劉勇，宋中邦，童治軍，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家煙草基因工程研究中心 昆明,650021

生物技術(shù)

煙草PVY隱性抗病基因的分子標(biāo)記及其適用性

劉勇，宋中邦，童治軍，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家煙草基因工程研究中心 昆明,650021

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是危害煙草的重要病害，種植抗病品種是經(jīng)濟(jì)有效的防治措施。分子標(biāo)記輔助選擇可提高抗病育種效率。來源于Χ-射線誘變的Virgin A Mutante(VAM)的隱性抗PVY基因位點(diǎn)（va）被廣泛應(yīng)用于煙草抗病育種。為了提高va位點(diǎn)的育種利用效率，根據(jù)煙草隱性抗PVY基因（感病基因）eIF4E-1基因序列，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增的引物CF2GR11,開發(fā)eIF4E-1基因的分子標(biāo)記,并檢測了該標(biāo)記與抗性的遺傳距離和在常見煙草資源中的適用性。CF2GR11在云煙87、紅花大金元和K326等感PVY品種可擴(kuò)增出500 bp產(chǎn)物，在NC102、NC55和K326PVY等抗病品種無擴(kuò)增條帶。以抗、感PVY親本構(gòu)建的101個F2單株為定位群體，遺傳連鎖分析表明，CF2GR11標(biāo)記與煙草PVY感病基因的遺傳距離為0.99 cM。對46份PVY抗性明確的栽培煙草資源的檢測表明，供試資源的標(biāo)記檢測結(jié)果與抗性的吻合度為100%，表明CF2GR11標(biāo)記適用性高。該目的基因標(biāo)記可用于抗PVY育種的輔助選擇和抗PVY資源的鑒定。

煙草；馬鈴薯Y病毒；抗性；分子標(biāo)記

煙草馬鈴薯 Y病毒病，又稱為脈斑病，是由馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)引起的蚜傳病毒病，在中國北方煙區(qū)危害嚴(yán)重，在南方煙區(qū)的危害呈上升趨勢[1-3]。缺乏抗病主栽煙草品種是導(dǎo)致PVY危害嚴(yán)重的主要原因之一[4]。為選育抗病煙草品種，國內(nèi)外鑒定出多個抗PVY的種質(zhì)資源，如VAM（TI1406）、V.SCR等，并育成抗病白肋煙品種TN86、TN90和烤煙品種NC55、NC102等，并對幾個抗源的抗性遺傳特性、抗性相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行了研究[5-7]。大部分PVY抗源的抗性表現(xiàn)為隱性基因位點(diǎn)（va）控制。與PVY抗性相關(guān)的分子標(biāo)記，如Randomly Ampli fi ed Polymorphic DNA(RAPD)和Sequence Characterized Ampli fi ed Region(SCAR)標(biāo)記也有報道[8-10]。現(xiàn)有分子標(biāo)記與抗性的遺傳距離相對較遠(yuǎn)。Noguchis等[8](1999)認(rèn)為va基因型煙草植株的抗性是由于對PVY感病的基因片段的缺失造成的，Chikara等[11](1999)認(rèn)為VAM的抗性機(jī)理為抑制病毒粒子細(xì)胞間移動和胞內(nèi)復(fù)制。云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院克隆了va基因位點(diǎn)的一個隱性抗PVY基因eIF4E-1（待發(fā)表），也就是感PVY基因,該基因?qū)儆谡婧松锓g起始因子（Eucaryotic initiation factor，簡寫為eIF）的一種類型。利用該抗病基因序列開發(fā)緊密連鎖的特異分子標(biāo)記，可為抗病育種提供新的標(biāo)記。本文根據(jù)煙草eIF4E-1基因及其家族基因的序列信息，開發(fā)出一個新的與PVY抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，并檢驗(yàn)了該標(biāo)記在部分品種和種質(zhì)資源中的適用性。

1 材料和方法

1.1 植物材料

抗PVY烤煙種質(zhì)NC55和感PVY烤煙種質(zhì)Coker176為云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存。以抗病親本（PR）和感病親本（Ps）雜交得到的F2群體，用于分子標(biāo)記與抗性的遺傳距離分析。該群體的抗性數(shù)據(jù)和SCAR標(biāo)記分型數(shù)據(jù)來源于文獻(xiàn)[10]。驗(yàn)證標(biāo)記適用性的煙草資源，包括常用烤煙品種見表2，PVY抗性根據(jù)文獻(xiàn)確定，為云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存。

1.2 抗性鑒定

PVY壞死株系分離物ZT-5由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院分離，在防蟲網(wǎng)室內(nèi)的煙草種質(zhì)Samsun NN繁殖備用。防蟲塑料大棚內(nèi)常規(guī)方法漂浮育苗，煙苗第1次剪葉后（播種后40～45 d）移栽至直徑20 cm的花盆，成活后采用高壓噴槍摩擦接種[12]，接種濃度為病葉汁液稀釋200倍。煙苗接種后，每7 d左右調(diào)查發(fā)病情況，連續(xù)調(diào)查3次，記載單株是否表現(xiàn)PVY癥狀。挑選抗性明確的單株用于基因型分型?？剐詣澐謽?biāo)準(zhǔn)為：3次調(diào)查均無癥狀，劃分為抗??；第1次或第2次調(diào)查表現(xiàn)PVY癥狀，劃分為感病。

1.3 煙草總DNA 的提取與質(zhì)量檢測

取煙草新鮮嫩葉，-80℃保存。F2群體樣品采用CTAB法[13]提取煙草總基因組DNA。種質(zhì)資源樣品采用QIAGEN DNeasy Plant Mini試劑盒提取煙草總基因組DNA。采用紫外分光光度法（Nanodrop）和瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測DNA質(zhì)量，去掉DNA濃度低于8 ng/μL的樣品。質(zhì)量合格的DNA樣品，用0.5×TE溶液稀釋至30～50 ng/μL，保存?zhèn)溆?。采用擴(kuò)增煙草內(nèi)參基因Actin檢測DNA是否可用于PCR擴(kuò)增。淘汰Actin基因擴(kuò)增陰性的單株DNA。挑選Actin基因擴(kuò)增陽性的單株DNA用于CF2GR11引物擴(kuò)增。

1.4 標(biāo)記引物設(shè)計(jì)

根據(jù)煙草eIF4E-1基因序列和eIF4E家族成員的序列，設(shè)計(jì)特異引物對CF2：5’-TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT -3’，GR11：5’-GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3’； 擴(kuò)增片段大小為446bp，退火溫度51℃。CF2GR3擴(kuò)增片段大小為1800bp，退火溫度55℃。擴(kuò)增煙草內(nèi)參基因Actin的特異引物為Actin-F:5′-AAGGGATGCGAGGATGGA-3′,Actin-R 5′-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3′，擴(kuò)增片段大小為160bp，退火溫度58℃。引物由大連寶生物公司合成。

1.5 PCR 擴(kuò)增和電泳檢測

PCR 反應(yīng)體系總體積均為20μL，其中30～50 ng/μL DNA 樣品 2.5μL、10×PCR buffer 2.0μL，dNTPs 1.2μL，引 物 各 1.5μL，rTaq DNA 酶 0.3μL，ddH2O 12.6μL。所用試劑購自寶生物公司。PCR反應(yīng)在Ependorff梯度擴(kuò)增儀上(Master Cycler )上進(jìn)行。擴(kuò)增的程序?yàn)椋?）94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min，共28個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存；采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

PCR擴(kuò)增的帶型統(tǒng)計(jì)方法參考文獻(xiàn)[14，15]。對首次CF2GR11擴(kuò)增結(jié)果顯示為交換單株的樣品，則重復(fù)擴(kuò)增1-2次，以驗(yàn)證交換單株的結(jié)果。保留2-3次擴(kuò)增中有兩次結(jié)果一致的樣品數(shù)據(jù)，用于標(biāo)記的遺傳距離計(jì)算?？ǚ綑z驗(yàn)采用SPSS 12.0 軟件。遺傳圖距(D)的計(jì)算方法為：(1)計(jì)算交換值，交換值(r)=(交換配子數(shù)/總配子數(shù))×100%；(2) 根據(jù)Kosambi 函數(shù)計(jì)算遺傳圖距[16](D，單位cM)，D=0.25×ln((1+2r)/(1-2r))×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選分子標(biāo)記的確定

根據(jù)eIF4E-1的基因組序列和eIF4E家族成員的序列，設(shè)計(jì)特異引物CF2GR11和CF2GR3。檢測已知抗性的煙草材料的基因組DNA，驗(yàn)證抗性是否與eIF4E-1的目標(biāo)片段吻合。結(jié)果表明：感病品種K326、云煙87和紅花大金元的eIF4E-1目標(biāo)片段檢測為陽性，而抗病品種NC102、NC55、K326PVY的eIF4E-1目標(biāo)片段檢測為陰性（圖1）。6個品種對PVY的抗性與CF2GR11的PCR檢測結(jié)果吻合。引物CF2GR3在感病品種云煙87中多次擴(kuò)增結(jié)果為陰性（未列出數(shù)據(jù)）。因此，將CF2GR11特異擴(kuò)增的eIF4E-1基因片段作為候選分子標(biāo)記，用于在抗性分離群體中驗(yàn)證。

圖1 引物CF2GR11在抗感品種間的多態(tài)性Fig.1 Polymorphism of primer CF2GR11 among resistance cultivars and susceptible cultivars

2.2 標(biāo)記與抗性的遺傳距離分析

對抗病品種NC55與感病品種Coker176配制的F2群體進(jìn)行抗性鑒定與基因分型。前期結(jié)果表明，該群體苗期接種后21 d的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在309個單株中，感病株和抗病株的實(shí)際比例為230:79，理論分離比為232:77?？ǚ綑z驗(yàn)表明該群體代的實(shí)測分離值與理論分離值無顯著差異性（P=0.8696）[10]。根據(jù)DNA的濃度與內(nèi)參Actin基因的擴(kuò)增結(jié)果，挑選出42份感病單株DNA和59份抗病單株DNA，用于CF2GR11基因分型。對感病單株第1次擴(kuò)增陰性的樣品，重復(fù)擴(kuò)增1次。將2次擴(kuò)增結(jié)果一致的樣品數(shù)據(jù)作為有效數(shù)據(jù)，用于遺傳距離分析。獲得F2代遺傳群體101個單株的CF2GR11擴(kuò)增的有效數(shù)據(jù)（表1）。利用3.6中的公式計(jì)算重組率及遺傳距離,結(jié)果表明標(biāo)記CF2GR11與PVY感病性的遺傳距離為0.99 cM(圖 2 )。

表1 標(biāo)記與抗性在F2群體中的獨(dú)立性檢驗(yàn)Tab.1 Independence test between marker and resistance in the F2 population

圖2 基于CF2GR11標(biāo)記的Va基因位點(diǎn)的遺傳連鎖圖（cM)Fig.2 Genetic linkage map of Va locus based on SCAR markers（cM)

2.3 標(biāo)記在抗感PVY煙草資源中的適用性

根據(jù)文獻(xiàn)挑選對PVY抗性明確的栽培煙草資源46份，檢測CF2GR11標(biāo)記的適用性。結(jié)果表明（表2）。NC102、NC55和TN86等9個抗病品種的標(biāo)記檢測為陰性。云煙87和K326等37個感病品種的CF2GR11的標(biāo)記檢測為陽性，供試品種的標(biāo)記檢測與抗性的吻合度為100%。表明CF2GR11標(biāo)記在供試煙草資源中的適用性高，可用于轉(zhuǎn)育va基因位點(diǎn)抗性的輔助選擇。

表2 CF2GR11標(biāo)記檢測與PVY抗性比較Tab.2 CF2GR11 marker detection compared to PVY resistance of germplasm

續(xù)表2

3 討論

3.1 基于eIF4E-1基因的標(biāo)記設(shè)計(jì)

前期研究表明eIF4E-1缺失可賦予煙草對PVY的抗性。栽培煙草為異源四倍體，eIF4E-1的家族成員較多，序列相似率高。設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增與PVY抗性相關(guān)的eIF4E-1分子標(biāo)記難度較大。eIF4E-1的基因組大小約5.3kb。本文通過在eIF4E-1基因的第1個外顯子內(nèi)設(shè)計(jì)上游引物，在內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)下游引物，獲得在抗病品種中無擴(kuò)增條帶，而在感病品種中有特異條帶的引物對。

3.2 與PVY抗性連鎖的分子標(biāo)記

Noguchi等[8]對只在PVY抗性上有差異的近等基因系（PVY抗性來源于Perevi）及其F2代進(jìn)行RAPD分析，找到10個與Va連鎖的RAPD標(biāo)記，這些標(biāo)記在8個感病品種中都存在，至少有1個標(biāo)記在8個抗病品種中不存在。Tajima等[14]將這些RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為STS標(biāo)記，成功用于回交后代的育種選擇。Julio等[9]（2006）將PVY抗性相關(guān)的AFLP標(biāo)記，轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，找到與TN86中va的等位基因Va連鎖標(biāo)記PVYME1（遺傳距離為5.1cM)。王貴等[10]檢測了PVY抗源NC55中RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記的存在情況，獲得了兩個與NC55的PVY抗病對應(yīng)的等位基因Va連鎖的標(biāo)記O12V3695和PVYME1，與Va的遺傳距離分別為2.10 cM和2.52Cm。上述分子標(biāo)記都是通過抗性分離群體的大量差異標(biāo)記分型獲得的。標(biāo)記與抗性的連鎖距離相對較遠(yuǎn)。本文根據(jù)煙草資源NC55等的隱性抗病基因的序列開發(fā)分子標(biāo)記CF2GR11，該標(biāo)記與抗性緊密連鎖，遺傳距離為0.99cM。

3.3 CF2GR11標(biāo)記在PVY抗源類型劃分中的潛力

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，煙草抗PVY的抗源主要有兩大類：一類是以VAM為代表的隱性基因位點(diǎn)(va)控制的抗性，包括Perevi、Kerti No.1、PBD6、Wislica、NC744、NC745、TN86、TN90等種質(zhì)[8-9]。另一類是以野生種N.africana為代表的對PVY免疫的抗性，包括N.africana的衍生種質(zhì)NC152、K326/Naf等[17]。目前育種利用的抗源主要為va基因位點(diǎn)。Acosta-Leal等[18]提出VAM對PVYN的抗性由兩對隱性基因va1和va2控制，va1限制病毒細(xì)胞間運(yùn)動和阻斷病毒進(jìn)入維管束，va2抑制病毒細(xì)胞內(nèi)積累。利用本文的CF2GR11可初步劃分煙草PVY抗性的類型。表型鑒定為抗PVY的資源，若CF2GR11標(biāo)記陰性，則表明該資源的PVY抗性與eIF4E-1基因缺失有關(guān),屬于隱性基因位點(diǎn)(va)控制的抗性；若CF2GR11標(biāo)記陽性，則表明該資源的PVY抗性與eIF4E-1基因缺失無關(guān)，屬于eIF4E-1基因突變或其他抗病機(jī)制。通過簡單快速的標(biāo)記劃分抗性類型，有助于發(fā)現(xiàn)新的煙草PVY抗源。

3.3 CF2GR11標(biāo)記的適用性

栽培煙草的基因組約4.5G,具有巨大而且復(fù)雜等特點(diǎn)。根據(jù)少數(shù)品種驗(yàn)證的分子標(biāo)記，在多大范圍內(nèi)的種質(zhì)資源適用，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本文結(jié)果表明，CF2GR11標(biāo)記在供試46個品種資源中都適用，包括常見va基因座的抗病資源與常見煙草品種?？衫迷摌?biāo)記輔助選擇eIF4E-1基因介導(dǎo)的PVY抗性。

3.4 結(jié)論

根據(jù)煙草抗PVY的隱性基因開發(fā)的分子標(biāo)記未見其他文獻(xiàn)報道，CF2GR11標(biāo)記與va基因位點(diǎn)控制的抗性緊密連鎖，檢測的穩(wěn)定性高，在常見煙草種質(zhì)資源中的適用性高。在抗PVY育種的輔助選擇和抗病資源鑒定中具有較大的應(yīng)用前景。

致謝：感謝楊華兵協(xié)助完成遺傳群體抗性鑒定、黃昌軍博士提供數(shù)據(jù)分析支持。

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Molecular marker from recessive gene resistant to potato virus Y of tobacco and its suitability

LIU Yong,SONG Zhongbang,TONG Zhijun,LI Yongping
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences,Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding,National Tobacco Genetic Engineering Research Center,Kunming,650021,China

Potato virus Y(PVY) is a serious tobacco disease.Molecular marker-assisted selection could improve breeding efficiency.A gene locusvaof Virgin A Mutante(VAM) induced by Χ-ray irradiation is widely used in tobacco breeding.In order to improve va locus breeding utilization ef fi ciency,speci fi c ampli fi cation primer CF2GR11 was developed based on recessive resistance gene eIF4E-1(susceptible gene) to tobacco PVY,and genetic distance between CF2GR11 and resistance gene,as well as its suitability of CF2GR11 in tobacco germplasm were evaluated.In PVY susceptible varieties Yunyan87,Honghuadajinyuan and K326,CF2GR11 can produce a 446bp product as ampli fi er,while no product in PVY resistant varieties NC102,NC55 and K326PVY.Genetic linkage analysis of F2 population from PVY resistant and susceptible parents as locus point showed that genetic distance between CF2GR11 marker and resistance gene was 0.99cM.CF2GR11 proved suitable in 46 tested tobacco germplasm.This target gene marker could be used as an assisted selection tool for PVY resistant variety breeding and germplasm identi fi cation.

tobacco; potato virus Y; resistance; molecular marker

劉勇，宋中邦，童治軍，等.煙草PVY隱性抗病基因的分子標(biāo)記及其適用性[J].中國煙草學(xué)報，2015,21（1）

中國煙草總公司云南省公司科技項(xiàng)目（2012YN02）；中國煙草總公司科技項(xiàng)目（110201301010）

劉勇（1970—），博士，副研究員，主要從事煙草病害防治與抗病育種研究，Tel：0871-65106352，Email:yliu@yntsti.com

李永平（1966—），碩士，研究員，主要從事煙草育種研究，Email:liyongping@yntsti.com

2014-03-28

:LIU Yong,SONG Zhongbang,TONG Zhijun,et al.Molecular marker from recessive gene resistant to potato virus Y of tobacco and its suitability [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(1)