周向軍

（天水師范學院 生物工程與技術學院，甘肅 天水 741001）

Henderson-Hasselbalch方程在氨基酸鹽兩性解離教學中的應用

周向軍

（天水師范學院 生物工程與技術學院，甘肅 天水 741001）

分別以亮氨酸鹽、組氨酸、谷氨酸及組氨酸鹽酸鹽的兩性解離為例，利用Henderson-Hasselbalch方程對其不同離子形式的溶液pH、不同離子形式的濃度或相對比例及緩沖溶液的配置進行分析，為進一步理解氨基酸鹽的解離過程及相關計算提供參考.

Henderson-Hasselbalch;氨基酸鹽;兩性解離

氨基酸的兩性解離不僅是理解蛋白質眾多理化性質和功能的基礎，同時也是氨基酸分離和分析的基礎，而氨基酸分離、分析則是氨基酸序列測定的必要步驟，[1]因此，正確理解氨基酸及其鹽的兩性解離，對于掌握蛋白質分離和分析、序列測定、結構和功能等具有一定的基礎性作用.由于現(xiàn)有生物化學[1]和有機化學[2]教材對此部分內容的介紹較為模糊，學生對Henderson-Hasselbalch(HH)方程在不同氨基酸鹽離子形式的溶液pH、濃度或相對比例及緩沖溶液的配置中的應用存在較大困難，因此，有必要對HH方程在氨基酸鹽兩性解離中的應用做進一步分析.

HH方程是化學中有關酸堿平衡的一個方程，該方程廣泛應用于化學、醫(yī)學和藥學等方面，如緩沖液pH計算、弱電解質的各種離子的離子化程度、臨床血液氣體分析、輸液藥物溶解度與pH的關系及藥物在機體內的吸收分布關系等生物藥劑學領域.[3-4]李雋群[5]利用HH方程分析氨基酸、肽、蛋白質在溶液中帶電狀態(tài)，進一步解釋其兩性解離的原理；同時該作者認為正確理解氨基酸等兩性物質帶電狀態(tài)，對相應的電泳圖譜分析、離子交換層析或電泳分離分析均具有一定的指導作用.作者以亮氨酸鹽、組氨酸、谷氨酸及組氨酸鹽酸鹽的兩性解離為例，利用HH方程對不同氨基酸鹽離子形式的溶液pH、濃度或相對比例及緩沖溶液的配置進行分析，希望能解決生物化學教學中存在的相關問題，為學生掌握不同氨基酸鹽離子形式的溶液pH、濃度或相對比例及緩沖溶液的配置中的應用提供幫助.

1　利用HH方程分析0.3mol/L亮氨酸鹽酸鹽溶液、亮氨酸鈉鹽及等電點亮氨酸溶液pH[1]

α-COOH的pK1=2.36，α-NH2的pK2=9.60.

Leu解離簡式為：

1.1亮氨酸鹽酸鹽溶液pH

亮氨酸鹽酸鹽為二元酸，此時-COOH的酸性遠強于質子化-N+H3，故溶液的pH幾乎完全取決于-COOH的解離程度，[H+]=[Leu0]，[Leu+]=0.3-[H+].

根據(jù)解離平衡方程，

[H+]≈3.39×10-2mol/L，pH=1.47.同時也可知，亮氨酸鹽酸鹽在0.3mol/L溶液中解離11.3%.該過程也可簡化為：即當以亮氨酸鹽酸鹽存在時，[Leu+]?[Leu0]，可認為[Leu+]=0.3mol/L，代入上式，得pH≈(pK1+lg0.3)/ 2=1.44.

1.2亮氨酸鈉鹽pH

亮氨酸鈉鹽為二元堿，此時-NH2的堿性遠強于-COO-，故溶液的pH幾乎完全取決于-NH2的解離程度，[OH-]=[Leu0]，[Leu-]=0.3-[OH-].

根據(jù)解離平衡方程,

p[OH-]≈2.46，pH=14-2.46=11.54.可知亮氨酸鈉鹽在0.3mol/L溶液中解離1.16%.該過程也可簡化為：即當以亮氨酸鈉鹽存在時，[Leu-]?[Leu0]，可認為[Leu-]= 0.3mol/L，代入上式，得p[OH-]≈-lg(0.3×10-14/10-9.60)/ 2≈2.46，pH=14-2.46=11.54.兩種方法計算結果相同，這表明當以亮氨酸鈉鹽存在時，-COO-的堿性幾乎可以完全忽略.

1.3等電點亮氨酸溶液pH

氨基酸的pI是指其解離生成的陽離子和陰離子程度相等時的溶液pH，也即兩性離子達到最大值時的溶液pH，與濃度無關；而氨基酸水溶液的pH是指氨基酸在水溶液中解離生成的H+的負對數(shù)，與濃度有關.[7]利用下列公式[8]計算，[Leu0]水溶液的pH約為5.98.

2　利用HH方程分析0.25mol/L pH6.4組氨溶液各種離子形式濃度[1]

在pH6.4時，可認為α-COOH完全未被質子化，同時攜帶一個單位負電荷，α-NH2被完全質子化且攜帶一個單位正電荷.因此，His的離子形式主要由咪唑基提供.當咪唑基被質子化時，His攜帶一個單位凈正電荷，當其不被質子化時，His凈電荷為零. α-COOH的pK1=1.82，咪唑基的pK2=6.0，α-N+H3的pK3=9.17，His解離簡式為：

根據(jù)HH方程，可得出：

根據(jù)(1)、(2)、(3)和(4)，求得His0=0.179mol/L，His+=0.071mol/L，His2+=1.87×10-6mol/L，His-=3.04× 10-4mol/L.同時可知，在pH6.4時，His不同離子形式的比例為His0=71.6%，His+=28.4%，His2+=0.00075%，His-=0.122%.

3　利用HH方程分析0.1mol/L Glu在等電點時的主要離子濃度

α-COOH的 pK1=2.19，α-NH2的 pK2=9.67,γ-COOH的pK3=4.25，pI=3.22.Glu解離簡式為：

根據(jù)HH方程，可得出：

根據(jù)(5)、(6)、(7)和(8)，求得Glu+=0.00786mol/L，Glu00.08427mol/L，Glu-=0.00786mol/L，Glu2-=2.79× 10-9mol/L.在Glu等電點時，不同離子形式的比例為Glu+=7.86%，Glu0=84.27%，Glu-=7.86%，Glu2-=0.01%.

4　利用HH方程分析用含一個結晶水的固體組氨酸鹽酸鹽(相對分子質量209.6；咪唑基pKa=6.0)和1mol/LKOH配制1LpH6.5mol/L組氨酸鹽緩沖液[1]

His解離簡式為：

配制1L pH6.5的濃度為0.2mol/L的組氨酸鹽緩沖液，需要固體組氨酸鹽酸鹽的量為：209.6×0.2= 41.92g.加入KOH中和的H+主要來自His羧基的全部解離和咪唑基的部分解離.pH6.5時-COOH全部解離，故中和組氨酸鹽酸鹽的-COOH所釋放的H+所需KOH的量等于His的物質的量，為0.2mol，即需1mol/ L的KOH溶液200mL；pH6.5時，咪唑基部分解離，其釋放H+等于生成的His0的物質的量，所需KOH的物質的量可用HH方程計算：

5　總　結

1.3中等電點亮氨酸溶液pH的計算方法可行，與趙堂[9]的計算結果相吻合，即當[Leu0]=0.3＞101.70× K1=10-0.66時，中性氨基酸水溶液pH=pI.趙堂[9]經(jīng)過推導認為，中性氨基酸水溶液pH=pI所需滿足的條件：兩性離子的濃度大于101.70×K1.對于某一種給定的氨基酸，K1為定值，因此，濃度成為決定因素，即同等條件下有較大濃度或較高溶解度的氨基酸，其溶液的pH才有可能等于pI，否則其溶液的pH略大于pI.3的計算結果表明酸性氨基酸處于等電點時主要以兩性離子為主，其兩側的離子濃度含量較低且相等，Glu2-含量可忽略不計.該結論同樣適用于中性氨基酸和堿性氨基酸的相應分析，這對于進一步從具體事例角度理解酸性氨基酸和堿性氨基酸的pI只選擇兩性離子兩側的pKa具有一定意義.

以亮氨酸鹽、組氨酸、谷氨酸及組氨酸鹽為例，利用HH方程分別對其不同離子形式的溶液pH、不同離子形式的濃度或相對比例及緩沖溶液的配置進行分析.一般可按如下方法進行：首先查表獲得各解離基團pK，然后根據(jù)可解離基團pK的大小，按照pK1＜pK2＜pK3正確書寫氨基酸兩性解離簡式，即那個基團的pK越小，那個基團先解離.最后根據(jù)HH方程寫出關系式并分析計算.

[1]王鏡巖,朱圣庚,徐長法.生物化學[M].3版.北京：高等教育出版社,2002.

[2]汪小蘭.有機化學[M].4版.北京：高等教育出版社,2004.

[3]楊左海.Henderson-Hasselbalch方程及其應用[J].大學化學,1997,12(1)：56-59.

[4]曾令澤,高鴻慈,丁禎錄.HH方程在生物藥劑學中的應用[J].中國藥學雜志,1985,20(5)：287-290.

[5]李雋群.氨基酸、肽、蛋白質在溶液中帶電狀況分析[J].黔西南民族師范高等專科學校學報,2003,(1)：72-77.

[6]南京大學《無機及分析化學》編寫組.無機及分析化學[M]. 4版.南京：高等教育出版社,2004,344.

[7]張曙光,肖玉梅,趙士鐸.氨基酸等電點與氨基酸水溶液pH的區(qū)別[J].大學化學,2005,20(5)：47-51.

[8]彭崇慧,馮建章,張錫瑜,等.定量化學分析簡明教程[M].2版.北京：北京大學出版社,1997.

[9]趙堂,韓曉霞.中性氨基酸水溶液pH值等于其pI的濃度條件及原因[J].固原師專學報(自然科學版),1998,19(3)：37-39.

〔責任編輯 高忠社〕

The Application of Henderson-Hassebalch Equation in the Teaching of Amino Acid Salt Amphoteric Dissociation

Zhou Xiangjun
(School of Bioengineering and Technology,Tianshui Normal University,Tianshui Gansu741001,China)

Taking examples of amphoteric dissociation of leucine salt,histidine salt,glutamic acid salt,the paper analyses the ph,concentration,and relative proportion of solution of different types of icon forms,and the allocation of buffered solution with Henderson-Hasselbalch equation,providing references for further understanding of the amino acid salt sissociation process and the relevant calculation.

Henderson-Hasselbalch;amino acid salt;amphoteric dissociation

O6-041

A

1671-1351（2015）05-0118-03

2015-06-11

周向軍（1980-），男，甘肅鎮(zhèn)原人，天水師范學院生物工程與技術學院講師，碩士。