龍 兵,羅 楊,皮建華,周 豪

（1.四川警察學(xué)院 四川瀘州 646000；2.瀘州市公安局 四川瀘州 646000）

案發(fā)時(shí)間的判斷對(duì)于案件的偵破具有十分重要的意義。血痕是現(xiàn)場(chǎng)非常常見的生物物證，通常能夠比較準(zhǔn)確地反映案發(fā)時(shí)間。血痕遺留時(shí)間的推斷一直是刑事科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[1-4]。

RNA是分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，同時(shí)受到法醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注。許多研究報(bào)道機(jī)體組織RNA會(huì)隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生降解，降解與死亡時(shí)間具有一定的相關(guān)性[5-7]。這些研究大多以組織器官為研究對(duì)象，關(guān)于血痕RNA降解的研究相對(duì)較少。本次研究以管家基因β-actin和血液中特異性表達(dá)的HBB為目的基因，18s rRNA為內(nèi)參基因，探討血痕在離體72小時(shí)時(shí)間內(nèi)mRNA的降解情況。

一、材料與方法

（一）樣本。

采集6名個(gè)體靜脈血（3名男性，3名女性），各1mL，EDTA抗凝。取20μL血液滴于吸水濾紙上，共制作42份樣本，室溫保存，分別于0.5h、2h、6h、12h、24h、48h、72h后提取RNA。

（二）儀器與試劑。

采用TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取RNA。采用Bioneer逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增采用的試劑盒為Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)熒光定量試劑盒，擴(kuò)增儀器為AB-7500實(shí)時(shí)定量PCR儀。

（三）方法。

1.RNA抽提。剪取制作的血痕于1.5mL離心管，加入0.5mLTRIzol試劑，室溫下震蕩混勻5min，加0.1mL氯仿，混勻，放置3min； 12000g離心15min；取上清，加入250μL異丙醇，混勻，12000g離心10min；棄上清，加入75%乙醇1mL，7500g離心5min。棄上清，短暫室溫干燥，加入DEPC水溶解，-80保存。實(shí)驗(yàn)操作均在冰上進(jìn)行，離心均為-4℃低溫離心。

2.RNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為5μL模板RNA,基因特異性逆轉(zhuǎn)錄引物濃度為20pmol，總反應(yīng)體系為20μL。 反應(yīng)條件為50℃保溫1h，95℃變性5min。

表1 逆轉(zhuǎn)錄基因特異性引物

3.實(shí)時(shí)定量PCR。HBB、β-actin和18s rRNA的擴(kuò)增引物見表2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：5μL SYBR Green,前后引物終濃度均為0.5μM，總反應(yīng)體系為10μL。

表2 HBB、β-actin和18s rRNA擴(kuò)增引物

擴(kuò)增條件為：

?

（四）數(shù)據(jù)分析。

以實(shí)時(shí)定量PCR的CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析軟件為Excel2007、GraphPad Prism5。

二、結(jié)果

（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)PCR擴(kuò)增片段，片段大小與預(yù)期大小相符合，見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

從左至右分別為Marker、18s rRNA、β-actin、HBB。

（二）RNA降解與血痕遺留時(shí)間的相關(guān)性。

獲得各樣本實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增CT值，HBB、18s rRNA、β-actin實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線見圖2。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線

從左至右分別為HBB、18s rRNA、β-actin。

以18s rRNA為內(nèi)參計(jì)算ΔCT值，即ΔCT=CT（target mRNA）-CT(reference DNA)[8]，建立ΔCT值與血痕遺留時(shí)間的相關(guān)性。結(jié)果顯示在72小時(shí)時(shí)間內(nèi)，血痕β-actin、HBB基因mRNA具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，mRNA降解與血痕遺留時(shí)間沒有相關(guān)性（p＞0.05）。HBB、β-actin基因mRNA降解與血痕遺留時(shí)間的相關(guān)性見圖3、圖4。

圖3 HBB基因mRNA降解與血痕遺留時(shí)間相關(guān)性（r=0.4325,p=0.3324）

圖4 β-actin基因mRNA降解與血痕遺留時(shí)間相關(guān)性（r=0.3985,p=0.3759）

三、討論

RNA在細(xì)胞內(nèi)以多種形式存在，主要包括mRNA、tRNA、rRNA等。18s rRNA與核糖體蛋白緊密結(jié)合，受到核糖體蛋白的保護(hù)，穩(wěn)定性強(qiáng)，不易發(fā)生降解[9]。許炎等[10]，在研究中發(fā)現(xiàn)血痕18s rRNA在8-15天都沒有發(fā)生明顯降解。研究中，我們以18s rRNA為內(nèi)參對(duì)HBB和β-actin兩個(gè)目的基因CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，能夠更加準(zhǔn)確的觀察血痕mRNA的降解情況，更好的反映mRNA降解與血痕遺留時(shí)間的相關(guān)性。

許多研究報(bào)道機(jī)體死亡后細(xì)胞mRNA在數(shù)天甚至數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生快速降解[7,11]。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)血痕HBB和β-actin基因mRNA在72小時(shí)時(shí)間內(nèi)都保持了很強(qiáng)的穩(wěn)定性，這與機(jī)體在死亡后細(xì)胞mRNA降解有很大差異。我們認(rèn)為導(dǎo)致血痕mRNA降解速度慢的原因，一方面可能與血痕在濾紙上迅速干燥，RNA酶以及相關(guān)因子的活性降低有關(guān)；另一方面，可能與實(shí)驗(yàn)環(huán)境相對(duì)理想化，受到外界的污染相對(duì)較小有關(guān)。該研究涉及的血痕遺留時(shí)間相對(duì)較短，在以后的研究中，我們將進(jìn)一步延長(zhǎng)血痕遺留時(shí)間，同時(shí)探討溫度、濕度等因素對(duì)血痕RNA降解的影響。

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