蔡劉體，劉艷霞，孟琳，羅正友，石俊雄

貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550081

煙草青枯菌FQY_4基因組中原噬菌體生物信息學(xué)分析

蔡劉體，劉艷霞，孟琳，羅正友，石俊雄

貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550081

為了解青枯菌（ralstonia solanacearum）基因組中原噬菌體和噬菌體元件的信息，在煙草青枯菌FQY_4全基因組序列的基礎(chǔ)上，分析了FQY_4染色體上的原噬菌體，結(jié)果顯示FQY_4染色體上有1個具有完整噬菌體特征的原噬菌體，3個噬菌體元件。比較青枯菌GMI1000和FQY_4中的原噬菌體的序列信息，結(jié)果顯示它們具有一定的相似性，其中青枯菌FQY_4的原噬菌體-2與噬菌體?RSA1的相似度為82%，它們有40個編碼基因高度同源，相似度為99%以上。這些信息可為青枯菌原噬菌體的多樣性分析，噬菌體和青枯菌的協(xié)同進化研究奠定基礎(chǔ)。

煙草；青枯?。磺嗫菥?；基因組；原噬菌體

噬菌體(bacteriophage,phage)是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，噬菌體無處不在，只要有細菌存在的地方就可能有噬菌體的身影，在土壤中可找到大量細菌的噬菌體[1-2]。幾乎所有的細菌都可能被噬菌體侵蝕[3]，包括引起農(nóng)作物細菌性病害的土傳性病原菌[4-5]，已報道的能侵蝕青枯菌的噬菌體有短尾噬菌體科、肌尾噬菌體科和絲狀噬菌體[9]。由于協(xié)同進化和競爭關(guān)系，事實上噬菌體與細菌性病原菌的基因組有密切關(guān)系[6-8]，噬菌體侵入細菌細胞后，在細菌細胞中有兩種循環(huán)方式，裂解性噬菌體通過裂解細菌細胞有效地自我復(fù)制，而溫和性噬菌體侵入細菌細胞后不裂解宿主，而是整合到宿主基因組中，形成原噬菌體（prophage）[10]。原噬菌體一般情況下不引起病原菌細胞裂解，而是隨著病原菌染色體的復(fù)制而復(fù)制，繁殖和傳遞噬菌體本身遺傳信息。雖然原噬菌體沒有裂解宿主的特性，但是需要表達一些調(diào)節(jié)基因和附屬基因來維持原噬菌體的溫和性狀態(tài)[11-12]。這些調(diào)節(jié)基因和附屬基因也可能賦予宿主細胞新的表型特性，比如原噬菌體中的遺傳單元可能對宿主的致病性有貢獻[13-14]，另一方面，原噬菌體在宿主中也會發(fā)生突變和衰退，在宿主不斷的繁衍傳代過程中，丟失一些關(guān)鍵基因，最終導(dǎo)致原噬菌體的喪失[10]。

隨著基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，自青枯菌GMI1000基因組測序完成之后，越來越多的青枯菌株系的全基因組測序工作已經(jīng)完成[15-16]，包括煙草青枯菌株系Y45和FQY_4[17-18]。青枯菌基因組中的原噬菌體序列也有報道，Askora等[19]從復(fù)雜種青枯菌株系中發(fā)現(xiàn)兩株噬菌體RSM3和RSM4，這兩株噬菌體的相關(guān)性非常近，但與絲狀體噬菌體不同，青枯菌株系MAFF30139的基因組中有RSM3噬菌體的前體，能通過PCR和轉(zhuǎn)化的方式使它反轉(zhuǎn)成有侵蝕能力的噬菌體。通過序列比較分析顯示，除了編碼未知蛋白的讀碼框（ORF2）和編碼決定宿主范圍的吸附蛋白外，噬菌體RSM3和RSM1的核酸序列具有高度的保守性[20]，被噬菌體RSM1和RSM3侵染后的青枯菌細胞，其群體聚合力增強，且青枯菌細菌對其宿主番茄的致病能力降低。但煙草青枯菌基因組中原噬菌體的研究未見報道，本文在煙草青枯菌FQY_4全基因組測序的基礎(chǔ)上，分析FQY_4基因組中原噬菌體的序列和噬菌體元件，以期為從青枯菌基因組中誘導(dǎo)和從植煙土壤環(huán)境中篩選對煙草青枯菌具有侵蝕能力的噬菌體的研究提供信息。

1 材料與方法

材料：青枯菌GMI1000基因組信息從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取[15]。煙草青枯菌FQY_4，來自貴州省煙草青枯病病圃，其全基因組序列通過Hiseq 2000高通量測序完成，F(xiàn)QY_4基因組在GenBank的登錄號分別是 CP004012 和 CP004013[18]。

方法：采用Prohinder（網(wǎng)址：http://aclame.ulb.ac.be/Tools/Prophinder/）、PHAST(PHAge Search Tool，噬菌體搜索工具)(網(wǎng)址http://phast.wishartlab.com/)和ACLAME數(shù)據(jù)庫在線分析煙草青枯菌FQY_4基因組中的原噬菌體。在Prohinder和PHAST網(wǎng)站上提交FQY_4基因組的GenBank登錄號，獲取分析后得分在50以上的原噬菌體信息，然后在ACLAME數(shù)據(jù)庫中噬菌體比較分析。原噬菌體的讀編框（Open Reading Frame，ORF）分析通過NCBI網(wǎng)站的ORFs完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯菌FQY_4基因組中的原噬菌體

采用Prohinder軟件對青枯菌FQY_4基因組染色體和巨大質(zhì)粒中的原噬菌體進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示FQY_4染色體上有4個原噬菌體及原噬菌體元件（圖1），其中1個是原噬菌體（Prophage_2）,具有典型噬菌體基因組的完整的特性，另外3個是不完整的原噬菌體，即噬菌體元件。FQY_4的巨大質(zhì)粒上沒有發(fā)現(xiàn)原噬菌體或噬菌體元件的序列。FQY_4染色體基因組上的4個原噬菌體和噬菌體元件的起始點和終止點位置信息如表1所示。

圖1顯示，原噬菌體-2（Prophage_2）具有完整噬菌體的編碼功能，它包含了53個編碼區(qū)域，具有典型的噬菌體特征，如外殼蛋白、附著點、尾部因子、tRNA等編碼序列（圖2）。原噬菌體-2的整個序列長度為40285 bp，GC含量為65.64%，與FQY_4整個基因組中的GC含量類似[18]，其大小與青枯菌一般的噬菌體基因組類似[20-22]，但是比青枯菌噬菌體ΦRSL1基因組小[23]。

圖1 青枯菌FQY_4染色體中原噬菌體位置分布Fig.1 Position of prophages in the chromosome of Ralstonia Solanacearum strain FQY-4

圖2 青枯菌FQY_4染色體的Prophage_2編碼基因示意圖Fig.2 Coding genes of prophage-2 in the chromosome of Ralstonia Solanacearum strain FQY-4

2.2 青枯菌FQY_4的原噬菌體與青枯菌GMI1000的原噬菌體、噬菌體?RSA1的比較

采用Prohinder預(yù)測青枯菌GMI1000和FQY_4的原噬菌體信息如表1所示，青枯菌FQY_4和GMI1000染色體上的原噬菌體或噬菌體元件的數(shù)目和大小相似，且各包含有一個完整的原噬菌體，原噬菌體和噬菌體元件編碼的總基因數(shù)目相近，但是它們在各自染色體上的分布位置差別比較大。Salanoubat等[15]報道青枯菌株系GMI1000染色體上至少有4個原噬菌體或噬菌體元件，它們與GMI1000染色體一個接合轉(zhuǎn)座子Tn4371結(jié)合在一起，推斷噬菌體元件是通過基因水平轉(zhuǎn)移方式獲得。GMI1000染色體上具有完整噬菌體特征的原噬菌體?RSΧ與能侵蝕裂解多株青枯菌的噬菌體?RSA1很相似[15]。Blast比較分析顯示，青枯菌FQY_4的原噬菌體-2與?RSA1具有很高的同源性，尤其是編碼的末端酶、外殼蛋白、尾絲、附著點蛋白的相似性（表2），說明青枯菌FQY_4中原噬菌體及噬菌體元件可能在它們協(xié)同進化過程中獲得后整合到染色體上。

表1 青枯菌FQY_4和GMI1000染色體上原噬菌體及噬菌體元件Tab.1 Prophages and its elements in chromosome of Ralstonia Solanacearum strain FQY-4 and GMI1000

表2 青枯菌FQY_4原噬菌體-2與噬菌體?RSA1的相似性比較Tab.2 Homology comparison between prophage-2 in Ralstonia Solanacearum strain FQY-4 and phage ?RSA1

續(xù)表2

3 討論

噬菌體是細菌進化的主要驅(qū)動力之一，通常認為噬菌體驅(qū)動細菌的進化，在噬菌體的壓力下，迫使在細菌群體中產(chǎn)生具有適應(yīng)性的細菌，細菌與裂解性噬菌體的競爭性協(xié)同進化會加速協(xié)同進化物種之間的分子進化速率[24]。在測序中的青枯菌株系基因組中，許多的基因島與預(yù)測的原噬菌體或噬菌體元件相關(guān)[25]。有趣的是原噬菌體-3的位置與染色體上一個基因島（chr_GI10）位置有部分重疊區(qū)域，暗示FQY_4基因組中原噬菌體與基因島上基因富集區(qū)具有一定的聯(lián)系，但是其關(guān)系還需要進一步的分析。

噬菌體在土壤中不僅含量豐富，而且也是影響土壤中微生物群落進化的關(guān)鍵因素[26-27]，同時，噬菌體還是基因水平轉(zhuǎn)移（HGT）的有效載體[28]，它能使病原菌快速的獲得適應(yīng)性功能，在病原菌多樣性的出現(xiàn)中起重要作用。原噬菌體與病原菌的致病力也有一定的關(guān)系[29-30]，青枯菌原噬菌體基因簇的序列分析顯示它們中分布著好幾個涉及植物-細菌相互作用的基因，如III型效應(yīng)因子（T3Es）的基因（popP1，popP2，ripT等），Addy等[31-32]研究發(fā)現(xiàn)被絲狀噬菌體?RSS1侵染后的青枯菌在西紅柿植株內(nèi)的致病力增加，而被噬菌體?RSM侵染后的青枯菌喪失了致病力。

三個青枯菌株系（GMI1000，Po82和CMR15）含有popP2效應(yīng)因子基因，該基因與一個分布在基因組不同位置上的原噬菌體相關(guān)，而且研究顯示青枯菌菌株的原噬菌體顯然具有菌株特異性[21,33-34]，表明它們在青枯菌菌株中分布具有多樣性，譚錦等[35]研究表明柑橘黃龍病病原菌株系在原噬菌體區(qū)域具有較豐富的多樣性。

細菌中的原噬菌體在一定條件下可以被誘導(dǎo)，形成有侵染能力的噬菌體，阮萃才等[36]利用原噬菌體誘導(dǎo)法檢測環(huán)境中的誘變劑，張子千等[37]報道利用絲裂霉素C從嗜鹽古生菌Natinema sp.J7-1中誘導(dǎo)分離得到嗜鹽古生菌溶原噬菌體SNJ1,它能侵染Natrinema sp.J7-2并在雙層平板上形成清晰的噬菌斑。煙草青枯菌FQY_4基因組中原噬菌體-2具有典型噬菌體的特征，并與對青枯菌具有侵蝕裂解能力的噬菌體?RSA1具較高同源性，研究有效的誘導(dǎo)方法把原噬菌體-2誘導(dǎo)成對煙草青枯菌具有侵蝕性的噬菌體，利用原噬菌體-2和噬菌體?RSA1的序列信息特征從植煙土壤或其它環(huán)境中篩選對煙草青枯菌具有侵蝕性的噬菌體，對于利用煙草青枯菌噬菌體建立煙草青枯病的生物防控策略具有重要意義。

[1]Michiel Vos,Birkett PJ,Birch E,et al.Local adaptation of bacteriophages to their bacterial hosts in soil [J].Science,2009,325(5942):833.

[2]徐鳳宇,蘇勝兵,馬紅霞,等.不同類型土壤中分枝桿菌噬菌體分離率的比較[J].生態(tài)學(xué)報,2013,33(15):4616-4622.

[3]Wommack KE,Colwell RR.Virioplankton:viruses in aquatic ecosystems.Microbiol[J].Mol Biol Rev,2000,64(1):69-114.

[4]Kidambi SP,Ripp S,Miller RV.Evidence for phagemediated gene transfer amongPseudomonas aeruginosastrains on the phylloplane[J].Appl.Environ.Microbiol.,1994,60(2):496-500.

[5]Killiny N,Almeida RPP.Host structural carbohydrate induces vector transmission of a bacterial plant pathogen[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,2009,106(52):22416-22420.

[6]蔡劉體，汪漢成，袁賽飛，等.青枯菌特異性噬菌體的研究進展與應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊,2012,11:145-148.

[7]Kawasaki T.,Shimizu M.,Satsuma H,et al.Genomic characterization ofRalstonia solanacearumphage ФRSB1,a T7-like wide-host-range phage[J].J.Bacteriol.,2009,191(1):422-427.

[8]Yamada T,Satoh S.,Ishikawa H,et al.A jumbo phage infecting the phytopathogenRalstonia solanacearumde fi nes a new lineage of the Myoviridae family[J].Virology,2010,398(1):135-147.

[9]Kawasaki T.,Nagata S.,Fujiwara A.,et al.Genomic characterization of the filamentous integrative bacteriophage ФRSS1 and ФRSM1,which infectRalstonia solanacearum[J].J.Bacteriol.,2007,189(16):5792-5802 .

[10]Brussow H,Canchaya C,Hardt WD.Phages and the evolution of bacterial pathogens:from genomic rearrangements to lysogenic conversion[J].Microbiol.Mol.Biol.Rev.,2004,68(3):560-602.

[11]Koide T,Zaini PA,Moreira LM,et al.DNA microarraybased genome comparison of a pathogenic and a nonpathogenic strain ofXylella fastidiosadelineates genes important for bacterial virulence[J].J.Bacteriol.,2004,186(16):5442-5449.

[12]Nunes LR,Rosato YB,Muto NH,et al.Microarray analyses ofXylella fastidiosaprovide evidence of coordinated transcription control of laterally transferred elements[J].Genome Res.,2003,13(4):570-578.

[13]Canchaya C,Fournous G,Brussow H.The impact of prophages on bacterial chromosomes[J].Mol.Microbiol.,2004,53(1):9-18.

[14]Casjens S.Prophages and bacterial genomics:What have we learned so far?[J].Mol.Microbiol.,2003,49(2):277-300.

[15]Salanoubat M,Genin S,Artiguenave F,et al.Genome sequence of the plant pathogenRalstonia solanacearum[J].Nature,2002,415:497-502.

[16]Genin and Denny.Pathogenomics of theRalstonia solanacearumspecies complex[J].Annu.Rev.Phytopathol.,2012,50(4):1-23.

[17]Li Zefeng,Wu Sanling,Bai Χuefei,et al.Genome Sequence of the Tobacco Bacterial Wilt PathogenRalstonia solanacearum[J].J Bacteriol.,2011,139(21):6088-6089.

[18]Cao Yi,Tian Baoyu,Liu Yanxia,et al.Genome Sequencing ofRalstonia solanacearumFQY_4,Isolated from a Bacterial Wilt Nursery Used for Breeding Crop Resistance[J].Genome announcements,2013,(1)3:1-2.

[19]Askora A.,Kawasaki T.,Usami S.,et al.Host recognition and integration of filamentous phage RSM in the phytopathogenRolstonia Solanacearum[J].Virology,2009,(384):69-76.

[20]Askora A,Kawasaki T,Fujie,et al.Resolvase-like serine recombinase mediates integration/excision in the bacteriophage φRSM[J].J Biosci Bioeng,2011,111(2):109-116.

[21]Fujiwara A.,Kawasaki T.Usami S.,et al.Genomic characterization ofRalstonia solanacearumphage ФRSA1 and its related prophage(ФRSΧ) in strain GMI1000[J].J.Bacteriol.,2008,190(1):143-150.

[22]Kawasaki T.,Nagata S.,Fujiwara A.et al.Genomic characterization of the filamentous integrative bacteriophage ФRSS1 and ФRSM1,which infectRalstonia solanacearum[J].J.Bacteriol.,2007,189(16):5792-5802 .

[23]Effantin G,Hamasaki R,Kawasaki T,et al.Cryo-Electron Microscopy Three-Dimensional Structure of the Jumbo Phage ΦRSL1 Infecting the PhytopathogenRalstonia solanacearum[J].Structure,2013,21(2):298-305.

[24]Clokie MR,Millard AD,Letarov AV,et al.Phages in nature[J].Bacteriophage,2011; 1:31-45.

[25]Remenant B,de Cambiaire JC,Cellier G,et al.Ralstonia syzygii,the blood disease bacterium and some asianR.solanacearumstrains form a single genomic species despite divergent lifestyles[J].PLoS ONE,2011.6:e24356.

[26]Gomez P and Buckling A.Bacteria-phage antagonistic coevolution in soil[J].Science,2011,(332):106-109.

[27]Ronning CM,Losada L,Brinkac L,et al.Genetic and phenotypic diversity inBurkholderia:contributions by prophage and phage-like elements[J].BMC Microbiol,2010(10):202.

[28]Kenzaka T,Tani K,Nasu M.High-frequency phagemediated gene transfer in freshwater environments determined at single-cell level[J].ISME J,2010(4):648-659.

[29]Varani AM,Monteiro-Vitorello CB,Nakaya H I,et al.The Role of Prophage in Plant-Pathogenic Bacteria[J].Annual review of phytopathology,2013(51):429-451.

[30]Tyler JS,Beeri K,Reynolds J L,et al.Prophage Induction Is Enhanced and Required for Renal Disease and Lethality in an EHEC Mouse Model[J].PLoS pathogens,2013,9(3):e1003236.

[31]Addy H S,Askora A,Kawasaki T,et al.Loss of virulence of the phytopathogenRalstonia solanacearumthrough infection by ?RSM fi lamentous phages[J].Phytopathology,2012,102(5):469-477.

[32]Addy H S,Askora A,Kawasaki T,et al.The filamentous phage φRSS1 enhances virulence of phytopathogenicRalstonia solanacearumon tomato[J].Phytopathology,2012,102(3):244-251.

[33]Gabriel DW,Allen C,Schell M,et al.Identification of open reading frames unique to a select agent:Ralstonia solanacearumrace 3 biovar 2[J].Mol.Plant-Microbe Interact,2006(19):69-79.

[34]Guidot A,Elbaz M,Carrere S,et al.Specific genes from the potato brown rot strains ofRalstonia solanacearumand their potential use for strain detection[J].Phytopathology,2009( 99):1105-1112.

[35]譚錦,王雪峰,蘇華楠,等.中國柑橘黃龍病病原菌兩個原噬菌體超變異基因遺傳多樣性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(18):3784-3792.

[36]阮萃才,梁遠,劉錦玲,等.原噬菌體誘導(dǎo)法在環(huán)境誘變劑研究中的應(yīng)用[J].環(huán)境科學(xué),1990,11(3):41-43.

[37]張子千,劉瑩,陳向東.Natrinema屬極端嗜鹽古生菌溶原性噬菌體 SNJ1 的相關(guān)研究[C]//2012年湖北生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展高端論壇暨湖北省生物工程學(xué)會2012年度學(xué)術(shù)交流會論文匯編,2012.

Bioinformatic analysis of prophage in genome of tobacco pathogenRalstonia solanacearumFQY_4

CAI Liuti，LIU Yanxia，MENG Lin，LUO Zhengyou，SHI Junxiong
Guizhou Tobacco Research Institute,Guiyang,550081,China

Prophages in chromosome of FQY-4 was analyzed on the basis of its complete genomic sequence.Results showed that there was one prophage which contained typical characteristics of phage,and three incomplete prophage elements.Compared with theRalstonia Solanacearumstrain GMI1000,FQY_4 shared similarity in prophage,and homology between the prophage-2 in FQY_4 and prophage ?RSA1 was 82%.There were 40 coding sequences with highly signi fi cant homology level of more than 99%,which laid solid foundation for diversity analysis of prophage ofRalstonia Solanacearum,and for co-evolution ofRalstonia solanacearumand phages.

tobacco; bacterial wilt;Ralstonia solanacearum; genome; prophage

蔡劉體，劉艷霞，孟琳，等.煙草青枯菌FQY_4基因組中原噬菌體生物信息學(xué)分析[J].中國煙草學(xué)報，2015,21（1）

中國煙草總公司貴州省公司科技項目“煙草青枯菌致病基因家族分析”（合同號：黔煙科合2012-03）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項項目“利用有機（類）肥料調(diào)控我國土壤微生物區(qū)系關(guān)鍵技術(shù)研究”（合同號：201103004）

蔡劉體(1974— )，博士，副研究員，從事土肥植保工作，Email:cailiuti01 @163.com

石俊雄(1966— )，研究員，主要從事煙草營養(yǎng)與施肥，植煙土壤微生物生態(tài)修復(fù)工作，Email：sjx2196@163.com

2013-12-13

：CAI Liuti，LIU Yanxia，Meng Lin,et al.Bioinformatic analysis of prophage in genome of tobacco pathogenRalstonia solanacearumFQY_4 [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(1)