胡小斌, 梁旭東, 張 龍, 遲元凱, 王 暄, 李紅梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點實驗室, 南京 210095)

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禾谷孢囊線蟲與不同小麥根系的互作表型特征

胡小斌, 梁旭東, 張 龍, 遲元凱, 王 暄, 李紅梅*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點實驗室, 南京 210095)

為了明確高抗品種‘華麥1號’的抗禾谷孢囊線蟲機制,以Pluronic F-127膠體為介質(zhì),比較了禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲(J2)侵入根系前對抗病品種‘華麥1號’與感病品種‘豫麥34’和‘矮抗58’的根尖趨性差異,并采用室內(nèi)人工接種法觀察了線蟲侵入3個品種后的發(fā)育進程。結(jié)果表明,J2對3個品種的根尖均表現(xiàn)明顯的趨性,對‘矮抗58’的趨性最強,而對‘華麥1號’的最弱,接種4 h和6 h時‘華麥1號’與‘矮抗58’根尖吸引的線蟲總量差異顯著(P<0.05);組織染色觀察到J2對3個品種的根系均有一定數(shù)量的侵入,但高抗品種‘華麥1號’根系侵入的幼蟲量和后期形成的白雌蟲量均顯著低于感病品種‘豫麥34’和‘矮抗58’。結(jié)果證實,‘華麥1號’的抗性機制主要表現(xiàn)為減少線蟲的有效侵入量、抑制侵入后的線蟲生長發(fā)育。

禾谷孢囊線蟲; 抗性; 吸引; 侵染

禾谷孢囊線蟲(HeteroderaavenaeWollenweber,1924)是一種世界范圍內(nèi)危害禾谷類作物的重要病原線蟲,在全球40多個國家及地區(qū)均有發(fā)生和分布,在我國其危害已達16個省(市、自治區(qū)),給我國的糧食安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1-2]。禾谷孢囊線蟲病可通過施用化學(xué)殺線劑、非寄主輪作及種植抗病品種等措施進行防治,但大量施用化學(xué)藥劑容易造成環(huán)境污染及線蟲抗藥性等問題,而農(nóng)業(yè)防治(如休耕與輪作)由于受耕地面積減少、經(jīng)濟效益等各種因素限制,在實際應(yīng)用中無法有效推廣,選育和利用抗病品種是目前最經(jīng)濟有效的防治手段,澳大利亞通過選育和種植抗病品種已有效控制了該病的危害[3]。近年來,我國也開展了大量禾谷孢囊線蟲抗性品種篩選及種質(zhì)材料鑒定工作,鄭經(jīng)武等[4]測定了國內(nèi)8個省市22個小麥品種對禾谷孢囊線蟲山西太谷群體的抗性,獲得了‘揚麥5號’和‘鄭州831’兩個抗性品種;王振躍等[5]篩選出對河南鄭州群體表現(xiàn)高度抗性的‘CD01’和‘CD1234’2個小麥材料;趙洪海等[6]對15個山東小麥主栽品種進行室外盆栽測定,發(fā)現(xiàn)供試品種均為感病品種。有研究表明大豆對孢囊線蟲(H.glycines)的抗性主要表現(xiàn)在結(jié)構(gòu)、生理和化學(xué)等方面對線蟲設(shè)置障礙,阻止2齡幼蟲(J2)的侵入或擾亂線蟲的發(fā)育進程,使線蟲不能完成生活史[7]。然而,目前關(guān)于不同抗感小麥品種與禾谷孢囊線蟲互作表型研究的相關(guān)報道較少。因此,明確禾谷孢囊線蟲與不同抗感品種小麥根系的互作差異,對于揭示小麥品種抗性機制、有效開發(fā)利用抗性資源具有重要意義。

作者以禾谷孢囊線蟲江蘇沛縣群體為研究對象,連續(xù)3年開展了不同小麥品種對線蟲的抗感性測定,篩選出了高抗品種‘華麥1號’,同時明確了‘豫麥34’和‘矮抗58’分別為中感和高感品種[8],本研究進一步觀察比較了沛縣群體2齡幼蟲侵入上述不同抗感品種線蟲前后的表型差異,為揭示小麥品種抗性機制及有效利用抗線蟲品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

品種‘華麥1號’和‘豫麥34’由江蘇沛縣農(nóng)林局提供,‘矮抗58’由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究中心培育。

禾谷孢囊線蟲群體來自江蘇省沛縣當(dāng)季小麥?zhǔn)斋@后的田間自然病土,采集的土樣在室內(nèi)自然風(fēng)干后,用漂浮過篩法分離樣品中的孢囊[9],在體式顯微鏡下挑選飽滿孢囊,放入1 mL離心管中經(jīng)0.5% NaClO 表面消毒5 min,再用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗3～5次。將裝有孢囊的離心管置于5 ℃恒溫箱8周后,滴加適量無菌水,置于15 ℃培養(yǎng)箱孵化J2,收集J2懸浮液備用。

1.2 線蟲對根尖的趨性觀察

線蟲對根尖的趨性觀察參照Wang等的方法[10],在4 ℃條件下將Pluronic F-127(丙二醇嵌段聚醚F-127,Sigma,USA)粉末溶解于蒸餾水中并放置24 h,配制成23%(W/V)膠體溶液(pH 7.0),在溶液中加入收集的禾谷孢囊線蟲J2,調(diào)節(jié)膠體濃度為40條J2/100 μL,15 ℃保存?zhèn)溆谩｛湻N在25 ℃下催芽72 h,選取各品種胚根長勢相近的種子,切取長約0.5 cm及1 cm的胚根尖端,分別采用細(xì)胞培養(yǎng)板和載玻片方法觀察根尖對線蟲的吸引能力。

細(xì)胞培養(yǎng)板觀察法是在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入1 mL Pluronic F-127線蟲膠體溶液,在孔中分別放入‘華麥1號’、‘豫麥34’和‘矮抗58’的0.5 cm長根尖一段,在顯微鏡(Olympus DP72)下觀察接種1 h和3 h后線蟲對品種的趨性,各品種重復(fù)4次;此外,在培養(yǎng)板單孔中同時放入各品種的一段根尖,分別觀察0、2、4和6 h的線蟲趨性,重復(fù)4次。載玻片觀察法是滴加200 μL Pluronic F-127線蟲膠體溶液于載玻片上,放入1 cm長根尖一段,蓋上蓋玻片后,在顯微鏡下,分別統(tǒng)計0、2、4、6和8 h時間段吸引到根尖周圍2 mm的J2數(shù)量, 各品種重復(fù)4次。

1.3 線蟲在根組織內(nèi)的侵染進程觀察

將各品種催芽至胚根長約2 cm的幼苗,分別栽入裝有滅菌沙壤土(沙壤比1∶3)的PVC管(直徑3 cm×長度15 cm)中,在麥苗莖基部周圍插3個深約2 cm的小孔,用移液器接入J2懸浮液,每3 d接種1次,共接種3次,累計接種400條,每次接種后用細(xì)土覆蓋。接種后的麥苗置于人工光照培養(yǎng)室中,室溫控制在(15±2)℃,光照14 h。在最后一次接種后的第10、20、30、40和50天各取每品種的3株苗,洗凈根部后用次氯酸鈉—酸性品紅染色[11],在顯微鏡下統(tǒng)計侵入根內(nèi)的J2及其他蟲態(tài)。每個品種重復(fù)4次。

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

采用SPSS 11.5軟件對所有數(shù)據(jù)進行方差統(tǒng)計分析,用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗平均值的差異顯著性,應(yīng)用Excel軟件進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗感小麥品種根尖對線蟲的吸引能力

采用細(xì)胞培養(yǎng)板法觀察三維空間下不同抗感小麥品種根尖對禾谷孢囊線蟲的吸引能力,結(jié)果顯示,根尖放入前,線蟲隨機分布在Pluronic F-127膠體中,放入根尖后,J2開始逐漸向根尖移動,1 h時少量線蟲開始分別聚集在3個品種的根尖周圍,3 h時根尖周圍線蟲明顯增多,無論高抗品種‘華麥1號’,還是中感品種‘豫麥34’和高感品種‘矮抗58’,均有大量J2聚集在根尖的分生區(qū)和伸長區(qū),其中‘華麥1號’周圍線蟲相對較少,‘矮抗58’的數(shù)量最多(圖1)。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)板上不同抗感小麥根尖對Pluronic F-127 膠體中禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的吸引Fig.1 Attraction of wheat root tips with different resistance levels to Heterodera avenae J2 in cell culture plate with Pluronic F-127 gel

將3個小麥品種的根尖置于同一膠體后,觀察線蟲向根尖聚集的情況,2 h時,‘矮抗58’的根尖周圍有大量J2聚集,而‘華麥1號’和‘豫麥34’根尖周圍的線蟲聚集并不明顯;4 h時,‘矮抗58’聚集更為明顯,且線蟲更接近根部,同時‘華麥1號’和‘豫麥34’根尖周圍也出現(xiàn)了一定數(shù)量的2齡幼蟲;6 h時,3個品種的根尖周圍線蟲數(shù)量進一步增加,并且‘矮抗58’根尖周圍線蟲數(shù)量明顯多于其他2個品種(圖2)。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)板上3個小麥品種根尖對Pluronic F-127 膠體中禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的吸引Fig.2 Attraction of wheat root tips of 3 wheat cultivars to Heterodera avenae J2 in cell culture plate with Pluronic F-127 gel

為了定量分析不同抗感品種小麥根尖對線蟲的吸引能力,采用載玻片法觀察了低密度下的線蟲移動情況,與細(xì)胞培養(yǎng)板三維空間條件下觀察的結(jié)果相似,根尖放入前,線蟲隨機分布于膠體中;放入根尖時,有少量線蟲開始聚集在根尖周圍,2 h時各品種小麥根尖周圍均聚集了一定數(shù)量的J2(圖3)。統(tǒng)計分析顯示(圖4),0 h時,3個品種小麥根尖周圍線蟲較少,且數(shù)量基本一致,在8.3～9.0條之間;2 h時,各品種根尖周圍線蟲明顯增多,‘矮抗58’根尖聚集了34.0條J2,‘豫麥34’和‘華麥1號’分別為25.8條和22.8條,品種間J2數(shù)量無顯著差異(P<0.05);4 h和6 h各品種根尖聚集線蟲持續(xù)增多,但增幅變小,‘矮抗58’根尖周圍線蟲增加的數(shù)量及總量均大于其他兩個品種,4 h時矮抗58與‘華麥1號’、‘豫麥34’的J2數(shù)量差異顯著(P<0.05);6 h以后,各品種根尖周圍線蟲數(shù)量不再增加,最終‘矮抗58’根尖周圍聚集J2數(shù)量達到48.0條,豫麥34為39.0條,而‘華麥1號’為33.3條,‘華麥1號’與‘矮抗58’之間存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 三個小麥品種對Pluronic F-127膠體中禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲吸引數(shù)量的比較Fig.4 Comparison of Heterodera avenae J2 attracted by root tips of 3 wheat cultivars in Pluronic F-127 gel

2.2 線蟲對不同抗感小麥品種的侵染

通過室內(nèi)人工接種法觀察并比較不同品種根系內(nèi)禾谷孢囊線蟲J2的侵入及發(fā)育情況,從圖5可以看出,接種10 d后單株‘矮抗58’的根系內(nèi)侵入J2數(shù)量平均達83.7條,‘豫麥34’達56.7條,而‘華麥1號’僅有24.3條;20 d后各品種根系內(nèi)的線蟲數(shù)量明顯下降,‘矮抗58’為46.0條,‘豫麥34’為37.0條,而‘華麥1號’最少,為4.7條;30～40 d的根內(nèi)幼蟲及根系表面白雌蟲數(shù)量略有變化,但波動較小,至 50 d時,單株‘矮抗58’的根系表面白雌蟲有30.0個,‘豫麥34’有19.3個,而‘華麥1號’最少,僅有4.3個。雖然禾谷孢囊線蟲能夠侵入高抗品種‘華麥1號’,并且完成生活史,但侵入根內(nèi)的J2量及根系上的白雌蟲量要顯著低于‘豫麥34’和‘矮抗58’。

圖5 禾谷孢囊線蟲在不同抗感小麥品種根內(nèi)的群體密度變化Fig.5 Dynamics of population densities of Heterodera avenae in roots of wheat cultivars with different resistance levels

禾谷孢囊線蟲J2侵入‘華麥1號’根系并在根內(nèi)發(fā)育的過程,與感病品種‘豫麥34’和‘矮抗58’類似,侵入后的J2分布在根的輸導(dǎo)組織維管束周邊(圖6a),之后會有少量的J2能夠建立取食位點,并進一步發(fā)育為3齡幼蟲(圖6b)和 4齡幼蟲(圖6c),最后發(fā)育為白色雌成蟲,撐破根表皮露在根外(圖6d),老熟后變?yōu)楹稚吣摇?/p>

圖6 禾谷孢囊線蟲在‘華麥1號’根組織內(nèi)的發(fā)育Fig.6 Development of Heterodera avenae in the root of wheat cultivar ‘Huamai No.1’

3 討論

病原物一般具有向寄主方向移動或生長的能力,稱為趨性,即植物表面或組織周圍分泌的化學(xué)物質(zhì)對病原物的侵入具有刺激或誘發(fā)作用,如洋蔥和大蒜根部分泌物中的亞砜能刺激白腐小核菌(Sclerotiumcepivorum)的菌核萌發(fā)[12],大豆根部分泌的異黃酮能吸引大豆疫霉(Phytophthorasojae)[13]。植物寄生線蟲同樣具有類似的機制,有研究證實,線蟲的這種趨性現(xiàn)象可能歸因于CO2濃度梯度,根際周圍CO2分解會引起pH的變化,而低pH環(huán)境較易吸引線蟲的積聚[10,14-15]。本研究利用Pluronic F-127膠體觀察線蟲對抗/感不同品種的趨性試驗表明,禾谷孢囊線蟲J2對高抗品種‘華麥1號’、中感品種‘豫麥34’以及高感品種‘矮抗58’的根尖具有明顯的趨性,但對‘華麥1號’的趨性明顯弱于2個感病品種;3個品種的根尖競爭性試驗表明,高感品種能夠吸引大量線蟲,品種間具有明顯差異,推測可能與品種的根系分泌物有關(guān),而進一步深入研究造成這種差異的生理生化機理,可為今后開發(fā)有效的線蟲防治藥劑或策略提供一定的思路。

室內(nèi)接種試驗結(jié)果表明,禾谷孢囊線蟲的2齡幼蟲均能侵入抗感性不同的3個小麥品種,這一現(xiàn)象與大豆孢囊線蟲(Heteroderaglycines)侵入大豆抗性品種[16]以及根結(jié)線蟲侵染含Mi基因番茄[17-18]的過程較相似,表明抗性品種很大程度上是通過抑制侵入線蟲的發(fā)育來實現(xiàn)的。由于華麥1號對禾谷孢囊線蟲J2的吸引明顯弱于2個感病品種,可能導(dǎo)致了接種10 d時‘華麥1號’根系中的線蟲數(shù)量明顯少于2個感病品種,推測抗性品種通過早期抵抗線蟲侵入,從而減少線蟲對其自身的危害。在接種線蟲10 d到20 d的期間內(nèi),3個品種小麥根系中的線蟲數(shù)量均有減少,推測可能是由于大量線蟲同時侵入少量的根系中,空間與養(yǎng)分的競爭導(dǎo)致部分線蟲離開根系或者發(fā)育受到抑制。比較3個品種最終形成的白雌蟲量與侵入J2量的比值發(fā)現(xiàn),接種10 d時侵入‘華麥1號’根中的J2僅有17.8%成功建立了取食位點并完成了生活史,低于‘豫麥34’的34.1%和‘矮抗58’的35.8%,表明‘華麥1號’能抑制已侵入的J2在根系內(nèi)的發(fā)育,而‘華麥1號’參與抑制禾谷孢囊線蟲發(fā)育的生理生化因子需要進一步深入地研究。

此外,崔磊等[19]研究菲利普孢囊線蟲(Heteroderafilipjevi)與不同抗性小麥根的互作,揭示菲利普孢囊線蟲20 d時開始大量侵入,40 d左右達到最高峰,而本研究中的禾谷孢囊線蟲在10 d時已成功侵入小麥根系,兩種線蟲的侵入高峰期存在明顯差異,推測可能是由兩種線蟲的生物學(xué)特性以及小麥品種的抗性不同等因素造成的。近年來我國在禾谷孢囊線蟲的發(fā)生分布、生物學(xué)特性、抗性品種篩選及病害綜合防控等方面開展了大量的工作,進一步深入開展抗線蟲小麥品種的抗性機制研究,對今后制定更加有效的防控策略具有重要的意義。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Phenotype characterization of interaction between different wheat cultivars andHeteroderaavenae

Hu Xiaobin, Liang Xudong, Zhang Long, Chi Yuankai, Wang Xuan, Li Hongmei

(Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests,Ministry of Education, College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,China)

In order to understand the resistance mechanism of the wheat cultivar ‘Huamai No.1’ toHeteroderaavenae, the difference between the resistant cultivar ‘Huamai No.1’, susceptible cultivar ‘Yumai No.34’ and ‘Aikang No.58’ in root tips attracting second-stage juveniles (J2s) ofH.avenaewere compared using Pluronic F-127 gel as a medium. The infection and development of J2s in roots of the three cultivars were also observed through greenhouse inoculation test. The results showed that J2s ofH.avenaewere able to be attracted by the root tips of the three cultivars. The attraction ability of ‘Huamai No.1’ was stronger than that of ‘Aikang No.58’, with significant difference in the total number of J2s attracted at 4 h and 6 h after inoculation (P<0.05). Tissue staining revealed that J2s were capable to penetrate into the root system regardless of the cultivar resistance. However, the amounts of J2s that penetrated the root system and the white females produced in the root system of ‘Huamai No.1’ were significantly lower than those in ‘Yumai No.34’ and ‘Aikang No.58’. The study suggested that the resistance mechanism of ‘Huamai No.1’ might be decreasing the penetration of J2s and suppressing the nematode development in the root system.

Heteroderaavenae; resistance; attraction; infestation

2014-05-29

2014-08-05

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903040)

S 435.121

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.014

* 通信作者 E-mail:lihm@njau.edu.cn