劉海燕，婁季宇，白宏英，曾志磊，閆瑩瑩，樂 婷

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科鄭州450014

缺血性腦血管病作為威脅人類健康的三大疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的特點(diǎn)，給社會和家庭帶來極大負(fù)擔(dān)。腦梗死后的血管新生能為組織細(xì)胞供血供氧，縮小梗死灶，減少神經(jīng)缺損，并能有效幫助神經(jīng)功能恢復(fù)［1］。然而，血管生成涉及多種血管生成因子、調(diào)節(jié)因子及相關(guān)的胞內(nèi)通路，是一個(gè)多重交叉、輻射狀聯(lián)系的過程。Slit/Robo 信號通路能排斥性導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞的遷移［2］，參與環(huán)路的形成，并能減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［3］。在血管形成過程中，Slit/Robo 通路可能通過導(dǎo)向血管內(nèi)皮頂端細(xì)胞的遷移而影響新生血管的分支和延伸。作者對缺血性卒中大鼠缺血腦組織中軸突導(dǎo)向因子Slit2 蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，同時(shí)檢測了微血管密度(microvessel density，MVD)和Robo1、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA 的表達(dá)，探討Slit2 在血管新生過程中的作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 成年健康雄性SD 大鼠48只，體重250～300 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號SCXK(豫)2010-0002?？筍lit2 兔多抗和抗Robo1 兔多抗購自Santa Cruz 公司?？笴D105 小鼠單抗購自Abcam 公司。RT-PCR 試劑盒購自Transgene 公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1．2 模型制備方法 采用改良Longa 等［4］方法建立永久性大腦中動(dòng)脈梗死(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)大鼠模型。大鼠稱重后用水合氯醛溶液腹腔注射完成麻醉，固定后沿頸部正中切口逐層鈍性分離至頸前肌肉，在頸總動(dòng)脈(CCA)搏動(dòng)最清晰處剝開頸動(dòng)脈鞘，分離出CCA，再依次分離出頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，夾閉ICA，再依次結(jié)扎ECA、CCA。在頸動(dòng)脈分叉處下方置一手術(shù)縫線并打活結(jié)。在CCA 結(jié)扎線和活結(jié)之間剪一斜形小口，沿ICA 插入線栓，直至輕插遇阻力且標(biāo)記處距分叉約2 mm 處，固定線栓至皮下后縫合。術(shù)后保暖至麻醉蘇醒。術(shù)后2 h 觀察大鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，并根據(jù)Longa 等［4］神經(jīng)功能評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。評分達(dá)1～3 分且排除其他因素的動(dòng)物納入研究，剔除評分為0 和4 分者，并采用相同造模方法予以補(bǔ)充。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型1、3、7天組，每組12只。假手術(shù)組不結(jié)扎不插線栓，余步驟同1．2。余3組按1．2 方法造模，并分別于術(shù)后第1、3、7天處死取材，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1．4 標(biāo)本采集和切片制作 ①新鮮腦組織標(biāo)本:將大鼠深度麻醉后，置于冰塊上，30 s 內(nèi)斷頭取腦，4℃冰生理鹽水沖洗后投液氮中迅速冷凍，并于－80℃冰箱中保存，用于Western blot 和RT-PCR。②石蠟包埋腦組織標(biāo)本:將大鼠深度麻醉后，經(jīng)心腔先后灌注生理鹽水和多聚甲醛，至大鼠四肢微顫，全身僵硬，取出大腦，稍加修整后投多聚甲醛液中固定，用于免疫組化染色。切片制作:大鼠腦組織經(jīng)常規(guī)固定、石蠟包埋后，于視交叉后2 mm 內(nèi)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm，每隔4 張取1 張切片，水洗漂片。

1．5 缺血腦組織中Slit2 蛋白的檢測 采用Western blot 法檢測缺血腦組織中Slit2 蛋白的表達(dá)水平。剪碎組織，加裂解液，勻漿后裂解30 min，4℃離心5 min，取上清。BCA 法檢測蛋白濃度。取80 μL 樣品和20 μL 5 ×SDS 上樣緩沖液混勻后加熱變性，灌膠上樣，每孔上樣量20 μL，進(jìn)行SDS-PAGE。轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用50 g/L 脫脂奶粉封閉30 min，加一抗4℃過夜，TBST 漂洗3次后加二抗，漂洗后成像掃描。以GAPDH 為內(nèi)參。用Bandscan 5．0 軟件進(jìn)行灰度分析，以目的條帶與GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1．6 MVD 的檢測 切片脫蠟水化后，PBS 沖洗(5 min ×3次)，抗原熱修復(fù)15 min，雙氧水孵育20 min，加抗CD105(一抗)4℃過夜，加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育20 min，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育20 min。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。用德國Leica 顯微照相系統(tǒng)采集圖像。鏡下觀察并參照Weidner 等［5］的方法進(jìn)行微血管計(jì)數(shù):在低倍視野下找到血管密度最高處，再在400 倍視野下，以呈棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇且與鄰近的微血管或其他結(jié)締組織分開者為一個(gè)微血管，在熱點(diǎn)處選取4個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，計(jì)算MVD(單位為個(gè)/視野)。

1．7 缺血腦組織中Robo1 和VEGF mRNA 的檢測 采用RT-PCR 法檢測缺血腦組織中Robo1 和VEGF mRNA 的表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參。登錄GenBank 獲得Robo1 和VEGF 序列，設(shè)計(jì)特異性引物。Robo1 上游引物序列為5'-GGAGGAGTTCAGT GAAGAA-3'，下游引物序列為 5'-TGGTG GCATCTAGGTTTTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度309 bp。VEGF 上游引物序列為5'-CGGATCAAACCTCAC CAA-3'，下游引物序列為 5'-TCTCCGCTCTGAA CAAGG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度201 bp。取約100 mg 腦組織，勻漿后加入Trizol 和氯仿提取總RNA，全程避免RNase 污染，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共約35個(gè)循環(huán);72℃總延伸6 min。產(chǎn)物經(jīng)20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的條帶與GAPDH 條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 處理數(shù)據(jù)。4組大鼠Slit2 蛋白、MVD、Robo1 和VEGF mRNA 表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t 檢驗(yàn);采用Pearson 相關(guān)分析對模型組大鼠Slit2 蛋白表達(dá)與VEGF、MVD 的相關(guān)性進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 4組大鼠缺血腦組織中Slit2 蛋白的表達(dá) 模型1、3、7天組Slit2 蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組升高，且呈逐漸升高趨勢。見圖1 及表1。

圖1 4組大鼠缺血腦組織中Slit2 蛋白的表達(dá)

2．2 4組大鼠缺血腦組織中MVD 的比較 模型1、3、7天組大鼠MVD 明顯高于假手術(shù)組，且呈逐漸升高趨勢。見表1。

2．3 4組大鼠缺血腦組織中Robo1 和VEGF mRNA 表達(dá)水平的比較 見圖2、3 和表1。與假手術(shù)組比較，模型1天組Robo1 mRNA 急劇降低，模型3、7天組有所回升，但模型7天組仍低于假手術(shù)組。模型組VEGF mRNA 的表達(dá)均高于假手術(shù)組，且逐漸升高。

2．4 模型組大鼠Slit2 蛋白和血管新生的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，模型組大鼠Slit2蛋白表達(dá)與VEGF mRNA 表達(dá)水平及MVD 呈顯著正相關(guān)(r=0．974，0．926，P＜0．001)。

圖2 4組大鼠缺血腦組織中Robo1 mRNA 的表達(dá)

圖3 4組大鼠大鼠缺血腦組織中VEGF mRNA 的表達(dá)

表1 4組大鼠缺血腦組織中各項(xiàng)指標(biāo)的比較

3 討論

Slit2 蛋白是大腦中線細(xì)胞分泌的一類可擴(kuò)散性的大分子信號蛋白，具有排斥性導(dǎo)向神經(jīng)生長錐、誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、促進(jìn)軸突生長和突觸重塑的作用。Slit2 作為智障相關(guān)因子，在中樞神經(jīng)生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，且在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，通過結(jié)合受體Robo1，激活下游信號分子，促進(jìn)軸突再生［1-3］。Tanno 等［6］發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)橫斷術(shù)后，Slit2 mRNA表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)了損傷外周神經(jīng)的修復(fù)。

與調(diào)控軸突再生類似，在調(diào)控血管生長方面，Slit/Robo 通路相關(guān)因子濃度的變化可刺激血管內(nèi)皮頂端細(xì)胞，引起胞內(nèi)骨架蛋白的變化，最終導(dǎo)致血管的延伸和分支。Wang 等［7］報(bào)道Slit2 能濃度依賴性地促進(jìn)腫瘤血管的新生，從而為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供血氧供應(yīng)。Wang 等［8］研究也發(fā)現(xiàn)Slit2 高表達(dá)于口腔癌和頰囊癌腫瘤黏膜，且與腫瘤生長和MVD 相關(guān)，抗體R5 可以阻斷Slit2 的這種作用。Huang 等［9］發(fā)現(xiàn)敲除小鼠視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞Robo1 和Robo4 基因后，血管的形成和成管過程被干擾。上述研究結(jié)果均提示Slit/Robo 通路在血管新生過程中發(fā)揮重要作用。Han 等［10］成功構(gòu)建了Slit2 轉(zhuǎn)基因小鼠，而該小鼠大腦血管密度和滲透性均顯著增加，提示干預(yù)Slit/Robo 通路有可能改善大腦循環(huán)狀態(tài)。

該研究結(jié)果顯示，大鼠腦梗死發(fā)生后，腦組織中Slit2 蛋白表達(dá)持續(xù)升高;Robo1 mRNA 表達(dá)先急劇降低，后逐漸升高，但在7 d 后仍低于正常水平;VEGF mRNA 表達(dá)和MVD 均逐漸升高;研究還發(fā)現(xiàn)Slit2 蛋白的表達(dá)與VEGF mRNA 表達(dá)水平和MVD顯著正相關(guān);提示Slit2 很可能協(xié)同VEGF 在血管新生的過程中發(fā)揮重要作用，或Slit2 蛋白通過升高VEGF mRNA 的表達(dá)來介導(dǎo)促血管新生作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。Robo1 mRNA 表達(dá)水平在梗死后早期急劇下降，考慮這與細(xì)胞受損應(yīng)激和Robo1 介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞趨化黏附有關(guān)［11］，而隨著缺血大腦炎癥反應(yīng)的緩和，同時(shí)受逐漸升高的Slit2 蛋白的刺激，Robo1 mRNA 表達(dá)逐漸升高，通過增加跨膜受體Robo1 來發(fā)揮Slit2 介導(dǎo)的促血管新生作用。

綜上所述，Slit2/Robo 通路在大鼠局灶性腦梗死后血管新生中發(fā)揮了重要作用，如何通過及時(shí)增強(qiáng)或削減Slit/Robo 信號改善缺血病灶的微循環(huán)，還需要深入探討。

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