毛普加，馮夢蝶，洪 愉，毛小萍，許澤仰，趙繼華，楊洪文，宋武戰(zhàn)，黃 芬，井申榮，曾韋錕

（1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室，云南 昆明 650214；3.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650032；4.湖北省孝感市中心醫(yī)院泌尿外科，湖北 孝感 432000）

甲型副傷寒沙門菌（副甲菌）以糞口途徑傳播，是甲型副傷寒的病原菌。人群對副甲菌普遍易感，尤以兒童和青壯年發(fā)病率最高。每年全球傷寒患者約2200萬例，其中由副甲菌引起的約500萬例［1］。噬菌體是生物圈中最多的微生物，其數(shù)量約是細(xì)菌的10倍［2］，作為細(xì)菌的殺手，噬菌體對微生物生態(tài)環(huán)境和宿主細(xì)菌進(jìn)化有重要影響。在自然界中，噬菌體和宿主通過噬菌體侵染和噬菌體抗性機(jī)制使兩者達(dá)到宿主－噬菌體動(dòng)態(tài)平衡，而宿主菌證實(shí)通過這種噬菌體侵染的壓力獲得一些特殊的生物學(xué)特性。在很多發(fā)酵行業(yè)，需要培養(yǎng)大量細(xì)菌，所以在不同的階段都面臨著噬菌體污染的問題，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長、產(chǎn)量降低甚至全部浪費(fèi)，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。研究抗噬菌體的機(jī)制，通過抗噬菌體篩選出優(yōu)良的工程菌和獲得特殊性狀的宿主菌［3］，在工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中越顯重要。在宿主菌抗噬菌體突變后，會獲得一些其他的未知特性，而這些特性對于工業(yè)生產(chǎn)和研究等具有重大意義，例如利用抗噬菌體制備減毒疫苗［4－5］等。目前，抗噬菌體的研究處于起步階段，并且主要用于工業(yè)生產(chǎn)，對于生物制藥、科學(xué)研究等方面涉及甚少，所以抗噬菌體的研究具有廣泛的前景。本課題組前期［6］從醫(yī)院污水篩選出烈性副甲噬菌體PSPA1，并用轉(zhuǎn)座突變、不對稱PCR和測序等方法篩選出抗噬菌體突變菌，測序發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)包括甲基轉(zhuǎn)移酶、硫代硫酸鹽還原酶電子前體和乙酰乳酸合酶同工酶Ⅲ大亞基。本研究中通過基因敲除的方法分別定點(diǎn)敲除上述基因，并進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因與副甲耐受噬菌體的相關(guān)性，同時(shí)對敲除突變菌的生物學(xué)特性進(jìn)行檢測，為探索噬菌體和宿主相互作用、噬菌體的生命活動(dòng)和篩選特殊生物學(xué)特性的突變菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和主要試劑 副甲菌CMCC50973為本實(shí)驗(yàn)室保存；噬菌體PSPA1為本實(shí)驗(yàn)室保存，由醫(yī)院污水中分離獲得；pYG4［7］：自殺性卡那霉素（K＋50mg·L－1）抗性質(zhì)粒（圖1），在副甲菌中表現(xiàn)自殺性，也是一種蔗糖敏感性質(zhì)粒，在含有蔗糖培養(yǎng)基中無法復(fù)制；LB培養(yǎng)基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，定容至1L（固體加2%瓊脂）；DL2000DNA marker購自大連寶生物工程（Takara）公司；氯霉素、卡那霉素（K＋）、鏈霉素、氨芐青霉素（A＋）、紅霉素、四環(huán)素、萘啶酮酸和PCR試劑均購自上海生工有限公司；實(shí)驗(yàn)所用的引物均由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建 同源重組質(zhì)粒的片段構(gòu)建見圖2。根據(jù)GenBank參考序列（FM2000053.1）設(shè)計(jì)引物，下劃線部分為BglⅡ酶切位點(diǎn)（表1），分別在1號和4號引物中引入BglⅡ酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，先用1、2號引物及3、4號引物擴(kuò)增，之后通過融合PCR構(gòu)建融合臂。BglⅡ酶切pYG4質(zhì)粒后去磷酸化，與同樣經(jīng)BglⅡ酶切的融合PCR產(chǎn)物連接，構(gòu)建pYG4－2、pYG4－3和pYG4－5重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序鑒定。

圖1 pYG4質(zhì)粒圖譜Fig.1 Map of pYG4plasmid

圖2 同源臂的構(gòu)建圖Fig.2 Construction diagram of homologous arm

1.3 同源重組突變菌的制備及鑒定 副甲菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備：在100mL LB培養(yǎng)基中接種新鮮的野生型副甲菌（1%），37℃搖床培養(yǎng)約4h至A≈0.6；分裝至50mL離心管中，3000g離心10min，棄上清；沉淀用無菌水洗滌，3000g離心10min，棄上清，重復(fù)3次；沉淀用4mL 10%甘油重懸，按100μL每管分裝，－80℃保存。將構(gòu)建好的pYG4－2、pYG4－3和pYG4－5重組質(zhì)粒以電壓2000V、脈沖25μF和電阻200Ω電轉(zhuǎn)條件電轉(zhuǎn)到副甲菌感受態(tài)中，涂布于卡那霉素平板中，37℃培養(yǎng)20h；接種單菌于含有20%蔗糖LB培養(yǎng)基中，長出的單菌即為待鑒定重組突變菌。將突變菌進(jìn)行圖2中所示的0、5號外側(cè)引物PCR驗(yàn)證。3株突變菌和野生型副甲菌在平板中劃線，待干后于線上滴加噬菌體原液（pfu＝1.2×109），37℃培養(yǎng)過夜。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.4 突變菌抗生素敏感性的測定 將96孔板用75%酒精浸泡20min，放入超凈臺中晾干，再用紫外照射20min滅菌。選擇氨芐青霉素（0、12.5、 25.0、 50.0、 75.0、 100.0和150.0mg·L－1）、卡那霉素（0、10、15、20、25、30、40和50mg·L－1）、氯霉素（0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、50.00mg·L－1）、鏈霉素（0、10、20、40、50、100和200mg·L－1）、紅霉素（0、20、50、100、150和200mg·L－1）、四 環(huán) 素（0、1、2、5、10和20mg·L－1）和萘啶酮酸（0、2、5、10、20和30mg·L－1）7種不同類型的抗生素；用LB培養(yǎng)基將不同的抗生素稀釋至不同濃度并加入滅菌的96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，按1%接種，在潮濕環(huán)境中培養(yǎng)24h，以野生型副甲菌作為對照，通過測量突變菌在不同抗生素濃度下595nm處的吸光度（A595）值判斷其抗生素的敏感性［8］。

1.5 突變菌溫度和pH值敏感性的測定 將LB培養(yǎng)基調(diào)pH值1～12，按1%接種于滅菌的96孔板中，潮濕環(huán)境下37℃培養(yǎng)24h，測量A595值；取3株突變菌和野生型副甲菌各50μL分別于40、50、60、70和80℃中處理1h，接種至滅菌的96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，潮濕環(huán)境下37℃培養(yǎng)24h。以野生型副甲菌作為對照，測量突變菌經(jīng)不同溫度和pH處理后的A595值，判斷突變菌對溫度和pH的敏感性。

1.6 突變菌鹽離子耐受范圍的測定 將LB培養(yǎng)基分別用NaCl、KCl和MgCl2·7H2O調(diào)節(jié)相應(yīng)的鹽離子濃度，濃度分別為0%、2%、5%、10%、15%、20%、25%和30%。然后按1%接種滅菌的96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，潮濕環(huán)境下37℃培養(yǎng)24h，以原始副甲菌作為對照，測量不同鹽離子濃度下突變菌的A595值判斷突變菌對鹽離子的耐受范圍。

1.7 突變菌生長曲線的測定 取3株新鮮的突變菌和野生型副甲菌按1%接種至5mL培養(yǎng)基中，放入37℃搖床培養(yǎng)，此時(shí)記為0min，第一次間隔1h取樣，其余每隔30min取樣，測量A595值，直到7h為止，重復(fù)3次［9］。

2 結(jié) 果

2.1 同源重組及突變菌的鑒定 以副甲菌基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增部分目的基因，PCR進(jìn)行融合（圖3），經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定片段長度均約為1000bp，和預(yù)期大小一致（圖4）；融合PCR片段插入pYG4載體，測序鑒定正確。抗噬菌體驗(yàn)證見圖5，3株敲除突變菌均表現(xiàn)為噬菌體抗性。

圖3 目的片段融合PCR電泳圖Fig.3 Electrophoregram of fusion PCR of target fragments

2.2 突變菌抗生素的敏感性 選擇氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素和萘啶酮酸7種不同抗生素用于突變菌抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)，2、3、5號菌株產(chǎn)生卡那霉素抗性；2號菌株產(chǎn)生氨芐青霉素抗性；3株突變菌比野生型副甲對鏈霉素更為敏感性，2號菌株尤為突出；所有菌株對其他抗生素的敏感性無明顯差異。見圖6。

2.3 突變菌對溫度和pH值敏感性 將3株突變菌和野生型副甲菌于不同pH值的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和經(jīng)不同溫度處理1h后再培養(yǎng)，觀察其生長狀況。3株突變菌對pH值敏感性無明顯變化，最適生長pH值約為6；5號突變菌表現(xiàn)出明顯的耐熱性，高于60℃后5號突變菌的A595值保持穩(wěn)定。見圖7。

圖4 突變菌鑒定電泳圖Fig.4 Electrophoregram of identification of mutants

圖5 突變菌抗噬菌體驗(yàn)證圖Fig.5 Verification of mutants resistant to phage

2.4 鹽離子耐受 將3株突變菌和野生型副甲菌接種至含有不同濃度（0%、2%、5%、10%、15%、20%、25%和30%）的 NaCl、KCl和MgCl2·7H2O培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，4株菌A595值均隨著鹽離子濃度增加而降低，且其趨勢相近無明顯差異。見圖8。

2.5 突變菌的生長曲線 接種突變菌和野生型副甲菌，每間隔一段時(shí)間取樣測量A值，3株突變菌較野生型副甲菌生長緩慢，尤其是2號突變菌，其達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間要比野生型副甲菌晚約3h。見圖9。

圖6 突變菌對不同抗生素的敏感性分析圖Fig.6 Diagram of analysis of sensitivities of mutants to different antibiotics

3 討 論

本課題組前期采用轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pSC189隨機(jī)插入副甲菌基因組，通過噬菌體篩選出抗噬菌體突變菌，測序結(jié)果表明：轉(zhuǎn)座子插入的位點(diǎn)包括甲基轉(zhuǎn)移酶、硫代硫酸鹽還原酶和乙酰乳酸合酶同工酶Ⅲ大亞基。為排除上述突變菌耐受噬菌體是由于自發(fā)突變［11］等其他因素造成的，需要基因敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

宿主菌有多種抗噬菌體機(jī)制，并在自然界中能篩選出抗噬菌體的突變菌［12－13］，而基因敲除是基因功能研究的一種重要人工手段，且敲除方法也較多。本研究采用王景等［7］構(gòu)建的敲除質(zhì)粒pYG4，該質(zhì)粒是依賴π蛋白的復(fù)制子，在副甲菌等絕大多數(shù)細(xì)菌中不能復(fù)制，同時(shí)載體中含有SacB基因，在蔗糖存在條件下具有致死性?？紤]到細(xì)菌染色體中廣泛存在的基因重疊現(xiàn)象，為了避免可能對鄰近基因表達(dá)的影響，在構(gòu)建同源臂時(shí)，分別保留了待敲除基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游和終止子上游部分堿基，保留堿基數(shù)為3的倍數(shù)，這樣力求在去除目的基因的同時(shí)，避免影響上下游基因的表達(dá)。構(gòu)建的敲除質(zhì)粒pYG4－2、pYG4－3和pYG4－5轉(zhuǎn)化副甲菌后，發(fā)生了2步同源重組：首先以2、3、5號片段作為同源臂，將整個(gè)重組質(zhì)粒重組到至副甲菌基因組中，通過卡那霉素篩選出突變菌，于含20%蔗糖平板中劃線，此時(shí)完全重組突變菌會丟失卡那霉素抗性且能在蔗糖平板上生長。通過突變位點(diǎn)外側(cè)引物PCR可證實(shí)敲除結(jié)果。通過此方法獲得的定點(diǎn)敲除副甲菌，經(jīng)噬菌體感染實(shí)驗(yàn)確定突變菌具有噬菌體抗性，表明這些基因的確與噬菌體PSPA1感染宿主CMCC50973有關(guān)聯(lián)。

上述3種基因在副甲菌中詳細(xì)功能并不清楚，為此本研究對敲除菌進(jìn)行了一些生物學(xué)特性分析。在抗性實(shí)驗(yàn)中，3株突變菌產(chǎn)生了卡那霉素抗性，鑒于pYG4質(zhì)粒中含有卡那抗性基因，因此對于3株突變菌的卡那霉素抗性尚需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒別和分析。與野生型副甲菌比較3株突變菌均對鏈霉素表現(xiàn)出敏感性；2號菌表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性，5號菌表現(xiàn)高溫度耐受性；另外3株突變菌的生長曲線較野生型副甲菌明顯變緩，尤其是2號突變菌。突變菌表現(xiàn)出的生物學(xué)特性和抗生素的耐受性及溫度敏感度，豐富了相關(guān)基因潛在功能知識，同時(shí)對于深入研究副甲菌對不同環(huán)境的環(huán)境適應(yīng)、耐藥機(jī)制和致病性等方面具有重要作用，但是目前對這些生物特性改變的機(jī)制尚不清楚，最有可能的是宿主菌基因的突變改變某些蛋白的表達(dá)，下一步需要進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究［14］。

圖7 突變菌對不同pH值和溫度敏感性分析圖Fig.7 Diagram of analysis of sensitivities of mutants to different pH values and temperature

圖8 突變菌對不同鹽離子濃度敏感性分析圖Fig.8 Diagram of analysis of sensitivities of mutants to different concentrations of salt ions

圖9 突變菌生長曲線圖Fig.9 Growth curves of mutants

但是這些生物學(xué)性質(zhì)的改變是否與噬菌體耐受有關(guān)尚不清楚，本文作者推測這些基因的破壞可能導(dǎo)致副甲菌中某些物質(zhì)合成障礙或者信號通路變化，影響到噬菌體侵染（吸附、增殖和釋放）的相關(guān)環(huán)節(jié)［15］；也有可能是改變了宿主菌自身的性狀，例如加強(qiáng)了宿主菌聚集，增強(qiáng)宿主菌的群體效應(yīng)，從而抵抗噬菌體侵染［16］。下一步研究可從蛋白表達(dá)和宿主菌群體效應(yīng)等方面著手，更深入地探索這些突變菌抗噬菌體的機(jī)制。

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