劉 陽(yáng)，張 巖，謝文兵，伍翔群，郭 建，迪拉熱·力迪甫，牛鳳蘭

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所 國(guó)家電化學(xué)和光譜研究分析中心，吉林 長(zhǎng)春 130021）

東北菱性味甘涼，清暑解熱，益氣健脾［1］，富含蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸和多糖等多種活性成分［2］，具有廣泛的食用價(jià)值和藥用價(jià)值［3］。比較國(guó)外同類研究，東北菱提取物有更強(qiáng)的抑制肝癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及更強(qiáng)的抗氧化能力［4－7］。菱角粗多糖具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及較強(qiáng)的清除自由基的能力［8－9］。這類藥食同用植物多糖無細(xì)胞毒性，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙醇和丙酮3種溶劑對(duì)東北菱進(jìn)行提取，探討最佳提取溶劑。在多糖提取液中，蛋白質(zhì)占的比例很大，如何去除粗多糖中的蛋白質(zhì)，一直是多糖分離純化的一個(gè)難題。本實(shí)驗(yàn)采用Sevag法、三氯乙酸法、鹽酸法和活性炭法4種傳統(tǒng)方法［10］對(duì)菱角粗多糖進(jìn)行純化，對(duì)純化效果進(jìn)行比較，為菱角粗多糖活性的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

本研究所用東北菱采集于吉林省大安縣，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)樊紹缽教授鑒定是水生草本植物菱的果實(shí)。東北菱粗提物由本實(shí)驗(yàn)室制備；苯酚 （吉林亞泰生物藥業(yè)有限公司，配置成5%苯酚溶液），活性炭 （天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心），氯仿、正丁醇、三氯乙酸、鹽酸、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、濃硫酸、磷酸、甲醇、乙醇和丙酮 （均為分析純，北京化工廠），標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白 （北京鼎同生物技術(shù)責(zé)任有限公司），考馬斯亮藍(lán)G－250（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）。PE Lambda 900紫外可見分光光度計(jì) （美國(guó)PE公司），電子天平 （賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），HH－1數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇市江南儀器廠），DZF－6050真空干燥箱 （上海一恒科技有限公司），TDL－40B離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠），超聲波清洗機(jī) （寧波新芝生物科技股份有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 東北菱粗多糖的提取

1.2.1 東北菱甲醇、乙醇和丙酮提取物的制備精確稱取東北菱粗提物20.00g置于500mL錐形瓶中，分別用70%甲醇、乙醇和丙酮200mL為提取溶劑進(jìn)行提取，40℃加熱回流提取4h，提取液過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥，低溫低壓條件下將所得濾液置于100mL容量瓶中，定容至刻度，即得東北菱的甲醇、乙醇和丙酮提取物，4℃冰箱保存待用。

1.2.2 苯酚－硫酸法測(cè)定多糖水平 精密稱取100mg干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品置于100mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，備用。使用時(shí)稀釋10倍，即得質(zhì)量濃度為100mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖對(duì)照溶液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL置于10mL具塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)充至2.00mL，依次加入5% 苯酚溶液1.60mL，濃硫酸5mL，混合均勻，恒溫水浴箱中沸水浴30min，冷卻后，在波長(zhǎng)490nm處測(cè)溶液吸光度 （A）值，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

標(biāo)準(zhǔn)曲線符合線性關(guān)系，將測(cè)得的各樣品A值代入回歸方程Y＝0.0049X－0.0512，即可得樣品中多糖水平。

樣品中多糖水平的測(cè)定：精密稱取各東北菱提取物100mg置于100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，用時(shí)稀釋10倍，得到質(zhì)量濃度為100mg·L－1的提取物溶液，備用。精確吸取各提取物溶液2mL，依次加入5% 苯酚溶液1.60mL，濃硫酸5mL。搖勻，沸水浴30min，冷卻后測(cè)溶液的A490值，計(jì)算多糖水平。多糖水平＝A490值對(duì)應(yīng)多糖的水平／樣品的質(zhì)量×100%。

1.2.3 加樣回收法測(cè)樣本回收率 精密稱取已知多糖水平的提取物樣品溶液，吸取5份，每份1.48mL，分別加入0.20、0.30、0.40和0.50mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖對(duì)照品溶液，測(cè)定A490值，計(jì)算回收率，考察方法的準(zhǔn)確度。回收率＝ （測(cè)得A490值－樣品中被測(cè)成分原本A490值）／加入標(biāo)準(zhǔn)品A490值×100%。

1.3 東北菱粗多糖純化方法的比較

將多糖水平最高的提取物用以下4種方法進(jìn)行純化。

1.3.1 Sevag法 精確稱取1.00g東北菱提取物樣品，配制成質(zhì)量濃度為20g·L－1的樣品溶液。按氯仿∶正丁醇＝4∶1的比例配制Sevag溶液10mL，與50mL樣品溶液混合，充分震蕩30min，置于分液漏斗內(nèi)靜止1h，上層液4000r·min－1離心10min，留取上清液，重復(fù)上述步驟5次。

1.3.2 三氯乙酸法 精確稱取1.00g東北菱提取物樣品，配制成質(zhì)量濃度為20g·L－1的樣品溶液。取50mL樣品溶液，加入10% 三氯乙酸溶液，調(diào)至pH＝3，充分混勻，靜置過夜。次日將溶液移入離心管內(nèi)，4000r·min－1離心10min，棄去沉淀，保留上清液，以待測(cè)定。

1.3.3 鹽酸法 精確稱取1.00g東北菱提取物樣品，配制成質(zhì)量濃度為20g·L－1的樣品溶液。取50mL樣品溶液，緩慢加入一定體積2mol·L－1鹽酸，使溶液pH＝3?；旌暇鶆颍o置過夜，次日4000r·min－1離心10min，棄去沉淀，保留上清液。

1.3.4 活性炭法 精確稱取1.00g東北菱粗多糖樣品，配制成質(zhì)量濃度為20g·L－1的樣品溶液。取20mL樣品溶液加入1.00g活性炭粉末，充分混勻，50℃恒溫水浴2h，4000r·min－1離心10min。去除活性炭殘?jiān)?，保留上清液?/p>

1.3.5 多糖水平的測(cè)定 經(jīng)4種方法純化后的多糖溶液按照1.2.2方法測(cè)定多糖水平。

1.3.6 蛋白質(zhì)水平的測(cè)定 考馬斯亮藍(lán) G－250溶液配制：精密稱取考馬斯亮藍(lán)G－25010.00mg置于100mL容量瓶中，依次加入95%無水乙醇5mL，85% 磷酸10mL，混合均勻，加蒸餾水定容至刻度，避光備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確稱取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1.00mg至容量瓶中，加蒸餾水定容至10mL，溶液質(zhì)量濃度為1g·L－1。精確量取標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00mL置于具塞試管中，補(bǔ)蒸餾水至1.00mL，加考馬斯亮藍(lán) G－250溶液5mL，立即混合均勻，于595nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，A595值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖2。

圖2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of bovine serum albumin

樣品中蛋白質(zhì)水平的測(cè)定：精密吸取上述4種方法處理后得到的提取物溶液各1mL，分別加考馬斯亮藍(lán)G－250溶液5mL，以空白試劑為參比，于595nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定A595值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度及蛋白水平。蛋白水平＝A595值對(duì)應(yīng)的蛋白水平／樣品的質(zhì)量×100%。

2 結(jié) 果

2.1 東北菱提取物中多糖水平

以甲醇、乙醇和丙酮為溶劑的東北菱提取物中多糖水平分別為29.68%、18.77%和33.69%，以丙酮為溶劑的東北菱提取物中多糖水平最高，故以下實(shí)驗(yàn)均以該提取物為樣品。對(duì)以丙酮為溶劑的東北菱提取物進(jìn)行回收率測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 東北菱粗多糖的回收率Tab.1 Recovery rates of raw polysaccharide of northeast water chestnut

2.2 不同方法純化后東北菱多糖水平

經(jīng)Sevag法、三氯乙酸法、鹽酸法和活性炭法處理后的東北菱提取物溶液中A490值對(duì)應(yīng)的多糖水平 依 次 為 93.059、 86.875、 82.482 和73.315mg·L－1，計(jì)算得各東北菱提取物溶液中多 糖 水 平 所 占 比 依 次 為 46.53%、43.44%、41.24%和36.66%。經(jīng)4種方法處理后的溶液中多糖水平均高于東北菱提取物溶液中多糖水平。這4種方法對(duì)菱角粗多糖純化均有較好的效果，其純化效果順序?yàn)镾evag法＞三氯乙酸法＞鹽酸法＞活性炭法。

2.3 不同方法純化后東北菱提取液中蛋白質(zhì)水平

東北菱提取液中蛋白質(zhì)水平為5.51%，經(jīng)Sevag法、三氯乙酸法、鹽酸法和活性炭法處理后的東北菱提取物溶液中A595值對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)水平依次為 56.353、54.125、54.071和55.068mg·L－1，計(jì)算得各東北菱提取物溶液中蛋白質(zhì)水平占比依次為5.64%、5.41%、5.41%和5.51%。經(jīng)4種方法處理后的東北菱提取溶液中平均蛋白質(zhì)水平占比均約為5%，總體變化不大。

3 討 論

東北菱多糖為東北菱中的天然活性成分，為水溶性。在醇、酮等極性強(qiáng)的溶劑中的溶解度較低，因此向溶解了大量多糖的水溶液中加入醇溶劑可使多糖沉淀［11－12］。

本實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙醇和丙酮3種溶液作為溶劑提取東北菱粗多糖，比較3種提取物中多糖水平，結(jié)果顯示：以丙酮為溶劑的提取物中多糖水平最高，這與3種溶劑的極性強(qiáng)弱有關(guān)聯(lián)。

多糖的測(cè)定方法有苯酚－硫酸法和蒽酮－硫酸法［13］。范傳穎等［14］對(duì)2種方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)苯酚－硫酸法靈敏度高且不受蛋白質(zhì)存在的影響，測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確合理。因此，本實(shí)驗(yàn)采用苯酚－硫酸法檢測(cè)東北菱提取物中多糖水平。

本研究比較了Sevag法、三氯乙酸法、鹽酸法和活性炭法4種傳統(tǒng)方法的多糖純化效果，結(jié)果顯示：4種方法對(duì)東北菱粗多糖的純化均有較好效果，順序?yàn)镾evag法＞三氯乙酸法＞鹽酸法＞活性炭法。Sevag法操作條件溫和，對(duì)糖鏈破壞較小，且所用試劑常規(guī)、廉價(jià)，適合東北菱粗多糖的提??；三氯乙酸法和鹽酸法純化粗多糖效果均不如Sevag法；鹽酸法中鹽酸為強(qiáng)酸，若不嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，經(jīng)鹽酸法脫蛋白后，會(huì)降解部分多糖，粗多糖的提取過程中，容易發(fā)生氧化反應(yīng)生成有色色素，從而影響多糖性質(zhì)；活性炭法是常用的脫色素方法，同時(shí)也有吸附蛋白的作用。中草藥中的多糖因含有酚型化合物而顏色較深，其中的色素大多呈負(fù)性離子，導(dǎo)致活性炭吸附劑脫色效果不明顯，且純化過程中損失多糖較多。

郭育東等［15－17］對(duì)苦瓜多糖的脫蛋白質(zhì)方法進(jìn)行比較結(jié)果顯示：無論哪種脫蛋白質(zhì)方法所得的多糖制品中均存在一部分蛋白質(zhì)不能被脫掉。

本研究結(jié)果顯示：4種方法處理后樣品中均有約5%的蛋白質(zhì)成分，與郭育東等［15］的研究結(jié)果一致，說明東北菱中蛋白質(zhì)的存在形式可能是糖蛋白或糖肽，單純靠這4種傳統(tǒng)方法不能使其脫除，如果要獲得更為純化的多糖制品，還需要經(jīng)過其他一系列的精細(xì)分離純化工藝。

從多糖的生物學(xué)功能與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系來看，東北菱多糖的糖蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)生物體內(nèi)的生物活性功能發(fā)揮重要作用仍有待于深入研究。

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