方淑梅, 王 偉, 杜沖曉, 趙東磊, 李 超, 梁喜龍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 大慶 163319)

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稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的生物信息學(xué)分析

方淑梅#, 王 偉#, 杜沖曉, 趙東磊, 李 超, 梁喜龍*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 大慶 163319)

稻瘟病菌重金屬抗性蛋白是稻瘟病菌在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的分泌型抗性蛋白,其可能對(duì)該病原菌在高濃度重金屬環(huán)境中的生長(zhǎng)、繁殖及生活史完成具有重要作用。為了明確稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的生物信息學(xué)特性,本研究利用多種生物信息學(xué)網(wǎng)站與軟件對(duì)獲得的3種重金屬抗性蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行分析,并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹,同時(shí)預(yù)測(cè)了蛋白的組織表達(dá)特異性。該研究結(jié)果可為從遺傳學(xué)方面深入了解重金屬抗性蛋白在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和致病過程中的真正功能奠定基礎(chǔ)。

生物信息學(xué); 稻瘟病菌; 重金屬抗性蛋白; 結(jié)構(gòu)分析; 理化特性

稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)屬于半知菌亞門,灰梨孢屬，可引起水稻稻瘟病,每年給全球水稻產(chǎn)量造成的損失超過1億t,給世界糧食安全生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅[1-2]。因稻瘟病菌具有許多植物病原真菌生命循環(huán)的重要特點(diǎn),且其侵染過程、致病機(jī)制和相伴隨的基因表達(dá)在絲狀真菌中具有典型性,該菌現(xiàn)已成為植物病原真菌致病機(jī)理和分子生物學(xué)研究的一種重要模式真菌[3]。

重金屬對(duì)生物機(jī)體的作用具有雙重性,Cu、Zn、Mn等微量元素可作為多數(shù)酶的輔助因子維持細(xì)胞的正常代謝,但濃度過高則對(duì)生物體有害。其他重金屬,如Cd、Pb等并非生命活動(dòng)所需,含量超標(biāo)同樣會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生毒害。隨著工業(yè)化的迅猛發(fā)展,農(nóng)藥、化肥的大量使用及嚴(yán)重的環(huán)境污染，土壤中的重金屬含量大量增加,已嚴(yán)重威脅植物和土壤微生物的生存。研究發(fā)現(xiàn),自然界中的大多數(shù)原核和真核微生物,暴露在一定量的重金屬環(huán)境中都能利用自身的代謝機(jī)制盡量減少毒害或受毒后迅速恢復(fù)生長(zhǎng),繁殖后代,同時(shí)在遺傳上顯示出某些特定的生物反應(yīng)[4-5]。這一事實(shí)主要與微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生的抗性蛋白以及形成的多種適應(yīng)性有關(guān),例如分泌重金屬抗性蛋白。目前,有關(guān)芽胞桿菌屬[6]、葡萄球菌屬[7]、短桿菌屬[8]和根瘤菌屬[9]部分細(xì)菌，以及黑曲霉[10]等對(duì)重金屬(如Cd,Cr,Ni)的抗性機(jī)制已有報(bào)道。隨著稻瘟病菌基因組測(cè)序的完成,眾多學(xué)者對(duì)稻瘟病菌各方面的研究已較為深入,但對(duì)稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的研究仍然較少。為此,本文利用生物信息學(xué)方法分析了稻瘟病菌基因組中可能的重金屬抗性基因及蛋白序列,探討了稻瘟病菌的重金屬抗性機(jī)制,旨在為從反向遺傳探究它們?cè)诘疚敛【L(zhǎng)發(fā)育和侵染致病過程中所起的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 研究對(duì)象與分析方法

1.1 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白基因的獲取與確定

利用稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/magnaporthe grisea /MultiHome.html),輸入檢索詞heavy metal tolerance protein，獲取所有重金屬抗性蛋白基因序列及其相關(guān)信息。利用稻瘟病菌在線網(wǎng)站(http:∥fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/Info/Index),通過基因座位號(hào)檢索確定重金屬抗性蛋白基因的外顯子數(shù)、編碼外顯子數(shù)、內(nèi)含子數(shù)和基因在染色體上的位置,并利用MapChart 2.2軟件，參照基因和染色體的長(zhǎng)度按比例進(jìn)行繪制。

1.2 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將稻瘟病菌重金屬抗性蛋白序列提交到NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),利用同源性分別獲取相應(yīng)的同源蛋白,然后利用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行氨基酸序列多重匹配分析,參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值,所生成的 .aln文檔用MEGA 4.0軟件轉(zhuǎn)化為.meg文檔后,進(jìn)一步用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹,其中Test of Phylogeny選擇Bootstrap,Replications=500,Random seed=64238,Model選擇poisson correction。

1.3 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的理化特性分析與亞細(xì)胞定位

利用ExPASy(http:∥web.expasy.org/prot-param/)在線軟件,分析稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的分子量、等電點(diǎn)、親水性及穩(wěn)定性;利用SignalP 4.1在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),其中organism group選真核生物,其余參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)值;利用亞細(xì)胞定位在線軟件ProtcComp v.9.0(http:∥linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc)確定各蛋白在細(xì)胞中的具體位置。

1.4 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

首先利用Smart(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在線網(wǎng)站中的所有鏈接數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各重金屬抗性蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析,然后利用在線軟件DomainDraw(http:∥domaindraw.imb.uq.edu.au/),根據(jù)蛋白質(zhì)分子總長(zhǎng)度及結(jié)構(gòu)域起始與結(jié)束位置按比例繪制結(jié)構(gòu)域示意圖。

1.5 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件(http:∥zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)中的I-TASSER預(yù)測(cè)重金屬抗性蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),獲取三級(jí)結(jié)構(gòu)3D模型以及相關(guān)信息[11]。

1.6 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的EST表達(dá)分析

首先利用NCBI中的BLAST蛋白在線比對(duì)軟件,比對(duì)方式選擇tblastn,選擇Expressed sequence tags數(shù)據(jù)庫(kù),導(dǎo)入FASTA格式蛋白序列,獲取相應(yīng)mRNA序列的version號(hào),然后利用NCBI中的UniGene程序分析預(yù)測(cè)稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬抗性蛋白及基因的獲取與確定

本研究從稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲取3個(gè)重金屬抗性蛋白及相應(yīng)基因,其中蛋白ID分別為XP_003712732、XP_003709867和XP_003713406,基因座位分別為MGG_05190、MGG_11754和MGG_14069(表1)。3個(gè)重金屬抗性蛋白在大小及外顯子與內(nèi)含子數(shù)方面均存在一定差異。從表1可知,XP_003712732蛋白最大,但其外顯子數(shù)與實(shí)際的編碼外顯子數(shù)并不相同,因此該蛋白是一個(gè)提前終止的蛋白,而XP_003713406蛋白所對(duì)應(yīng)基因的外顯子數(shù)和內(nèi)含子數(shù)最多,因此MGG_14069基因在成熟轉(zhuǎn)錄體的形成上可能較為復(fù)雜。

表1 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白及基因的相關(guān)信息

2.2 重金屬抗性蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析及相應(yīng)基因的染色體定位

為了明確稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的進(jìn)化關(guān)系,本文利用MEGA 4.0軟件,采用Neighbor-Joining法繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹。圖1顯示,稻瘟病菌的3種重金屬抗性蛋白沒有聚在一起,遺傳距離較遠(yuǎn),因此進(jìn)化關(guān)系較復(fù)雜。其中XP_003712732與全蝕病菌中的EJT81035具有相同結(jié)點(diǎn),遺傳距離相等,表明兩者同源性最高;而與XP_003713406遺傳距離相等的是粗糙脈孢菌的NCU03228,表明兩者同源性最高,親緣關(guān)系也最近;而XP_003709867單獨(dú)成一分支,與XP_003712732和XP_003713406的遺傳距離均較遠(yuǎn),表明其在進(jìn)化上經(jīng)歷了不同的進(jìn)化途徑。經(jīng)染色體定位分析表明,3種稻瘟病菌重金屬抗性蛋白分別位于不同的染色體上,結(jié)果如圖2所示:其中XP_003709867位于第1號(hào)染色體上,XP_003713406位于第2號(hào)染色體上,XP_003712732位于第3號(hào)染色體上,并且均分布在染色體的兩端位置,這與3種蛋白進(jìn)化途徑的差異有一定的對(duì)應(yīng)性。

圖1 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of heavy metal tolerance proteins in Magnaporthe oryzae

圖2 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的染色體定位Fig.2 Chromosomal localization of heavy metal tolerance proteins in Magnaporthe oryzae

2.3 重金屬抗性蛋白的理化特性與亞細(xì)胞定位

從表2可以看出,3種蛋白質(zhì)的分子量存在一定的差異,其中XP_003712732分子量最大,為114.64 ku,XP_003709867分子量最小,為79.59 ku;3種蛋白均不含信號(hào)肽,屬于非分泌型的親水蛋白;在等電點(diǎn)方面,XP_003712732和XP_003709867偏堿性,XP_003713406偏酸性;在穩(wěn)定性方面, XP_003709867和XP_003713406為穩(wěn)定性蛋白,而XP_003712732屬于不穩(wěn)定蛋白,為進(jìn)一步確定重金屬抗性蛋白的特征,筆者利用在線軟件ProtcComp v.9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果顯示,3種蛋白質(zhì)皆存在于線粒體中。

表2 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

2.4 重金屬抗性蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI網(wǎng)站和Smart在線軟件對(duì)稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析預(yù)測(cè),結(jié)果如圖3所示,在蛋白質(zhì)的N端均具有transmembrane region結(jié)構(gòu)域,但XP_003712732含有的數(shù)量較多,而在XP_003713406中只含有一個(gè)transmembrane region結(jié)構(gòu)域。在蛋白質(zhì)的中間區(qū)域和C端部分, 3種蛋白有較大的不同,其中,XP_003709867不含ABC_membrane結(jié)構(gòu)域,而其余2種蛋白均含有該結(jié)構(gòu)域,同時(shí)只有XP_003712732的C端含有l(wèi)ow complexity結(jié)構(gòu)域,AAA結(jié)構(gòu)域在3種蛋白中均含有。因此中間區(qū)域和C端部分可能是稻瘟病菌重金屬抗性蛋白分類的根本特征,更是形成功能多樣性的決定部分。

2.5 重金屬抗性蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的功能與其三維結(jié)構(gòu)密切相關(guān),筆者利用蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件中的I-TASSER成功預(yù)測(cè)出了3個(gè)重金屬抗性蛋白的三維結(jié)構(gòu),結(jié)果

見表3和圖4。3種蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化Z值(Norm.Z-score)值均大于1,因此三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性高。同時(shí)通過與模板的比對(duì)參數(shù)來看,XP_003713406同一性值最低,分別為0.20和0.17;結(jié)合三維結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行比較,XP_003712732和XP_003709867兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)較相似,兩者與XP_003713406的結(jié)構(gòu)差異較大。

圖3 稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的功能結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.3 Functional domains of heavy metal tolerance proteins in Magnaporthe oryzae

蛋白ID號(hào)ProteinID一致性1Identity1一致性2Identity2覆蓋率Coveragerate標(biāo)準(zhǔn)化Z值Norm.Z-scoreXP_0037127320.360.230.573.51XP_0037098670.270.270.813.59XP_0037134060.200.170.704.18

1) 一致性1為線性對(duì)齊區(qū)域模板與本研究蛋白序列的相似性百分比；一致性2為整個(gè)模板鏈與本研究蛋白序列的相似性百分比。

Identity 1 is the percentage sequence identity of the templates in the threading aligned region with the query sequence; Identity 2 is the percentage sequence identity of the whole template chains with the query sequence.

2.6 重金屬抗性蛋白基因的EST表達(dá)分析

對(duì)稻瘟病菌重金屬抗性蛋白基因進(jìn)行EST表達(dá)分析,結(jié)果如表4所示。MGG_14069結(jié)果未知,MGG_05190在分生孢子中表達(dá),MGG_11754在菌絲體中表達(dá)。由此可見,重金屬抗性蛋白基因可能在維持稻瘟病菌正常生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖等過程中扮演著重要角色,同時(shí)這種表達(dá)部位上的差異性也許是稻瘟病菌的營(yíng)養(yǎng)體與繁殖體適應(yīng)重金屬逆境的一種策略。

圖4 XP_003712732、XP_003709867和XP_003713406的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig.4 The tertiary structure models of XP_003712732,XP_003709867 and XP_003713406

蛋白IDProteinID基因座位Genelocus分生孢子Conidium菌絲體Mycelium未知UnknownXP_003712732MGG_05190●XP_003709867MGG_11754●XP_003713406MGG_14069●

1) ●代表表達(dá)部位。

● indicates expression site.

3 結(jié)論與討論

目前,對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)重金屬抗性基因的研究較為普遍,多種重金屬抗性蛋白與重金屬離子之間的聯(lián)系已被揭示,并且已分離鑒定了諸多相關(guān)蛋白家族[12],但對(duì)稻瘟病菌重金屬抗性蛋白的研究卻較少。本研究通過生物信息學(xué)方法共獲得3個(gè)稻瘟病菌重金屬抗性蛋白及相應(yīng)基因序列,同時(shí)進(jìn)行了相應(yīng)分析。

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征對(duì)其功能具有決定作用[13]。研究發(fā)現(xiàn),3個(gè)重金屬抗性蛋白不含信號(hào)肽,具有親水性,在等電點(diǎn)、分子量、氨基酸數(shù)目等方面存在一定的差異,這與進(jìn)化分析中存在差異性的結(jié)果相一致。在對(duì)重金屬抗性蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位時(shí)發(fā)現(xiàn),3個(gè)重金屬抗性蛋白均位于線粒體中,這與前人對(duì)水稻的研究結(jié)果基本一致[14]。XP_003712732的穩(wěn)定性較差,推測(cè)其可能在發(fā)揮重金屬抗性作用時(shí)效果不顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)重金屬抗性蛋白各具有1個(gè)AAA保守結(jié)構(gòu)域。XP_003712732和XP_003713406還各具有1個(gè)ABC_membrane非保守結(jié)構(gòu)域。ABC_membrane具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能,這一結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘疚敛【谔幱诟邼舛然蛴卸局亟饘侪h(huán)境下,將有毒或過量的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞,保證真菌正常的生長(zhǎng)、繁殖尤為重要。通過表達(dá)部位分析發(fā)現(xiàn),MGG_05190和MGG_11754兩個(gè)基因分別在分生孢子和菌絲體中表達(dá),而MGG_14069基因未獲得確切的表達(dá)部位。蛋白XP_003712732穩(wěn)定性較XP_003713406差,XP_003713406與XP_003709867相比呈略酸性,分子量相對(duì)較大,推測(cè)蛋白XP_003713406可能在稻瘟病菌的重金屬抗性方面地位更為主要,值得在今后的正反向遺傳學(xué)研究中進(jìn)行重要關(guān)注。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Bioinformatics analysis of heavy metal tolerance proteins inMagnaportheoryzae

Fang Shumei, Wang Wei, Du Chongxiao, Zhao Donglei, Li Chao, Liang Xilong

(Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

Heavy metal tolerance proteins are secretory protein produced byMagnaportheoryzaeduring its evolution. They may play an important role in its growth, reproduction and life cycle in the environment polluted with high concentrations of heavy metals. In this study, three heavy metal tolerance proteins have been obtained inM.oryzaedatabase. To identify their characteristics, some websites and softwares were used to analyze the physiochemical property, domains, tertiary structure, subcellular localization and tissue-specific expression. Moreover, the phylogenetic relationship was analyzed by constructing phylogenetic tree. These results may provide a guideline for further study on the function of heavy metal tolerance proteins in the development, reproduction and pathogenesis ofM.oryzae.

bioinformatics;Magnaportheoryzae; heavy metal tolerance protein; structural analysis; physicochemical property

2014-08-16

2014-09-30

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310223001)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31201163)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究(12521381)

Q811.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.016

* 通信作者 E-mail:790007483@qq.com

# 共同第一作者