孫 艷， 李 娜， 陸 穎， 余圓圓， 陳 鈞

（江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

大蒜素與鹽酸小檗堿聯(lián)用體外抗菌試驗

孫 艷， 李 娜， 陸 穎， 余圓圓， 陳 鈞*

（江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的 研究大蒜素聯(lián)合鹽酸小檗堿對臨床常見菌及耐藥菌的抗菌效果。方法 采用微量肉湯稀釋法測定供試藥物對4個常見菌，2個標準菌，和2個耐藥菌的最小抑菌濃度 （MIC），微量棋盤稀釋法和時間—殺菌曲線法評價兩藥對各試驗菌株的聯(lián)合作用。結果 當兩藥單獨應用時，其MIC值范圍分別為大蒜素156.25（敏感株） ～1250（耐藥株）μg/mL，鹽酸小檗堿78.125（敏感株）～312.5（耐藥株）μg/mL。當兩藥聯(lián)合應用時，部分抑菌濃度指數(shù) （FICI）值為0.75～1，為相加作用。從24 h時間—殺菌曲線可以發(fā)現(xiàn)，當兩藥單獨應用時，即使在4×MIC下，也未能顯示殺菌效應，而聯(lián)用時在相對較低質(zhì)量濃度下顯示出殺菌作用；還顯示出在低于MIC下具有弱協(xié)同 （敏感株）或者相加作用 （耐藥株）。結論 大蒜素和鹽酸小檗堿聯(lián)合應用，具有良好的抗菌作用。

大蒜素；鹽酸小檗堿；抗菌；協(xié)同作用

大蒜素（diallyl trisulfide，DATS），為百合科蔥屬植物大蒜中的一種有機硫化合物，在熟大蒜中含有量較高［1-3］。它具有廣譜的抗菌［4］、 抗真菌［5］、抗衣原體、抗支原體和抗病毒［6］等作用。目前，大蒜素膠囊已用于臨床治療由病毒和細菌感染的疾病。鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride，BBH），為小檗科植物中一種天然的異喹啉類生物堿，具有廣譜抗菌作用［7］，其片劑和膠囊一直應用于臨床。我國古代經(jīng)典中醫(yī)藥學著作 《普濟本事方》記載有 “治臟毒，蒜連圓。鷹爪黃連末，用獨頭蒜一顆，煨香爛熟，研和入臼，治圓如梧子大。陳米飲下。此藥神妙”處方。該處方用于治療臟毒 （即腸道感染性疾病），按照現(xiàn)代研究，該方劑的主要藥效成分為大蒜素和鹽酸小檗堿［8-10］。

現(xiàn)代公共衛(wèi)生面臨的問題之一是耐藥菌及其引起的慢性感染性疾病。而目前尚未見該處方的兩種主要成分大蒜素和鹽酸小檗堿聯(lián)合應用時的抗耐藥菌活性研究，故本試驗進行了大蒜素和鹽酸小檗堿抗六種腸道病原菌的活性研究，并重點進行了抗產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的活性研究。

1 實驗材料與儀器

1.1 供試藥物 大蒜素 （DATS，批號20131129，江蘇正大清江制藥有限公司）；鹽酸小檗堿（BBH，批號20140115，南京春秋生物科技有限公司）；注射用硫酸鏈霉素 （批號120418，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；注射用青霉素鈉 （批號S120705，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）。

1.2 試驗菌株 大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853（鎮(zhèn)江市疾病預防控制中心）；溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、肺炎克雷伯菌（Klebisella pneumoniae）、產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌（producing extended-spectrum beta-lactamases E.coli，ESBLs）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）（江蘇大學附屬江濱醫(yī)院病理科）。

1.3 主要試劑及儀器 SPX-250B型生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；SHZ-88型水浴恒溫震蕩器（江蘇省金壇市醫(yī)療器械廠）；SW-CJ 2FD雙人單面凈化工作臺 （蘇州凈化設備有限公司）；TG328A電子分析天平（德國Sartorius公司）；LSB50L型立式壓力蒸汽滅菌器 （江蘇省金壇市醫(yī)療器械廠）；96孔微量板 （美國Coring公司）；可調(diào)式移液槍（美國Thermo electron corporation）。

吐溫-20（批號20140603，國藥集團化學試劑有限公司）；氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC，上海試劑三廠）；MHB、MHA培養(yǎng)基 （南京森貝伽生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 供試藥液的制備 大蒜素溶液的制備：以20%的吐溫-20為溶劑，配置10 mg/m L的大蒜素溶液。鹽酸小檗堿試劑：以無菌水為溶劑，配置5 mg/mL的鹽酸小檗堿溶液。硫酸鏈霉素、青霉素鈉溶液的制備：以生理鹽水為溶劑，配置1 280 U/m L的溶液。

2.2 菌懸液的制備 將各試驗菌株接種于MHA培養(yǎng)基上，37℃活化培養(yǎng)增菌18～24 h，取單個菌于MHB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24 h。用滅菌生理鹽水調(diào)整濁度至0.5麥氏（約為1.5×108CFU/ mL），備用。

2.3 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測定 采用標準微量肉湯稀釋法［11］，分別測定大蒜素與鹽酸小檗堿對幾種試驗菌株的MIC值。在滅菌96孔平底微量板上，第1列每孔加入100μL供試藥液和100μL的MHB培養(yǎng)基，混勻后，取第1列中藥液100μL加入到第2列每孔，與第2列每孔中加入100μL的MHB培養(yǎng)基混勻后，從第2列中取100μL加入第3列，依次按照液體的2倍稀釋法將已制備的大蒜素及鹽酸小檗堿溶液分別稀釋至5～0.039 06 mg/mL和2.5～0.019 53 mg/m L。同時做溶劑對照，注射用硫酸鏈霉素和注射用青霉素鈉做陽性藥物對照。加入已調(diào)至約1.5×106CFU/mL的各試驗菌株的菌懸液

10μL，最后的接種量控制在1.5×105CFU/mL。在37℃下，培養(yǎng)18～24 h。然后，每孔加入0.25%TTC 5μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用肉眼觀察培養(yǎng)孔，呈現(xiàn)紅色為有菌生長，在陰性溶劑對照的前提下，判斷供試樣品是否具有抗菌活性，記錄結果。每次試驗重復3次。

采用TTC判定MIC的原理［12］，即TTC可被活菌細胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶等呼吸酶，還原成不溶性的紅色甲臜顆粒，使活菌呈現(xiàn)紅色，以鑒別菌體細胞活性。鑒于在常規(guī)操作下，中藥天然產(chǎn)物實際已不能完全正確地反映樣品的抑菌能力，本研究采用TTC對菌體染色，鑒別菌體細胞活性，以不能顯示的質(zhì)變范圍來判讀抑菌效果，保證實驗結果的準確性和可靠性。

2.4 微量棋盤稀釋法 采用微量棋盤稀釋法，測定大蒜素和鹽酸小檗堿兩藥聯(lián)合的抗菌效果。在96孔平底微量培養(yǎng)板上，以二維棋盤的縱向 （A～H）和橫向 （1～12）兩個方向，根據(jù)兩藥單用時對試驗菌株的MIC值（分別記為MICa和MICb），將兩藥分別以4×MIC～1/16×MIC的質(zhì)量濃度聯(lián)合應用。加入已制備的1.5×106CFU/mL的菌懸液10μL，至最終菌懸液為1.5×105CFU/mL。在37℃下，培養(yǎng)18～24 h。然后，每孔加入0.25% TTC 5μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用肉眼觀察培養(yǎng)孔，呈現(xiàn)紅色為有菌生長。每次試驗重復3次?？疾烀恳环N藥物聯(lián)用時的MIC（分別記為MICA和MICB），通過計算部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI），F(xiàn)ICI=MICA/MICa+ MICB/MICb，判斷兩藥體外藥效學相互作用：FICI≤0.5時，兩藥為協(xié)同作用；0.5＜FICI≤1時，兩藥為相加作用；1＜FICI≤2時，兩藥為無關作用；FICI＞2時，兩藥為拮抗作用［13-14］。

2.5 24 h時間—殺菌曲線法 采用時間—殺菌曲線試驗［15］，對大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、ESBLs及MRSA單獨應用時的殺菌效果及聯(lián)合應用時的殺菌作用效果進行考察。以各試驗菌株的MIC值的實驗結果為依據(jù)，將兩藥分別稀釋為1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC和2×MIC。加入已制備的1.5×108CFU/mL的菌懸液至最終菌懸液為1.5×105CFU/mL。在37℃下振蕩培養(yǎng)。然后，于0、1、2、4、8、12、24 h取10μL菌懸液按10倍倍比稀釋，取100μL稀釋液均勻涂布于MHA平板上。37℃培養(yǎng)18～24 h后進行菌落計數(shù)。以時間點為橫坐標，以不同時間點生長的菌落數(shù)的對數(shù)為縱坐標繪制時間殺菌曲線。每次試驗重復3次。

兩藥聯(lián)合時間—殺菌曲線，將兩藥分別稀釋為1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC和2×MIC，各取2.5 mL置于試管中，使最終藥物體積為5 mL。加入已制備的1.5×108CFU/m L的菌懸液至最終菌懸液為1.5×105CFU/mL。在37℃下振蕩培養(yǎng)。然后，于0、4、8、12、24 h取10μL菌懸液按10倍倍比稀釋，取100μL稀釋液均勻涂布于MHA平板上。37℃培養(yǎng)18～24 h后進行菌落計數(shù)。以時間點為橫坐標，以不同時間點生長的菌落數(shù)的對數(shù)為縱坐標繪制時間殺菌曲線。每次試驗重復3次。

根據(jù)文獻報道，通過比較兩藥聯(lián)用時在24 h的菌落數(shù)log10CFU/mL與單藥應用時抑菌活性最好的藥物在24 h的菌落數(shù)log10CFU/mL之差ΔLC24［16］：ΔLC24≥2，協(xié)同作用；1≦ΔLC24＜2，相加作用；-1≦ΔLC24＜1，無關作用；ΔLC24＜-1，抵抗作用。同時，用兩藥聯(lián)用時24 h的菌落數(shù)log10CFU/mL與0 h的菌落數(shù)log10CFU/mL之差≥3或者＜3判斷兩藥聯(lián)用為抑菌作用或者殺菌作用［17］。

3 結果

3.1 MIC值及微量棋盤稀釋法 實驗結果顯示，注射用硫酸鏈霉素和注射用青霉素鈉對大腸埃希菌（ATCC 25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）的MIC值為20 U/mL和2.5 U/m L，與文獻報道類似［18］。大蒜素對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC值分別為156.25、625、625μg/mL，鹽酸小檗堿的 MIC值分別為 156.25、78.125、156.25μg/m L（表1）。當兩藥聯(lián)用時其FICI值為0.75、1、0.75，顯示為相加作用。大蒜素對革蘭氏陰性菌大腸埃希菌 （ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、肺炎克雷伯菌的MIC值分別為156.25、312.5、156.25μg/mL，鹽酸小檗堿的MIC值分別為156.25、156.25、312.5μg/mL。當兩藥聯(lián)用，都為相加作用 （表2）。對產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌 （ESBLs）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），大蒜素聯(lián)合鹽酸小檗堿具有相加的抑菌作用 （表3）。

實驗結果顯示，當兩藥聯(lián)用時對所有試驗菌株表現(xiàn)出良好的相加抑菌效果。同時，由表1～3可知，硫酸鏈霉素對耐藥菌ESBLs的MIC值為質(zhì)控菌大腸埃希菌（ATCC 25922）的32倍，而在相同的條件下大蒜素為2倍，鹽酸小檗堿為1倍；青霉素鈉對耐藥菌MRSA的MIC值為質(zhì)控菌金黃色葡萄球菌 （ATCC 29213）的128倍，然而在相同的條件下大蒜素為2倍，鹽酸小檗堿為1倍。所以，大蒜素及鹽酸小檗堿比陽性藥物對耐藥菌的抑制作用強［19］。

表1 大蒜素及鹽酸小檗堿對革蘭氏陽性菌的抗菌作用Tab.1 An tibacterial effects of DATS and BBH against gram-positive bacterium

表2 大蒜素及鹽酸小檗堿對革蘭氏陰性菌的抗菌作用Tab.2 Antibacterial effects of DATS and BBH against gram-negative bacterium

表3 大蒜素及鹽酸小檗堿對耐藥菌的抗菌作用Tab.3 Antibacterial effects of DATS and BBH against drug-resistance bacterium

3.2 24 h時間—殺菌曲線 大蒜素對大腸埃希菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、ESBLs及MRSA的24 h時間—殺菌曲線隨著劑量的增加，呈現(xiàn)出劑量依賴特性 （圖1）。鹽酸小檗堿對4株菌株也顯示了相同的劑量依賴性 （圖2）。大蒜素和鹽酸小檗堿在細菌生長的24 h內(nèi)，對前4 h細菌生長有明顯的抑制作用，說明大蒜素和鹽酸小檗堿對對數(shù)生長期的細菌有抑制作用。但是，當大蒜素及鹽酸小檗堿單獨應用時，在4×MIC下對4株試驗菌株在培養(yǎng)至24 h時不能看出抑菌或者殺菌效果，這種抑菌趨勢與文獻報道類似［20］。

當兩藥聯(lián)用時，隨著兩藥質(zhì)量濃度的增加，出現(xiàn)殺菌效果：對大腸埃希菌 （ATCC 25922），1× MIC BBH+1×MIC DATS在8 h時引起細胞死亡達到殺菌效果；對金黃色葡萄球菌 （ATCC 29213），1×MIC BBH+1×MIC DATS在8 h時也引起細胞死亡達到殺菌效果；對ESBLs，1×MIC BBH+2× MIC DATS在12 h時也引起細胞死亡達到殺菌效果；對MRSA，2×MIC BBH+1×MIC DATS在12 h時也有相同的殺菌效果 （圖3）。此外，兩藥聯(lián)用在24 h點時，1/4×MIC BBH+1/2×MIC DATS對大腸埃希菌（ATCC 25922）相對于抑菌活性較強的單藥下降2.57 log10CFU/mL，為協(xié)同作用；1/4×MIC BBH+1/2×MIC DATS對金黃色葡萄球菌 （ATCC 29213）相對于抑菌活性較強的單藥下降2.06，為協(xié)同作用；1/2×MIC BBH+ 1/4×MIC DATS對ESBLs相對于較抑菌活性較強的單藥下降1.86，為相加作用；1/4×MIC BBH+ 1/2×MIC DATS對MRSA相對于抑菌活性較強的單藥下降1.08，為相加作用 （圖4）。

4 討論

綜上所述，由于抗生素的濫用等導致很多細菌耐藥，給人類健康造成了嚴重的威脅。細菌耐藥及耐藥菌所引起的一系列慢性疾病，成為了現(xiàn)代公共衛(wèi)生面臨的問題之一。尋找低毒有效的抗菌藥物是醫(yī)藥研究關注的焦點。目前，由于許多中草藥成分具有低毒且溫和的抗菌效果，同時還能夠逆轉耐藥菌的耐藥性，從中草藥中尋找抗菌藥物成為了熱點［21］。大蒜素及鹽酸小檗堿是從天然藥物中發(fā)現(xiàn)的兩種藥物，具有廣譜抗菌作用并且已用于臨床。

文獻報道［22］，鹽酸小檗堿對革蘭氏陽性菌及耐藥菌有良好的抑菌效果，本研究與其相符。同時結果顯示，大蒜素對革蘭氏陰性菌有良好的抑菌效果。此外，有報道顯示［23］，大蒜素對幽門螺旋桿菌被膜的殺菌作用是通過其揮發(fā)性和脂溶性，穿透細菌的細胞生物膜，從而破壞和摧毀其細胞［24］?？梢园l(fā)現(xiàn)大蒜素和鹽酸小檗堿這兩種化合物，一種

為脂溶性揮發(fā)性硫醚，一種為水溶性生物堿，在理化性質(zhì)上有互補的作用。此外，大蒜黃連丸這一古方在我國古代已成功應用，大蒜素和鹽酸小檗堿為其主要的成分，我們推測認為將兩藥聯(lián)合可能提高其抗菌活性，這是我們探索研究本課題的目的。

圖1 大蒜素對試驗菌株的時間—殺菌曲線 （，n=3）Fig.1 Time-k ill curves of DATS against tested strains（，n=3）

圖2 鹽酸小檗堿對試驗菌株的時間—殺菌曲線 （，n=3）Fig.2 Time-k ill curves of BBH against tested strains（，n=3）

圖3 大蒜素與鹽酸小檗堿聯(lián)合的時間—殺菌曲線 （，n=3）Fig.3 Time-kill curves of DATS and BBH in combination against tested strains（，n=3）

圖4 大蒜素與鹽酸小檗堿單獨及聯(lián)合的時間—殺菌曲線 （，n=3）Fig.4 Time-kill assay of the two drugs alone and in combination against tested strains（，n=3）

研究表明，單獨應用大蒜素及鹽酸小檗堿對試驗菌株具有抑菌活性，但即使達到4×MIC，在24 h培養(yǎng)下沒有顯示殺菌作用。然而兩藥聯(lián)用時，在24 h培養(yǎng)下以相對較低質(zhì)量濃度顯示出殺菌作用，且在亞MIC下具有弱協(xié)同或者相加的聯(lián)合作用。

本研究采用棋盤法及24 h殺菌曲線法評價兩藥聯(lián)用效應時，得出的結果基本一致，個別處略有不同。這是由于兩種評價方法在算法上不一致所致［25］。

總之，本研究顯示大蒜素和鹽酸小檗堿聯(lián)合應用時對供試的敏感菌株及耐藥菌株（ESBLs及MRSA）顯示出了較好的殺菌作用。此外，本研究還需要進行更多的臨床耐藥菌株抑菌試驗及其體內(nèi)藥效評價。

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In vitro antibacterial activity of allicin in combination w ith berberine hydrochloride

SUN Yan， LINa， LU Ying， YU Yuan-yuan， CHEN Jun*

（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212O13，China）

AIM To study the in vitro activity of allicin（dially trisulfide）in combination with berberine hydrochloride to common and drug-resistant bacteria.METHODS The broth dilution method was used to test individualminimal inhibitory concentrations（MIC）of four common，two control and two resistent bacteria.The checkerboard dilution and time-kill curve tests were performed on antibacterial synergy effects.RESULTS The MIC of allicin were in the ranges of 156.25（sensitive bacteria）and～1250μg/m L（drug-resistant bacteria）；the MIC of berberine hydrochloride were in the ranges of78.125（sensitive bacteria）and～312.5μg/mL（drugresistant bacteria）.The fractional inhibitory concentration index（FICI）of allicin plus berberine hydrochloride

allicin（diallyl trisulfide）；berberine hydrochloride；antibacterial effect；synergism

R966

A

1001-1528（2015）12-2589-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.004

2015-02-13

孫 艷 （1990—），女，碩士生，研究方向為天然產(chǎn)物活性成分篩選及應用。Tel：18261931810，E-mail：yansun901020@ 126.com

*通信作者：陳 鈞 （1947—），男，博士生導師，教授，研究方向為生物活性成分和新藥開發(fā)以及生物資源有效成分的分離與應用。Tel：13812461762，E-mail：shchen@ujs.edu.cn

ranged from 0.75 to 1.24 h time-kill curve assay showed no bactericidal activity against all test strains even with 4×MIC used alone.However，when used together under the same concentrations，they showed bactericidal activity with synergy and additional effects.CONCLUSIONS The experimental data reveal that the combination of allicin and berberine hydrochloride havemoderate antibacterial effect.