

［26］Hartl FU.Molecular chaperones in cellular protein folding［J］.Nature，1996，381(6583):571-580.

［27］Meury J，Kohiyama M.Role of heat shock protein DnaK in osmotic adaptation of escherichia coli［J］.J Bacteriol，1991，173(14):4404-4410.

［28］el Yaagoubi A ，Richarme G.Localization of DnaK(chaperone 70)from Escherichia coli in an osmotic-shock-sensitive compartment of the cytoplasm.［J］.J Bacteriol，1994，176(22):7074-7078.

［29］盧春英.變形鏈球菌耐氟菌株全基因組測序［D］.長春:吉林大學(xué)，2014.

［30］Kumar CM，Mande SC，Mahajan G.Multiple chaperonins in bacteria-novel functions and non-canonical behaviors［J］.Cell Stress Chaperones，2015，20(4):555-574

［31］Jiao L，Ran J，Xu X，et al.Heat，acid and cold stresses enhance the expression of DnaK gene in alicyclobacillus acidoterrestris［J］.Food Research International，2015，67:183-192.

［32］Zhang X，Jiang X，Yang L，et al.DnaJ of Streptococcus suis type 2 contributes to cell adhesion and thermotolerance［J］.J Microbiol Biotechnol，2014，24［Epub ahead of print］.