陳 晨 郭曉霞 蔣 勇 宋世佩 李春曉 趙彤言

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071；2.第二炮兵疾病預(yù)防控制中心，北京 100071；3.解放軍96301部隊(duì)防疫所，湖南懷化 418008)

日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是世界上重要的病毒性腦炎病原體之一(Ghoshetal.，2009)，全球每年約有65萬乙腦病例發(fā)生，其中50%發(fā)生在中國。我國湖南省自50年代起一直是乙腦流行區(qū)，1951～2000年乙腦年平均發(fā)病率為5.82/10萬，在2013年7月湖南省公布的乙腦報(bào)告病例中，懷化市報(bào)告乙腦發(fā)病數(shù)列居前位(郭綬衡，2002)。懷化市位于湖南省西部偏南，屬中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，光熱資源豐富，雨量充沛，為三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus的繁殖提供了良好的孳生環(huán)境。盡管該地區(qū)有乙腦病例報(bào)道，但是沒有檢測和分離到乙腦病毒的研究報(bào)告，乙腦病毒在三帶喙庫蚊和豬中的自然感染狀況尚不清楚。

本研究通過2012～2013連續(xù)兩年對(duì)湖南懷化地區(qū)兩個(gè)村落進(jìn)行三帶喙庫蚊和豬腦樣本的采集，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室乙腦病毒核酸檢測，研究蚊和豬體內(nèi)乙型腦炎病毒自然感染狀況，為該地區(qū)乙型腦炎的防控和流行趨勢的預(yù)測提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蚊蟲樣本：采自湖南懷化北部爐天沖村、南部池回村采集，液氮保存，干冰運(yùn)輸送至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。

1.1.2豬腦：為從湖南懷化現(xiàn)場采集經(jīng)液氮保存、干冰運(yùn)輸送至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存待檢的樣品。

1.2 方法

1.2.1蚊蟲樣本采集：2012～2013年選擇湖南省懷化市往年氣溫較高、雨水較多的七、八月份，選擇北部爐天沖村和南部池回村2個(gè)村落，每個(gè)村落選擇豬圈、稻田和人居3個(gè)不同生境，于每日18:00～20:30將二氧化碳誘蚊燈(MT-1二氧化碳誘蚊燈)掛放于離地1 m處位置捕獲蚊蟲，帶回實(shí)驗(yàn)室麻醉并分類計(jì)數(shù)，放入1.5 mL凍存管(每管30～50只)中，完整記錄信息(包含采集時(shí)間、地點(diǎn)、蚊蟲種類、數(shù)量)后裝入布袋，置液氮罐中凍存。

1.2.2豬腦樣本采集：選擇蚊蟲采樣點(diǎn)周邊(豬圈)的出欄豬，宰殺后立即利用自制長彎鉤采集豬腦組織(約5 g/頭)，信息記錄完整后分裝入1.5 mL凍存管中。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成：依據(jù)文獻(xiàn)合成了檢測蚊蟲和豬體內(nèi)乙腦病毒擴(kuò)增引物序列(潘曉玲，2009)，引物由上海生物技術(shù)有限公司合成。上游引物J1：GTGCCATTGACATCACAAG，下游引物J2：TGTCTCAGGTCCATCTACG。擴(kuò)增區(qū)間：2 418～2 826，擴(kuò)增片段長度為409 bp。

1.2.4蚊蟲及豬腦攜帶病毒RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：蚊蟲RNA提取：采用北京吉百特公司研制的柱提法提取蚊蟲RNA，可避免蚊蟲體內(nèi)色素干擾RNA質(zhì)量。豬腦RNA采用傳統(tǒng)Trizol法提取。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：配制為反應(yīng)體積10 μL的反轉(zhuǎn)錄體系：Mgcl22 μL，10×RT Buffer 1 μL，dNTP Mixture 1 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，Random 9 mers 0.5 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，RNase Free dH2O 2.75 μL，上述提取的RNA 2 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：30 ℃ 10 min，45 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR反應(yīng):取上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物5 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增病毒，將下列試劑加入200 μL離心管中，配制為反應(yīng)體積為25 μL的PCR反應(yīng)體系：上下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，Taq酶套餐12.5 μL，H2O 6.5 μL， cDNA 5 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃，3 min；94℃，40 s，56℃，40 s，72℃，1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并拍照記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

最小感染率=1/蚊蟲總數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三帶喙庫蚊乙腦病毒自然感染結(jié)果

2012年在懷化北部爐天沖村、南部池回村分別采集三帶喙庫蚊3 260、7 841只，分別分裝為68份和157份樣本，經(jīng)檢測，北部爐天沖村有2份樣本呈乙腦病毒陽性，樣本陽性率為2.94%，南部池回村有3份樣本呈乙腦病毒陽性，陽性率為1.91%(表1)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=0.23，P>0.05，兩個(gè)村落三帶喙庫蚊乙腦病毒陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 2012年三帶喙庫蚊乙腦病毒感染情況Tab. 1 The infection rate of Japanese encephalitis virus in Cx.tritaeniorhynchus in 2012

2013年在懷化北部爐天沖村、南部池回村分別采集三帶喙庫蚊3 004、5 209只，分別分裝為70份和97份樣本，經(jīng)檢測，北部爐天沖村有1份樣本呈乙腦病毒陽性，樣本陽性率為1.43%，南部池回村有5份樣本呈乙腦病毒陽性，陽性率為5.15%，見表2。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=1.63，P>0.05，兩個(gè)村落三帶喙庫蚊乙腦病毒陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

假設(shè)每只陽性樣本管中只有一只攜帶乙型腦炎病毒的蚊蟲，那么2012年北部爐天沖村和南部池回村的蚊蟲樣本乙腦病毒的最小感染率分別(周曉俊，2007)為0.613/1 000，0.382/1 000；2013年北部爐天沖村和南部池回村的蚊蟲樣本乙腦病毒的最小感染率分別為0.333/1 000，0.960/1 000，見表3。

2012年陽性樣本僅來自稻田，2012年稻田樣本陽性率為2.03%，2013年三種生境均出現(xiàn)陽性樣本，2013年稻田樣本陽性率為1.82%，豬圈樣本陽性率為1.49%，人居樣本陽性率為4.76%，2013年三種生境間三帶喙庫蚊乙腦病毒陽性率無顯著差異。

表2 2013年三帶喙庫蚊乙腦病毒感染情況Tab. 2 The infection rate of Japanese encephalitis virus in Cx.tritaeniorhynchus in 2013

表3 三帶喙庫蚊乙腦病毒生境分布情況Tab.3 Habitat distribution of JEV infected Cx.tritaeniorhynchus

2.2 豬乙腦病毒自然感染的研究

2012年在北部爐天沖村采集的55頭豬的腦中檢測到6頭豬感染乙型腦炎病毒，2013年在南部池回村采集的79頭豬的腦中檢測到16頭豬感染乙型腦炎病毒，豬樣品乙腦病毒陽性分別為：2012年10.91%，2013年20.25%。見表4。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=1.51，P>0.05，2012和2013年豬感染三帶喙庫蚊乙腦病毒陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 蚊蟲、豬體內(nèi)乙腦病毒核酸檢測

分別對(duì)蚊蟲、豬腦樣本進(jìn)行組織研磨、RNA提取，運(yùn)用乙腦病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測，擴(kuò)增出目的條帶，條帶大小與預(yù)期一致(圖1～2)。所得序列在Genbank基因庫中比對(duì)結(jié)果顯示與乙型腦炎病毒序列(AB196925.1)相似率高達(dá)99%。

表4 豬乙腦病毒感染情況Tab. 4 The infection rate of Japanese encephalitis virus in pigs

圖1 2013年懷化蚊蟲乙腦PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR analysis of JE virus in Cx.tritaeniorhynchus in 2013M: DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1～13： 三帶喙庫蚊樣本，其中1,2,5為陽性樣本； 14： 陰性對(duì)照。M： DL2000; 1-13: Samples of Cx.tritaeniorhynchus, 1, 2, 5 are positive samples； 14： Negative control.

圖2 2012-2013豬腦乙腦PCR檢測Fig.2 PCR analysis of JE virus in pig′s brain in 2012 and 20131～22：22份攜帶乙腦病毒的豬腦樣本。1-22：22 samples of pig′s brain with JE virus.

3 討論

湖南省位于我國華中地區(qū)，毗鄰多個(gè)省份，湖南省懷化市以水稻種植為主，而稻田是三帶喙庫蚊重要的孳生地，據(jù)本次調(diào)查，該地區(qū)蚊種構(gòu)成比較簡單，三帶喙庫蚊為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢種。三帶喙庫蚊主要棲息于豬場、人房，是夜間活動(dòng)的主要蚊種，其分布、季節(jié)高峰及嗜叮人、畜的特點(diǎn)與乙腦發(fā)病吻合，是當(dāng)?shù)匾夷X主要傳播媒介。

自我國學(xué)者1938年通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)乙型腦炎已在中國流行(Huang，1941),于1940年又在北京分離到第一株乙腦病毒(Yen，1941)，以后的70多年間，在中國各地分離到大量的乙腦毒株。特別是近年來我國開展了乙腦監(jiān)測工作，數(shù)據(jù)顯示，在近30年間隨著環(huán)境變化、人口遷移、貿(mào)易往來等生態(tài)、自然社會(huì)條件變化，我國乙型腦炎病毒呈現(xiàn)出從基因Ⅲ型到Ⅰ型的演變趨勢，基因Ⅰ型正在逐漸取代基因Ⅲ型成為優(yōu)勢基因型(陳檸等，2013)。本研究從懷化地區(qū)自然界乙腦傳播循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——媒介蚊蟲和豬體內(nèi)分離到乙腦病毒，村落中三帶喙庫蚊乙腦陽性率在1.43%～5.15%，豬樣本陽性率高達(dá)10.91%～20.25%，表明該地區(qū)蚊蟲和豬感染乙型腦炎病毒較普遍，從不同生境樣本陽性率上看，稻田、豬圈、人居環(huán)境乙腦病毒均有分布，其中人居環(huán)境較高為4.76%，表明該地區(qū)乙腦病毒已在自然環(huán)境中廣泛存在，且人群有感染乙腦病毒的可能性應(yīng)引起媒介防控工作者注意。

通過核酸檢測，將所測序列與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)乙腦病毒與基因Ⅲ型乙腦病毒重合率高達(dá)99%，基因型別的確定為了解該地區(qū)乙型腦炎流行株的分類地位和分子特征，指導(dǎo)該地區(qū)乙型腦炎的防控，預(yù)測當(dāng)?shù)匾夷X流行趨勢提供數(shù)據(jù)支撐。

我國乙腦流行的地域范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。隨著西藏分離出XZ0934株、新疆分離出XJ/08/01株(Lietal.，2011)，我國除青海外的各個(gè)省份均已有關(guān)于乙腦的報(bào)道(胡倉云，2014; 曾陽等，2014)。懷化市又地處四季分明，雨量充沛，適宜蚊蟲滋生繁殖的中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，因此，防控蚊媒疾病傳播，特別是預(yù)防乙腦疾病暴發(fā)的工作不能放松。