劉曉璐，楊柳青，呂樂，郭濤，劉永智，趙鵬，董昕，閆海

1北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100083；

2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所,濟南250100

煙草根際固氮菌的篩選、鑒定及優(yōu)化培養(yǎng)

劉曉璐1，楊柳青1，呂樂1，郭濤2，劉永智1，趙鵬1，董昕1，閆海1

1北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100083；

2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所,濟南250100

對四川廣元煙草主產(chǎn)區(qū)三個種植基地的煙草根際固氮菌進行篩選，分離出28株具有固氮活性的菌株。 經(jīng)擴增rDNA 限制性酶切片段分析法(ARDRA)初步分類，共獲得5個操作分類單元(OTU)，并由16S rDNA序列進行了分析鑒定。結(jié)果表明不同分類單元分別是：蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和炭疽桿菌。優(yōu)化了N7菌株(巨大芽孢桿菌) 培養(yǎng)條件，確定其最佳碳源為蔗糖，最適宜初始pH值為7.5，最適溫度為30℃。

煙草；固氮菌；篩選；16s rDNA；優(yōu)化培養(yǎng)

氮是烤煙生長過程中最重要的營養(yǎng)元素之一，其供應(yīng)量的高低對烤煙生長以及產(chǎn)量質(zhì)量具有重要的影響[1]。在烤煙吸收的氮營養(yǎng)中，60%以上來自于土壤，肥料氮僅占總氮量的35%左右[2-3]，因此，提高土壤供氮量對烤煙獲得高產(chǎn)具有重要的實踐意義。為提高土壤供氮能力，部分學(xué)者提出了采用生物固氮菌來提高烤煙的固氮和供氮能力，并且取得了一定的研究成果。盧江平[4]和閻啟富[5]于1996年進行了生物固氮菌在烤煙上的應(yīng)用效果試驗，結(jié)果表明，生物固氮菌的應(yīng)用可以顯著提高烤煙產(chǎn)量和產(chǎn)值，特別是不施用氮肥處理，烤煙栽培經(jīng)濟效益提高顯著高于施用氮肥處理，證明生物固氮菌對促進烤煙生長具有良好的作用；王豹祥研究了不同菌種對烤煙養(yǎng)分吸收以產(chǎn)量質(zhì)量的影響規(guī)律，結(jié)果表明，固氮菌處理烤煙產(chǎn)量提高9.12%，產(chǎn)值提高30%以上，而化肥使用量降低了26%；羅紅燕[7]研究證明，VA菌根可以顯著促進烤煙生長，氮磷鉀養(yǎng)分利用率可以提高10%以上，植株干物質(zhì)積累量提高20%以上，土壤內(nèi)微生物數(shù)量提高幅度達到163.2%，土壤內(nèi)有效氮磷鉀提高12%以上，對提高烤煙經(jīng)濟效益具有重要的作用?？緹煿痰氖┯脤?dǎo)致烤煙產(chǎn)量升高的主要原因是固氮微生物可以較好的為烤煙提供氮素營養(yǎng)，促進烤煙對氮元素的吸收和利用[8]；在目前固氮菌的研究中，鮮有根際固氮菌及其固氮能力的報道[9]。本文研究了烤煙根系固氮菌的應(yīng)用與篩選，以期為該菌種的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤和菌種

土壤樣品取自四川省廣元市的煙草種植區(qū)，取樣地點為植煙時間10年以上，且煙草質(zhì)量、產(chǎn)量都較高的種植區(qū)。將取得的土壤樣本在生理鹽水中稀釋后涂布到Ashby無氮培養(yǎng)基平板上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d。取長勢良好的單克隆菌落，在Ashby 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)2 d，用接種針取菌劃線轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得固氮菌純化菌株，保存于-20℃。

1.2 培養(yǎng)基

Ashby培 養(yǎng) 基：KH2PO40.2 g，CaCO35 g，MgS04·7H20 0.20 g，甘露醇10 g，NaCl 0.2 g，瓊脂18 g，CaSO4·2H2O 0 .1 g，蒸餾水 1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨1 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 16S rDNA 鑒定

生工SK8255提取全基因組試劑盒提取篩選的固氮菌全基因組DNA。NANODROP2000（Thermo）檢測DNA的質(zhì)量和濃度并將DNA工作濃度調(diào)至100-200 ng/μL。 采 用 Biometra擴 增 儀(Thermo,USA)PCR擴增。擴增體系：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，58℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；再延伸10min。PCR反應(yīng)總體系為20μL，其中ddH2O 6.4μL，DMSO 0.6μL，2×Pfu Master Mix 10μL，Primer F(27F) 1μL，Primer R(1492R) 1μL，DNA模板1μL。取20μL PCR產(chǎn)物，在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上100V 電泳20 min后，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。目標條帶應(yīng)用天根DP209瓊脂糖凝膠回收試劑盒切膠回收，取2μL膠回收產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.4 ARDRA分析

分別用限制性內(nèi)切酶AluI和HaeⅢ對PCR 產(chǎn)物進行ARDRA多態(tài)性分析。反應(yīng)體系：模板：擴增產(chǎn)物 10μL，內(nèi)切酶：2μL，0 .1% BSA ：2μL，加水至20μL，反應(yīng)混合物置37℃ 水浴酶切12 h，加2μL Loading Buffer終止反應(yīng)。

取4μL膠回收產(chǎn)物與pEASY zero blunt vector在25℃下連接15 min，并轉(zhuǎn)化到Trans T1感受態(tài)細胞中，加200μL無抗LB搖1 h，取200μL菌液涂于加有氨芐青霉素的LB板上。培養(yǎng)12-16 h，挑單克隆菌落進行菌落PCR檢測。將克隆成功菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

將測序序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.him.nih.gov/blast/Blast.ci) 中同源序列進行同源性分析，應(yīng)用MEGA3.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 優(yōu)化培養(yǎng)

將N7菌株（巨大芽孢桿菌），在250 mL三角瓶中震蕩培養(yǎng)，選擇葡萄糖、甲醇、蔗糖、乙醇和甘油5種含碳有機物作為測試碳源。按照總有機碳為8.0 g/L的量分別加入[9]。

設(shè)置5.50、6.00、6.50、7.00、7.50和8.00的不同初始pH值，25℃、30℃、35℃和40℃的不同培養(yǎng)溫度單因素培養(yǎng)條件。震蕩培養(yǎng)N7菌株48 h后，取樣，722S型分光光度計測定680 nm光密度。

1.6 試驗用根際土壤信息

四川省廣元市長期種植煙草的3份土壤的基本信息如表1。

表1 本研究所用根際土壤的基本信息Tab.1 Information on tested tobacco rhizosphere

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA PCR擴增

對28株固氮菌，利用細菌16S rDNA通用引物27F和1492R對固氮菌基因組DNA進行擴增，得到一條1500 bp左右的特異性條帶，擴增產(chǎn)物無拖帶現(xiàn)象。圖1為部分菌株的16S rDNA電泳圖。

圖1 供試菌株16S rDNA片段PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplicons of 16S rDNA fragment of tested strains

2.2 ARDRA分析

實驗發(fā)現(xiàn)AluI的多態(tài)性較好，最終以AluI的分類結(jié)果為標準，以每1個16S rDNA 限制片斷長度多態(tài)性類型代表了一個操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU),共得到5 種OTU(圖2)，不同OTU對應(yīng)菌株數(shù)量如下。OTU1：14株；OTU2：5 株；OTU3：7 株；OTU4 1 株；OTU5 1 株。

圖2 ARDRA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ARDRA

將ARDAR 結(jié)果構(gòu)建樹狀聚類圖(圖3)，并分別從OTU1中選取5個固氮菌株，OTU2中選取2個固氮菌株，OTU3中選取3個固氮菌株，OTU4中選取1個固氮菌株，OTU5中選取1個固氮菌株，共12株固氮菌，命名為N1-N12進行后續(xù)試驗。

圖3 ARDRA聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of ARDRA

2.3 16S rDNA序列同源性及遺傳進化分析

將獲得的測序結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站Blast檢索，在Clustal-x程序中進行多重序列匹配排列(Multiple Alignments)分析，再用Mega3.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。從測序結(jié)果和圖2中可以看出，⑴ N1的16S序列與Bacillus thuringiensis相似性為99%，推斷該菌株是蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）；⑵ N2、N5、N6、N9、N10的16S序列與Bacillus subtilis相似性達到98%，推斷這些菌株應(yīng)屬枯草芽孢桿菌（B.subtilis）；⑶N4、N8、N12的16S序列與Bacillus methylotrophicus相似性為99%，推斷這些菌株是甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）；⑷ N7的16S序列與Bacillus megaterium相似性達到98%，推斷該菌株是巨大芽孢桿菌（B.megaterium）；⑸ N3、N11的16S序列與Bacillus anthracis相似性達到97%，推斷這兩個菌株應(yīng)為炭疽桿菌（B.anthracis）。

圖4 根據(jù)16S rDNA序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on analysis of 16S rDNA sequences of cellulose-degrading isolates

2.5 優(yōu)化培養(yǎng)結(jié)果

圖5 不同碳源對N7生長的效應(yīng)Fig.5 Effects of different carbon sources on growth of N7

圖5顯示，N7可利用的碳源較廣泛，除甲醇和乙醇效果稍差外，葡萄糖、蔗糖、甘油均為較好的碳源被N7利用，且以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基生長量最高。

圖6 不同溫度和初始pH值和對N7生長的效應(yīng)Fig.6 Effects of different initial pH values and temperatures on growth of N7

初始pH值和培養(yǎng)溫度的單因素實驗結(jié)果表明(圖6)，N7在初始pH值6.5-7.5均能生長，快速生長的最優(yōu)初始pH值為7.50。N7菌株的培養(yǎng)溫度在25-40℃范圍內(nèi)均可生長，30℃是培養(yǎng)N7的最佳溫度。

3 結(jié)論與討論

自生固氮菌是一類生活在土壤有機質(zhì)中促進植物生長的根際細菌[12]。本試驗篩選出的固氮菌都屬于自生固氮菌，均為桿菌。蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌都是具有固氮功能的細菌。

N7的16S序列與Bacillus megaterium相似性達到98%，可推斷這個菌株是巨大芽孢桿菌。巨大芽孢桿菌是一種益生菌，在20世紀40年代，巨大芽孢桿菌就已進行實驗研究，學(xué)者Sundar、Molla以及Ellott等發(fā)現(xiàn)以巨大芽孢桿菌為核心制成混合菌劑，可降解難以溶解的含磷化合物[13-15]。1958年Hin在日本首次分離得一株具有高固氮活性的巨大芽孢桿菌，相對于生物肥料來說，巨大芽孢桿菌具有自身獨特的優(yōu)良特點，其生存能力及適應(yīng)能力較強，對于在非人工氮素供應(yīng)上這類菌株將起著十分重要的作用[16-17]。巨大芽孢桿菌不僅具有高效降解煙草中亞硝酸鹽的功能[18]，更有研究表明由巨大芽孢桿菌制成的微生物制劑噴灑在煙草葉片上，能有效的提高葉片的香味，并且降低蛋白質(zhì)含量，對煙草的品質(zhì)有很大提高[19]。并且巨大芽孢桿菌與節(jié)桿菌雙菌種共同作用能有效提高廢次煙葉的綜合利用和煙草薄片質(zhì)量，這對煙草企業(yè)有巨大的經(jīng)濟意義[20]。

N2、N5、N6、N9、N10的16S序列與Bacillus subtilis相似性達到98%，由此可推斷這幾個菌株是枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌是一種益生菌，不僅能夠提高植物種子的發(fā)芽率，更具有固氮活性[21]。目前有研究表明，枯草芽孢桿菌是一種內(nèi)生固氮菌，定殖在宿主植物體內(nèi)，直接分泌固氮產(chǎn)物給植物吸收，不易受到外界環(huán)境條件的干擾，更有利于充分發(fā)揮固氮效能，表現(xiàn)出更高的固氮效率[22]。在甘蔗內(nèi)生固氮菌的研究中，證實了枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的高效固氮活性[23]。English等研究顯示，煙葉分別或混合接種枯草芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌后，能迅速產(chǎn)生一種令人愉悅的香氣[24]。并且研究表明利用枯草芽孢桿菌還可以高效防治煙草青枯病[25]。

N1的16S序列與Bacillus thuringiensis相似性達到99%，由此可推斷該菌為蘇云金芽孢桿菌。蘇云金芽孢桿菌不僅常用作微生物殺蟲劑，也具有高效固氮功能。N4、N8、N12的16S序列與Bacillus methylotrophicus相似性達到99%，由此可推斷這幾個菌是甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，具有高效固氮功能。但是目前對蘇云金芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的固氮功能研究相對較少，這兩個菌種的固氮活性需要做進一步的研究。ARDRA的分析結(jié)果大致一致，證實了我們分類的正確性。

本試驗對巨大芽孢桿菌的適宜培養(yǎng)條件、最適pH值等進行了研究。把蔗糖作為N7的最優(yōu)碳源進行下一步的研究。與蔗糖相比，葡萄糖屬于單糖，一般較容易被細菌利用，但在其代謝過程中產(chǎn)酸速度較快，從而使得培養(yǎng)基pH值快速降低，這可能是導(dǎo)致其生長量較蔗糖低的主要原因[9]。N7快速生長的最優(yōu)初始pH值為7.50，菌株在中性或偏堿性的條件下生長好，這與文獻報道的植物生長促生菌的適宜培養(yǎng)條件一致[26-29]。在溫度優(yōu)化培養(yǎng)中，N7的最適生長溫度是30℃，可能是由于較低的溫度（25℃），菌體新陳代謝較慢，導(dǎo)致菌生長和分裂速度受影響；較高的溫度（40℃），由于該溫度超過了菌體內(nèi)酶的最適溫度，使得其催化效率有所下降，從而影響了細菌的生長。

[1]王鵬，張吉立，李洋，等.大豆餅肥對烤煙氮積累及煙葉產(chǎn)值的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2012,5:143-146.

[2]蘇帆,付利波,陳華,等.應(yīng)用15N研究烤煙對餅肥氮素的吸收利用規(guī)律[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008,2:335-339.

[3]習(xí)向銀，趙正雄，李春儉.肥料氮和土壤氮對烤煙氮素吸收和煙堿合成的影響[J].土壤學(xué)報，2008,4:750-753.

[4]盧江平，李安源.生物固氮菌在烤煙上的應(yīng)用[J].煙草科技，1996（5）:32-36.

[5]閻啟富.共生性固氮菌在山地烤煙上的應(yīng)用[J].煙草科技，1997（4）:12-15.

[6]王豹祥，李富欣，張朝輝，等.應(yīng)用PGPR菌肥減少烤煙生產(chǎn)化肥的施用量[J].土壤學(xué)報，2011,4:813-822.

[7]羅紅燕.VA菌根真菌對烤煙生長及根際土壤微生態(tài)環(huán)境的影響[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002:17-26.

[8]唐鳳灶.安徽銅陵銅尾礦原生演替過程中的土壤固氮菌研究[D].廣州:中山大學(xué),2010:1-58.

[9]姚拓,張德罡,胡自治.高寒地區(qū)燕麥根際聯(lián)合固氮菌研究[J].草木學(xué)報,2004,2(13):106-110.

[10]謝光輝,蘇寶林,崔宗均.長江流域水稻根際芽孢桿菌屬固氮菌株的分離和鑒定[J].微生物學(xué)報,1998,38(6):480-483.

[11]尤崇杓.水稻根際聯(lián)合固氮菌[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1990:329-335.

[12]Glick B R.The enhancement of plant growth by free-living bacteria.Can[J].J Microbiol,1995,41:109-117.

[13]Sundar O,Racand W B,Sinha MK.Phosphate dissolving microorganisms in the rhizosphere and soil[J].India Agric Sci,1963,33(4):272-278.

[14]Molla MZ,Chowdhury MA.Microbial mineralization of organic phosphate in soil[J].Plant and Soil,1984,78(1):393-399.

[15]Ellott JM,Mathre DE,Sands DC.Identification and characterization of rhizosphere competent bacteria of wheat[J].Appl Environ Microbiol,1987,53(2):2793-2799.

[16]覃小紅.固氮巨大芽孢桿菌在桉樹栽培上的應(yīng)用初探[D].廣西:廣西大學(xué),2013:1-6.

[17]Javier V,María I.García-Sánchez,et a1.Purification and characterization of ferredoxin-nitrite reductase from the eukaryotic microalga Monoraphidium braunii [J].Plant Physiol Biochem,2002,40:401-405.

[18]楊艷.巨大芽孢桿菌產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的研究[D].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2007:1-40.

[19]汪長國,戴亞,朱立軍,等.采收前葉面噴施微生物制劑改善煙葉品質(zhì)試驗[J].煙草科技,2006,4:31-34.

[20]艾繼濤.雙菌種發(fā)酵提高煙草薄片和廢次煙葉品質(zhì)研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2006:1-53.

[21]振粉.牧草內(nèi)生枯草芽孢桿菌的功能多樣性及其16S rDNA鑒定[D].甘肅:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2010:1-59.

[22]丁國春,付鵬,李紅梅.枯草芽孢桿菌AR11菌株對南方根結(jié)線蟲的生物防治[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,28(2):46-49.

[23]周發(fā)俊.甘蔗內(nèi)生固氮菌的分離鑒定及16SrRNA基因克隆和序列分析[D].福建:福建師范大學(xué),2009:1-52.

[24]English CF，Bell EJ，Berger AJ.Isolation of thermophiles from broadleaf tobacco and effect of pure culture inoculation on cigar aroma and mildness[J].Appl Microbio,1967,15:117-119．

[25]易有金,羅坤,羅寬,等.內(nèi)生枯草芽孢桿菌B-001菌株內(nèi)生定殖研究及生物學(xué)特性[J].核農(nóng)學(xué)報,2007,21(4):349-352.

[26]張高峽,盧振祖.作物根際聯(lián)合固氮芽孢桿菌的分離鑒定及生態(tài)分布[J].氨基酸和生物資源,1998,20(1):12-15.

[27]劉榮昌,李鳳汀.小麥接種聯(lián)合固氮菌增產(chǎn)效果研究[J].華北農(nóng)學(xué)報,1989,4(3):74-84.

[28]李永興,王繼文,李久蒂.玉米根際聯(lián)合固氮菌的基本特性的研究[J].微生物學(xué)報,1993,33(6):151-158.

[29]方敦煌,趙玉虎,沐應(yīng)祥.拮抗菌株GPl3的基本生物學(xué)特性的研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,24(4):359-361.

Screening,identi fi cation and culture optimization of nitrogen- fi xing bacteria in tobacco rhizosphere

LIU Xiaolu1,YANG Liuqing1，LYU Le1，GUO Tao2,LIU Yongzhi1，ZHAO Peng1，DONG Xin1,YAN Hai1
1 School of Chemistry and Biological Engineering,Beijing University of Science and Technology,Beijing 100083,China;
2 Shandong Rice Research Institute,Shandong Academy of Agriculture Science,Jinan 250100,China

Twenty-eight diazotrophs were isolated from rhizosphere soil samples from Guangyuan tobacco growing area,Sichuan province.These diazotrophs were isolated by using free nitrogen medium.Ampli fi ed rDNA restriction analysis（ARDRA）showed that all strains isolated could be classified into 5 Operational Taxonomic Units(OUT).Different OUTs was identified by 16S rDNA sequencing,and those were identi fi ed as Bacillus:Bacillus thuringiensis; Bacillus subtilis; Bacillus methylotrophicus; Bacillus megateriumandBacillus anthracis.The batch culture conditions of isolate N7(Bacillus megaterium) were optimized via adjusting carbon sources,temperature and pH values.It was found that the best carbon source is sucrose,while the best initial pH value 7.5,and the best temperature 30℃.

tobacco; nitrogen- fi xing bacteria; screening; 16S rDNA; optimized culture

劉曉璐，楊柳青，呂樂，等.煙草根際固氮菌的篩選、鑒定及優(yōu)化培養(yǎng)[J].中國煙草學(xué)報，2015,21（1）

北京高等學(xué)校青年英才計劃項目(No.YETP0394)

劉曉璐（1983—），博士，副教授，主要研究方向為功能基因組學(xué)、資源與應(yīng)用微生物學(xué)，Email:xiaoluliu@ustb.edu.cn

閆海（1962—），博士，教授，主要研究方向為環(huán)境微生物學(xué)，Email:haiyan@ustb.edu.cn

2014-10-12

:Liu Χiaolu，Yang Liuqing，Lyu Le,et al.Screening,identification and culture optimization of nitrogen-fixing bacteria in tobacco rhizosphere [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(1)