趙 巖，肖宇龍，左 媛，王喜良，霍洪軍，江建明，閆慧博

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院脊柱外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510630）

目前，脊髓損傷是神經(jīng)損傷領(lǐng)域的常見(jiàn)疾病，但各國(guó)醫(yī)學(xué)界對(duì)其治療仍無(wú)重大突破。近年來(lái)研究［1］結(jié)果顯示：與其他干細(xì)胞比較，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）具有顯著優(yōu)勢(shì)，NSCs有較高的自我更新和增殖潛能，具備早期胚胎細(xì)胞特性，能夠分化為神經(jīng)系統(tǒng)的各類(lèi)細(xì)胞，其被認(rèn)為是一種治療脊髓損傷的理想干細(xì)胞。目前，研究［2］結(jié)果顯示：促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種新型的組織保護(hù)因子，具有神經(jīng)保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用。但針對(duì)NSCs移植聯(lián)合EPO是否可有效地促進(jìn)脊髓損傷大鼠功能的恢復(fù)尚鮮有研究。因此，本研究將NSCs和EPO聯(lián)合用于治療大鼠脊髓損傷，探討聯(lián)合應(yīng)用治療脊髓損傷的效果是否優(yōu)于單純NSCs移植，為臨床治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 健康成年雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（220±20）g，孕14d的Wistar大鼠2只，均由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蒙）2002－0001。DMEM－F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和B27補(bǔ)充液（美國(guó)Gibco公司），EPO（沈陽(yáng)三生制藥公司），SABC免疫組織化學(xué)試劑盒、Nestin抗體和抗神經(jīng)絲 NF－200抗體（武漢博士德公司）。FITC、胰蛋白酶和25cm2培養(yǎng)瓶（美國(guó)Corning公司），外科手術(shù)器械和纖維器械1套。

1.2 NSCs原代培養(yǎng)和鑒定 實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn) ［3］，將孕鼠斷頭處死，迅速在無(wú)菌條件下剖腹取出胎鼠，剪開(kāi)顱骨取腦組織，在解剖顯微鏡下分離中腦、海馬和側(cè)腦室下區(qū)組織。將分離的胎鼠腦組織用D－Hank’s液浸洗，用眼科剪將胎鼠腦組織剪成1mm×1mm×1mm的小組織塊，用等體積0.125%胰酶37℃消化10～15min，反復(fù)機(jī)械吹打，然后加入雙倍體積、含10%FBS的DMEM／F12終止消化。經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，800r·min－1離心10min，棄去上清液。加入完全培 養(yǎng) 液 ［DMEM／F12 加 20mol· L－1B27，10μg·L－1堿 性 成 纖 維 生 長(zhǎng) 因 子（bFGF），20μg·L－1表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）］。吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液后，以活細(xì)胞濃度為1×108L－1接種于培養(yǎng)瓶中［3］。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，每隔2～3d離心、半量換液1次，將傳至3～4代的NSCs制作成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×109L－1［4－6］，行 Nestin抗原免疫組織化學(xué)和免疫熒光鑒定。

1.3 大鼠脊髓全橫斷模型的建立［7］用3.5%戊巴比妥（1.3mL·100g－1）腹腔內(nèi)注射麻醉，在無(wú)菌條件下以T8棘突為標(biāo)志暴露脊髓T10節(jié)段［8－10］，用鈍頭的鉤針完整地挑起脊髓，尖刀片于大鼠T10節(jié)段處連同硬脊膜和脊髓組織一起切斷，并切除1mm脊髓節(jié)段，彎頭顯微鑷輕抬起橫斷脊髓兩斷端以明確脊髓組織完全橫斷，明膠海綿填塞脊髓損傷處。

1.4 動(dòng)物分組和給藥 40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。對(duì)照組：造模后大鼠在明膠海綿中給予DMEM／F12培養(yǎng)液10μL，并腹腔注射等量生理鹽水；NSCs組：大鼠造模成功后，將制備好的NSCs懸液用臺(tái)式離心機(jī)離心5min（1000r·min－1），再用 DMEM 調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109L－1，在損傷局部明膠海綿中注入NSCs懸液10μL，在損傷處上下各1mm范圍內(nèi)用微量注射器于0.25、0.50和0.75mm深度各注入 NSCs懸液共3μL，每個(gè)注射點(diǎn)0.5μL；EPO組：大鼠腹腔注射EPO 5000IU·kg－1，每天1次，連續(xù)注射7d，造模后在明膠海綿中給予DMEM／F12培養(yǎng)液10μL；NSCs＋EPO組：移植NSCs并聯(lián)合腹腔注射EPO，5000IU·kg－1，每天1次，連續(xù)注射7d。

1.5 免疫組織化學(xué)染色和FITC－NF－200免疫熒光染色觀察大鼠NSCs和脊髓組織形態(tài)學(xué) 術(shù)后大鼠存活8周，8周后應(yīng)用4%多聚甲醛磷酸鹽溶液經(jīng)心臟灌注固定，取脊髓損傷處及上下各1cm脊髓組織置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%蔗糖溶液中4℃過(guò)夜。部分脊髓組織常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋，切片行抗神經(jīng)纖維絲蛋白抗體NF－200免疫組織化學(xué)染色；部分脊髓組織行縱向連續(xù)冰凍切片，片厚為30μm，隔3張取1張，NF－200為一抗，行FITC熒光標(biāo)記的NF－200神經(jīng)纖維絲蛋白染色。

1.6 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分的檢測(cè) 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)性脊 髓 損 傷 運(yùn) 動(dòng) 功 能（Basso－Beattie－Bresnahan）BBB評(píng)分法［11］對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)時(shí)間為術(shù)前12h和術(shù)后3、7、14、28、42和56d。所有數(shù)據(jù)均由2名非本研究組但熟悉本評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的人員進(jìn)行隨機(jī)雙盲評(píng)分，取平均值作為最終得分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 體外培養(yǎng)的NSCs形態(tài)學(xué) 從胎鼠中腦、海馬和側(cè)腦室下區(qū)組織分離的單個(gè)細(xì)胞近似圓形、大小相近，培養(yǎng)2～3d后大多數(shù)細(xì)胞死亡，只有少數(shù)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，鏡下可見(jiàn)明顯細(xì)胞核分裂象，分裂象的細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán)。細(xì)胞培養(yǎng)4～5d后，可見(jiàn)數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)由細(xì)胞組成呈懸浮狀的球狀細(xì)胞團(tuán)，這些細(xì)胞團(tuán)體積很小，折光性強(qiáng)，突起不明顯，邊界清楚，大多呈褐色，邊緣見(jiàn)較小毛刺，稱(chēng)為 “神經(jīng)干細(xì)胞球”，中心部分顏色較深，但邊緣顏色較淺（圖1A，見(jiàn)插頁(yè)五）。將傳代后的神經(jīng)干細(xì)胞球制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)2～3d培養(yǎng)，可見(jiàn)這些單個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，并重新形成小的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)5～6d培養(yǎng)，培養(yǎng)液中出現(xiàn)散在的、大小不等的神經(jīng)干細(xì)胞球，7d時(shí)形成大的神經(jīng)干細(xì)胞球，其邊界清楚、折光性強(qiáng)。NSCs標(biāo)記性蛋白Nestin在原代和傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球中均有表達(dá)，并呈現(xiàn)綠色熒光（圖1B，見(jiàn)插頁(yè)五）。

2.2 大鼠損傷脊髓組織的形態(tài)學(xué) 術(shù)后8周，肉眼見(jiàn)損傷處脊髓組織因瘢痕組織增生而顏色變深，損傷處脊髓組織輕度萎縮（圖2，見(jiàn)插頁(yè)五）。橫斷處脊髓組織縱向切片NF－200染色顯示：對(duì)照組大鼠橫斷處脊髓組織殘端萎縮，橫斷區(qū)均為透明、不著色的瘢痕組織所代替，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)間可見(jiàn)大量空洞形成（圖3A，見(jiàn)插頁(yè)六）；NSCs＋EPO組大鼠橫斷處脊髓組織殘端輕度萎縮，橫斷區(qū)可見(jiàn)大量呈雜亂、無(wú)序生長(zhǎng)的神經(jīng)纖維，并可見(jiàn)有連續(xù)性神經(jīng)纖維通過(guò)脊髓橫斷區(qū)，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)間可見(jiàn)少量空洞形成（圖3B，見(jiàn)插頁(yè)六）。對(duì)照組和EPO組大鼠未見(jiàn)有明顯的神經(jīng)纖維再生；NSCs組大鼠可見(jiàn)少量的神經(jīng)纖維再生，未通過(guò)損傷區(qū)到達(dá)尾側(cè)；NSCs＋EPO組大鼠中，F(xiàn)ITC共軛抗神經(jīng)絲蛋白抗體NF－200標(biāo)記的再生神經(jīng)纖維在橫斷區(qū)頭側(cè)大量再生，呈無(wú)序狀生長(zhǎng)，并通過(guò)損傷區(qū)到達(dá)尾側(cè)（圖4，見(jiàn)插頁(yè)六）。

2.3 各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分 正常大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分為21分。在本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后3d內(nèi)4組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的BBB評(píng)分均為0分。而后隨著時(shí)間的推移，4組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分均有不同程度升高，提示大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。尤以NSCs＋EPO組大鼠更為顯著，并呈一定規(guī)律，脊髓橫斷損傷后各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能喪失，1周后開(kāi)始恢復(fù)，其中2～5周恢復(fù)較快，6～8周后恢復(fù)明顯減慢。術(shù)后1～4周，NSCs組和EPO組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），4周后NSCs組與EPO組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NSCs＋EPO組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分高于其他各組（P＜0.05）。術(shù)后8周末，NSCs＋EPO組大鼠前、后肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、有規(guī)律，后肢腳掌可負(fù)重，但仍無(wú)法使軀體抬離地面；NSCs組大鼠前、后肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能欠佳，只有少數(shù)大鼠后肢腳掌可負(fù)重，其余大鼠后肢腳趾呈彎曲狀，負(fù)重功能欠佳；對(duì)照組和EPO組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)均為不協(xié)調(diào)、無(wú)規(guī)律的滑動(dòng)。各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分Tab.1 BBB scores of motor function of hind limbs of rats in various groups （n＝10，）

表1 各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分Tab.1 BBB scores of motor function of hind limbs of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs NSCs group；#P＜0.05 vs EPO group.

7 14 28 42 56 Control 0.00±0.00 3.16±0.36 6.78±0.40 7.76±Group BBB score（t／d）0.46 7.90±0.45 NSCs 0.96±0.31＊# 4.79±0.46＊# 8.70±0.57＊# 9.89±0.82＊# 10.90±0.61＊#EPO 0.00±0.00 3.36±0.32 7.49±0.44 7.80±0.48 8.16±0.51 NSCs＋EPO 1.51±0.46＊△# 6.32±0.58＊△# 10.87±0.63＊# 11.70±0.72＊△# 12.61±0.64＊△#

3 討 論

脊髓損傷后很難再生修復(fù)，其主要原因包括損傷局部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺乏和大量抑制性因子的分泌導(dǎo)致軸突再生的微環(huán)境遭到破壞；脊髓損傷后脊髓再生能力不足；損傷局部有膠質(zhì)瘢痕形成。如能解決上述問(wèn)題則有望解決脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)和功能恢復(fù)的難題。自Reynolds等［12］首次在成年小鼠腦紋狀體中分離出可在體外分裂增殖、具有分化潛能的細(xì)胞群，并正式提出了 “NSCs”的概念以來(lái)，人們對(duì)其研究一直沒(méi)有中斷，并發(fā)現(xiàn)其有以下幾方面的基本特性［13－14］：可自我更新，從而維持穩(wěn)定的細(xì)胞儲(chǔ)備；具有多向分化潛能，可分化為神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞。鑒于其上述獨(dú)特的生物學(xué)特性，因此被認(rèn)為是一種理想的移植種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)從胎鼠腦組織中提取NSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察到其具有很好的克隆能力，并可穩(wěn)定傳代。但NSCs在體內(nèi)自然分化為神經(jīng)元的比例僅占1%，分化為膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞卻分別占31.2%和50.3%［15］，這嚴(yán)重影響NSCs移植后對(duì)脊髓損傷的修復(fù)效果。Watt等［16］和Hermanson等［17］采用各種神經(jīng)生長(zhǎng)因子或藥物對(duì)NSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)，但分化為神經(jīng)元的比例報(bào)道不一。近年來(lái)隨著人們對(duì)EPO研究的深入，證實(shí)其是一種新型的組織保護(hù)因子，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用。研究［18］結(jié)果顯示：在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中，EPO能夠增強(qiáng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和髓鞘的再生，促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。袁麗麗等［19］觀察EPO對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠NSCs凋亡和分化的影響結(jié)果顯示：EPO可降低體外培養(yǎng)的大鼠NSCs的凋亡率，促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化。盡管近些年的研究［20－22］顯示：EPO具有神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的作用，但很少有人將NSCs和EPO聯(lián)合用于治療大鼠脊髓損傷。

本研究將NSCs和EPO共同作用于橫斷性脊髓損傷大鼠，利用EPO對(duì)NSCs的增殖及分化的影響，以期有效促進(jìn)脊髓損傷大鼠脊髓功能的恢復(fù)，從而為臨床治療脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。本研究結(jié)果顯示：脊髓損傷大鼠如術(shù)后未給予任何的干預(yù)措施，自然恢復(fù)后其后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分一般均在10分以下，大多集中在8分左右；術(shù)后8周，NSCs＋EPO組大鼠后肢功能恢復(fù)明顯優(yōu)于其他各組，對(duì)照組和EPO組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NSCs＋EPO組大鼠后肢功能恢復(fù)更為顯著，NSCs＋EPO組大鼠在術(shù)后28d時(shí)后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分達(dá)即可到10分以上，證明其對(duì)脊髓功能的恢復(fù)作用顯著。

目前判定損傷脊髓是否再生修復(fù)的標(biāo)志是檢測(cè)是否有神經(jīng)軸突的再生，NF－200是構(gòu)成神經(jīng)細(xì)胞體和神經(jīng)軸突的框架，脊髓損傷后隨著神經(jīng)軸突的變性壞死，構(gòu)成神經(jīng)軸突框架的NF－200也隨之崩潰減少，甚至消失為空洞或?yàn)轳：劢M織所替代。本研究中術(shù)后8周NF－200免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠橫斷處脊髓組織殘端萎縮，橫斷區(qū)均為透明、不著色的瘢痕組織，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)間可見(jiàn)大量空洞形成；NSCs＋EPO組大鼠橫斷處脊髓組織殘端輕度萎縮，橫斷區(qū)可見(jiàn)大量呈雜亂、無(wú)序生長(zhǎng)的神經(jīng)纖維，并有連續(xù)性神經(jīng)纖維通過(guò)脊髓橫斷區(qū)，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)間可見(jiàn)少量空洞形成；NSCs＋EPO組大鼠FITC共軛抗神經(jīng)絲蛋白抗體NF－200標(biāo)記的再生神經(jīng)纖維在橫斷區(qū)頭側(cè)大量再生，呈無(wú)序狀生長(zhǎng)，并通過(guò)損傷區(qū)到達(dá)尾側(cè)；對(duì)照組大鼠未見(jiàn)有明顯的神經(jīng)纖維再生；NSCs組大鼠可見(jiàn)少量神經(jīng)纖維再生，未通過(guò)損傷區(qū)到達(dá)尾側(cè)。本研究結(jié)果表明：無(wú)論是單純NSCs移植治療脊髓損傷還是NSCs聯(lián)合EPO治療脊髓損傷，二者均可以促進(jìn)大鼠脊髓橫斷損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，但NSCs聯(lián)合EPO治療脊髓損傷的修復(fù)作用更加顯著。

本研究結(jié)果表明：NSCs移植聯(lián)合腹腔注射EPO較單純NSCs移植能更有效地促進(jìn)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，該方法是探索脊髓損傷治療策略的一種有意義的、積極的嘗試，同時(shí)也為臨床治療脊髓損傷提供了非常重要的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

［1］Andres RH，Horie N，Slikker W，et al.Human neural stem cells enhance structural plasticity and axonal transport in the ischaemic brain ［J］.Brain，2011，134（6）：1777－1789.

［2］Sanchis－Gomar F，Perez－Quilis C，Lippi G，et al.Erythropoietin receptor（EPOR）agonism is used to treat a wide range of disease ［J］.Mol Med，2013，19（1）：62－64.

［3］徐富翠，鄒禮樂(lè)，梅欣明，等.神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及其影響因素 ［J］.中國(guó)組織工程研究，2013，17（10）：1835－1840.

［4］張殿君，劉 一，付長(zhǎng)峰，等.新生大鼠脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及分化鑒定 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，35（2）：230－233.

［5］Salazar DL，Uchida N，Hamers FP，et al.Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in an early chronic spinal cord injury NOD－scid mouse model ［J］.PLoS One，2010，5（8）：1－15.

［6］張向榮，郭光華，劉德伍，等.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及BrdU標(biāo)記鑒定 ［J］.中國(guó)組織工程研究和臨床康復(fù)，2009，13（19）：3618－3622.

［7］孟步亮，巴迎春，宋士娜，等.脊髓全橫斷大鼠模型的構(gòu)建 ［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（7）：1215－1218.

［8］Zhang SX，Huang F，Gates M，et al.Extensive scarring induced by chronic intrathecal tubing augmented cord tissue damage and worsened functional recovery after rat spinal cord injury ［J］.J Neurosci Methods，2010，191（2）：201－207.

［9］Ozsoy O，Ozsoy U，Stein G，et al.Functional deficits and morphological changes in the neurogenic bladder match the severity of spinal cord compression ［J］.Restor Neurol Neurosci，2012，30（5）：363－381.

［10］Talac R，F(xiàn)riedman JA，Moore MJ，et al.Animal spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatmentstrategies［J］.Biomaterials，2004，25（9）：1505－1510.

［11］Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight－drop device versus transaction［J］.Exp Neurol，1996，139（2）：244－256.

［12］Reynolds BA，Tetzlaff W，Weiss S.A multipotent EGF－responsive striatal embryomic progenitor cell produces neurons and astrocytes ［J］.J Neurosci，1992，12（11）：4564－4574.

［13］Nakamura M，Toyama Y，Okano H.Transplantation of neural stem cells for spinal cord injury ［J］.Rinsho Shinkeigaku，2005，45（11）：874－876.

［14］Nandoe Tewarie RS，Hurtado A，Bartels RH，et al.Stem cell－based therapies for spinal cord injury ［J］.J Spinal Cord Med，2009，32（2）：105－114.

［15］Parr AM，Kulbatski I，Tator CH.Transplantation of adult rat spinal cord stem／progenitor cells for spinal cord injury ［J］.Neurotrauma，2007，24（5）：835－845.

［16］Watt FM，Hogan BL.Out of Eden：stem cells and their niches［J］.Science，2000，287（5457）：1427－1430.

［17］Hermanson O，Jepsen K，Rosenfeld MG.N－CoR controls differentiation of neural stem cells into astrocytes ［J］.Nature，2002，419（6910）：934－939.

［18］Kang SY，Kang JH，Choi JC，et al.Expression of erythropoietin in the spinal cord of Lewis rats with experimental autoimmune encephalomyelitis ［J］.J Clin Neurol，2009，5（1）：39－45.

［19］袁麗麗，杜紅梅，管英俊，等.促紅細(xì)胞生成素體外培養(yǎng)鼠胚腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化 ［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（49）：9174－9177.

［20］Subiros N，Del Barco DG，Coro－Antich RM.Erythropoietin：still on the neuroprotection road ［J］.Ther Adv Neurol Disord，2012，5（3）：161－173.

［21］Hong Z，Hong H，Chen H，et al.Investigation of the protective effect of erythropoietin on spinal cord injury in rats［J］.Exp Ther Med，2011，2（5）：837－841.

［22］Giese AK，F(xiàn)rahm J，Hubner R，et al.Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells ［J］.BMC Cell Biol，2010，11（94）：3－13.