周冬梅 陳剛 鄭雄偉 朱偉峰 陳寶珍

·臨床研究與應(yīng)用·

112例套細胞淋巴瘤臨床病理分析*

周冬梅 陳剛 鄭雄偉 朱偉峰 陳寶珍

目的：探討套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）的臨床病理特點。方法：收集112例MCL的臨床及病理資料，采用免疫組織化學(xué)（Envision二步法）行相關(guān)抗體標記，熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）對其中24例作IgH/CCND1基因斷裂檢測。結(jié)果：112例（包括2例多形性和母細胞變亞型）均表達B細胞相關(guān)抗原，94.6%（106/112）表達cyclinD1，92.9%（104/112）表達CD5。不同免疫表型的經(jīng)典型MCL的Ki-67及平均生存期無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。3例CD5-的MCL未檢測出IgH/CCND1基因斷裂，2例經(jīng)典型MCL檢測出IgH/CCND1多倍體。結(jié)論：MCL是一種具有特殊免疫表型的B細胞淋巴瘤，多形性及母細胞變異型的預(yù)后較差，對特殊亞型的MCL診斷有必要細分。

套細胞淋巴瘤 免疫組化 熒光原位雜交 預(yù)后

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例與標本收集福建省腫瘤醫(yī)院2004年1月至2014年5月外檢及會診的MCL112例，隨防時間截止于2014年5月。由2名副主任醫(yī)師結(jié)合病史、組織形態(tài)及免疫組織化學(xué)等復(fù)核確診。所有標本均按常規(guī)制片、HE染色并做免疫組織化學(xué)染色。

1.1.2免疫組織化學(xué)試劑所用抗體包括CD20（MX003）、CD79a（SP18）、Pax5（SP34）、CD3（多克?。D5（SP15）、CD21（2G9）、CD23（1B12）、CD10（56C6）、cyclinD1（DCS-6）、TdT（SEN28）、Ki-67（MIB-1），均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，置于枸櫞酸鈉修復(fù)液（0.01 mol/L，pH6.0）中，高壓鍋加熱進行抗原修復(fù)。加入3%（體積分數(shù)）H2O2溶液10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片滴加即用型一抗，4℃冰箱過夜。加通用二抗（PV9000 Immuno-Bridge，美國GBI公司），37℃水浴30 min。用新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照，以幾種抗體蛋白表達陽性的組織作為陽性對照。

結(jié)果判定：陽性表達物質(zhì)為棕色，CD20、CD79a、CD5、CD21、CD23、CD10的表達部位為胞膜，Pax5、cyclinD1、TdT、Ki-67的表達部位為胞核，CD3的表達部位為細胞膜、細胞漿。

1.2.2熒光原位雜交（FISH）檢測IgH/CCND1探針購自美國Vysis公司。雜交步驟由Vysis公司專業(yè)網(wǎng)站www.vysis.com提供。以反應(yīng)性淋巴組織為正常對照，結(jié)果在熒光顯微鏡下觀察。標記綠色熒光素的IgH探針和14q32上IgH的兩段靶片段雜交，標記紅色熒光素的CCND1探針和11q13上大約350kb的片段進行雜交。有t（11；14）（q13；q32）細胞核內(nèi)出現(xiàn)和11q13及14q32上的靶片段雜交的兩個紅色信號和兩個綠色信號。無t（11；14）（q13；q32）細胞內(nèi)產(chǎn)生黃色融合信號或者兩個相互靠近的綠色和紅色信號。以腫瘤區(qū)域內(nèi)紅綠分離信號的細胞數(shù)＞15%為FISH檢測陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 11.50軟件進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學(xué)檢驗采用兩樣本均數(shù)差別的t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床特點

112例MCL中，男性91例，女性21例，年齡27～78歲，平均58歲。原發(fā)于結(jié)內(nèi)87例，大部分表現(xiàn)為全身淺表淋巴結(jié)腫大，原發(fā)于消化道14例，大多表現(xiàn)為淋巴瘤樣息肉病，鼻咽口咽部11例，9例有外周血及骨髓累及。生存期3～90個月，平均生存期為37.6個月（表1）。

表1 不同免疫表型的經(jīng)典型MCL的Ki-67及生存期比較Table 1Comparison of Ki67 and survival of classical MCL with different immunophenotypes

2.2組織形態(tài)

112例MCL按組織結(jié)構(gòu)可分為套區(qū)型（圖1）、結(jié)節(jié)型和彌漫型。按細胞學(xué)形態(tài)可分為經(jīng)典型、變異型（如母細胞變型、多形性變型）。均可見單一性淋巴樣細胞增生，多數(shù)由小至中等大小細胞構(gòu)成，核輕度至明顯不規(guī)則，類似于中心細胞，核仁不明顯。腫瘤缺乏轉(zhuǎn)化細胞（中心母細胞）或副免疫母細胞，無增殖中心。有些病例可見玻璃樣變小血管，還可見散在無吞噬現(xiàn)象的上皮樣組織細胞。1例多形性變型MCL的腫瘤細胞中等或偏大，彌漫分布，核具有多形性，大多核圓，部分核形不規(guī)則、扭曲、凹陷，染色質(zhì)細，可見核仁，核分裂多（圖2）。1例母細胞變型MCL的腫瘤細胞似淋巴母細胞，中等大小，核圓形，染色質(zhì)稀疏，核仁不顯著，核分裂很多（圖3）。

2.3免疫組織化學(xué)特征

所有病例腫瘤細胞均CD20、CD79a、Pax5陽性，CD3、CD10、CD21、CD23、TdT陰性，106例cyclinD1陽性，6例cyclinD1陰性，104例CD5陽性，8例CD5陰性，1例CD5陰性且CD10陽性（圖4），Ki-67從5%～90%不等。

?A.The germinal center was surrounded by a thickened lymphocyte sleeve（H&E×200）；B.Immunohistochemistry：cyclinD1（+）（Envision×400）；C.Ki-67 was low（Envision×400）圖1套區(qū)型MCLFigure 1Mantle zone lymphoma

?A.Defused tumor cells and polymorphic subtype with apparent nucleolus and high mitotic rate（H&E× 400）；B.Immunohistochemistry：cyclinD1（+）（Envision×400）；C.CD5（+）（Envision×400）圖2多形性變型MCLFigure 2Polymorphic variant MCL

?A.Blastic tumor cells（H&E×400）；B.Immunohistochemistry：cyclinD1（+）（Envision×400）；C.CD5（+）（Envision×400）圖3母細胞變型MCLFigure 3Blastic variant MCL

2.4 熒光原位雜交（FISH）

6例cyclinD1陰性的MCL的FISH結(jié)果均顯示出現(xiàn)紅綠分離信號的細胞數(shù)大于15%，即存在t（11；14）（q13；q32）染色體的易位；8例CD5陰性而cyclinD1陽性的MCL中有5例的FISH結(jié)果均顯示出現(xiàn)紅綠分離信號的細胞數(shù)＞15%，即存在t（11；14）（q13；q32）染色體的易位（圖5）；10例CD5及cyclinD1陽性的MCL FISH結(jié)果均顯示出現(xiàn)紅綠分離信號的細胞數(shù)大于15%，即存在t（11；14）（q13；q32）染色體的易位。其中有2例出現(xiàn)染色體多倍體（圖6）。

圖4 CD5-CD10+的MCLFigure 4CD5+CD10+MCL

圖5 MCL的FISH檢測結(jié)果示CCND1基因斷裂（FISH×1 000），紅、綠色熒光分別標記CCND1基因斷裂點兩端，陽性信號顯示紅綠色熒光信號分離Figure 5FISH image of MCL showed CCND1 gene disruption（FISH× 1000）；red/green signals marked two ends of the CCND1 gene；a positive pattern showed two separate red and green signals

圖6 MCL的FISH檢測結(jié)果示染色體多倍體（FISH×1 000），二倍體為兩紅兩綠信號，紅綠信號分別大于兩個為多倍體Figure 6FISH image of MCL showed polyploidy（FISH×1000）；the diploid showed two red and two green signals，whereas the polyploid showed more than two signals

2.5統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

不同免疫表型的經(jīng)典型MCL（CD5+cyclinD1+、CD5-cyclinD1+及CD5+cyclinD1-組）各組間Ki-67及平均生存期均無顯著性差異（P＞0.05）。多形性及母細胞變異組的例數(shù)太少，未作比較（表1）。

3 討論

套細胞淋巴瘤是一種B細胞淋巴瘤，早前曾命名為中間淋巴細胞淋巴瘤、中心細胞性淋巴瘤和彌漫性小裂細胞淋巴瘤，因其臨床特點、形態(tài)、免疫表型及遺傳學(xué)等都獨具特性，故WHO新分類將其列為獨立疾?。?］。其發(fā)病率在非霍奇金淋巴瘤中約占2%～10%［2］，白人比黑人、亞洲人多見，平均發(fā)病年齡約60歲，男性更多見。淋巴結(jié)是最常累及部位，結(jié)外受累部位有脾、骨髓、胃腸道及韋氏環(huán)等，在胃腸道常表現(xiàn)為淋巴瘤樣息肉病。本組發(fā)病率為2.8%，男女比例為6：1～7：1，平均發(fā)病年齡56歲，受累部位以淋巴結(jié)最多，與文獻大致相仿［3］。

3.1鑒別診斷

目前多認為MCL起源于套區(qū)內(nèi)層未受抗原刺激的淋巴細胞，主要形態(tài)特點是單一腫瘤細胞增生，細胞小至中等大小，核較不規(guī)則，非常類似于中心細胞，?？梢姴Ａ幼冃⊙芗吧⒃谏掀咏M織細胞（無吞噬現(xiàn)象），無腫瘤性轉(zhuǎn)化細胞及增殖中心。按生長方式可分為套區(qū)型、結(jié)節(jié)型、彌漫型，按細胞形態(tài)可分為經(jīng)典型及變異型（母細胞樣、多形性、小細胞性、邊緣區(qū)樣等）。免疫組織化學(xué)顯示B細胞標記CD19、CD20、CD22、CD79a陽性，幾乎所有病例都表達T細胞相關(guān)抗原CD5，CD43也常有表達，但其他T細胞抗原通常是陰性的。少數(shù)表達CD23，偶有CD10、BCL-6、MUM-1陽性，在變異型MCL中常見。這將使得診斷困難，尤其在形態(tài)不典型或樣本量少時。

基于以上特點需與以下腫瘤鑒別：1）B小淋巴細胞淋巴瘤（SLL）。MCL小細胞變異型由小淋巴細胞

組成，有圓形核，類似于SLL，而SLL的增殖中心又類似于結(jié)節(jié)型MCL。但SLL細胞成分為前淋巴或副免疫母細胞，而MCL細胞類似于中心細胞，核輕微不規(guī)則，罕見轉(zhuǎn)化性母細胞。當MCL CD5、CD23均陽性而cyclinD1陰性時尤其要注意與SLL鑒別，必要時可作t（11；14）易位檢測。2）濾泡性淋巴瘤（FL）結(jié)節(jié)型MCL有結(jié)節(jié)狀生長模式，可與FL相混淆。單一的細胞群，缺乏中心母細胞，輕度的核不規(guī)則，應(yīng)增加MCL診斷的可能性。然而，MCL中如有殘留的生發(fā)中心，其中的中心母細胞可使MCL診斷困難。伴彌漫生長方式的FL和彌漫型MCL在組織學(xué)上也難以鑒別，加上部分MCL也可CD5陰性、CD10、BCL6陽性，此時應(yīng)根椐形態(tài)、免疫表型必要時作基因重排［MCL有t（11；14）易位，F(xiàn)L有t（11；18）易位］來鑒別。3）邊緣區(qū)淋巴瘤（MALT）。有些MCL伴邊緣區(qū)生長模式，腫瘤細胞擴大到邊緣區(qū)。但MALT源自套區(qū)外層，細胞成分多樣，有單核細胞樣、漿細胞和散在轉(zhuǎn)化B細胞組成，而MCL源自套區(qū)內(nèi)層，無腫瘤性轉(zhuǎn)化細胞，cyclinD1染色可顯示其由胞漿少的腫瘤細胞組成。4）淋巴母細胞淋巴瘤。母細胞亞型MCL中CD5、cyclinD1陽性，TdT陰性，淋巴母細胞CD20、cyclinD1陰性，TdT陽性。5）CD5陽性的DLBCL。多形性亞型MCL由具有異質(zhì)性的大細胞組成，細胞核有特征性的核裂，染色質(zhì)細膩，大細胞核和相對小的核仁之間的不一致性也可能提示套細胞來源。cyclinD1對證實診斷是必需的。6）Burkitt淋巴瘤。當母細胞亞型出現(xiàn)CD5陰性及CD10、BCL6異常表達時，還應(yīng)與Burkitt淋巴瘤鑒別，因為cyclinD1在部分Burkitt淋巴瘤中也可表達。

3.2MCL的異常表達

典型的形態(tài)結(jié)合典型的免疫表型不難診斷MCL，但有些MCL中CD5、cyclinD1的組化標記可為陰性。據(jù)報道［4-5］cyclinD1在MCL中的表達率為50%～70%，10%MCL可CD5陰性，少數(shù)CD10可陽性。本文就有病例如是。cyclinD1陰性可能與組織固定、包埋等原因，或抗體敏感性、特異性等有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)部分cyclinD1陰性者其t（11；14）易位仍可檢出，或者有cyclinD2、D3等系列的表達。但cyclinD2、D3不夠特異，在其他淋巴瘤也可表達。因而對部分cyclinD1陰性者應(yīng)結(jié)合形態(tài)或選擇其他檢測，才不至于漏診或誤診，正如本文中6例cyclinD1陰性病例經(jīng)FISH檢測出t（11；14）易位得以確診。如僅憑形態(tài)不結(jié)合其他檢測證實，此時MCL只宜作考慮性診斷。另外cyclinD1陰性的多形性MCL與CD5陽性的DLBCL有時鑒別很困難，因此有必要尋找更特異的抗體標記。近年研究發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子SOX11是 SOX家族成員，可影響Rb-E2F信號通路，從而調(diào)控cyclinD1表達。SOX11在cyclinD1陰性或陽性的套細胞淋巴瘤中都有表達［6-7］，在成熟淋巴細胞中明顯不表達，因而可作為MCL更特異的生物標記。最近還有報道［8］在cyclinD1陽性的DLBCL中檢測出一例有t（11；14）易位，但其形態(tài)、表型卻是典型的DLBCL；另一例檢測出t（4；11；14）易位，但形態(tài)、表型卻是介于DLBCL及MCL之間的“灰區(qū)淋巴瘤”。其研究結(jié)論是當形態(tài)、表型都支持DLBCL時，有t（11；14）易位也不能排除診斷cyclinD1陽性的DLBCL。本文8例CD5-D1+病例中3例CCND1/IGH分離FISH檢測陰性。這3例中有1例形態(tài)上就是典型的DLBCL，另2例形態(tài)介于DLBCL及MCL之間，是否應(yīng)診斷為DLBCL或“灰區(qū)淋巴瘤”，還有待其他檢測來進一步確診。

3.3預(yù)后

MCL的平均生存期3～5年［9］，絕大多數(shù)不能治愈，是所有淋巴瘤中遠期生存率較低的一種，目前尚無特異有效的方案治療，也無特異的預(yù)后指標。有研究認為獲得性基因轉(zhuǎn)換與其臨床進展、生存期短等預(yù)后緊密相關(guān)。研究總結(jié)［4］出MCL的疾病發(fā)生有4個步驟。首先是B細胞獲得t（11；14）等的易位，此后可有較長潛伏期。第二步，通過某些未知機制，細胞開始克隆性增生形成原位MCL或是所謂的惰性白血病樣MCL（形態(tài)、表型與經(jīng)典MCL類似，但臨床生物學(xué)行為惰性，可不予治療）。第三步，部分細胞畸變，主要是獲得或缺失重要靶基因從而下調(diào)主要細胞通路，使得細胞向更惡性克隆發(fā)展以致形成眾所周知的有臨床侵襲性特點的經(jīng)典MCL。第四步，惡性克隆細胞獲得更多基因改變?nèi)缛旧w區(qū)帶8q24、9p21、17p13的缺失，myc激活，CDKN2A、TP53基因失活等。這些改變可導(dǎo)致細胞更高水平增殖，疾病進展迅速，甚至多形性變、母細胞變。由此推論MCL以套區(qū)型（亦稱原位MCL）預(yù)后為佳，母細胞樣及多形性變型則預(yù)后不良。文獻報道母細胞樣及多形性變型平均生存期為3.8～17個月［10］，遠低于經(jīng)典型MCL，其核分裂多，Ki-67增殖指數(shù)也較高。而Ki-67增殖指數(shù)在大多數(shù)研究中被認為是MCL最重要的預(yù)后參數(shù)。還有研究認為在MCL母細胞樣或多形性變亞型中染色體易出現(xiàn)多倍體并與其cyclinD1高表達有關(guān)［11］，而另有研究認為cyclinD1陰性者預(yù)后較好［9］。本文2例多形性及母細胞樣型Ki-67指數(shù)高達90%，核分裂數(shù)10～30/15HPF，進展兇險，3～6個月內(nèi)死亡，也表明了母細胞樣或多形性變型預(yù)后較差。在本研究中還發(fā)現(xiàn)一有趣的現(xiàn)象：在行CCND1分離FISH檢測的MCL病例中有2例CD5及cyclinD1均陽性者出現(xiàn)染色體多倍體。此2例確診時均已晚期并

累及骨髓，其中1例確診后46 d死亡，另1例確診至今7個月仍在隨訪中。這2例中多倍體的出現(xiàn)與其進展晚期及不良預(yù)后是否有直接相關(guān)尚待研究證實。

3.4小結(jié)

綜上所述，對MCL的診斷有必要細分亞型，從而為臨床治療及預(yù)后判斷提供參考。MCL是一臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)及遺傳表型獨特的B細胞淋巴瘤，其發(fā)生發(fā)展機制還需更深入分子生物學(xué)研究，才有望為特異性治療提供靶點，為預(yù)后評估提供有價值的生物指標。

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（2014-10-23收稿）

（2014-12-25修回）

（編輯：鄭莉）

Clinicopathologic features of 112 patients with mantle cell lymphoma

Dongmei ZHOU,Gang CHEN,Xiongwei ZHENG,Weifeng ZHU,Baozhen CHEN

Gang CHEN;E-mail:naichengang@163.com

Objective:To explore the clinicopathologic features of 112 patients with mantle cell lymphoma(MCL).Methods:Data from 112 MCL cases were collected,and immunohistochemical assay was conducted.A break in the CCND1 gene was detected by fluorescence in situ hybridization(FISH).The t-test was used in the statistical analysis.Results:All tumor cells in the 112 cases expressed B cell-related antigen,including 1 blastoid subtype and 1 polymorphic subtype.Among all the cases,106 expressed CD5 and 104 expressed cyclinD1.A break in the CCND1 gene was not found in 3 cases with CD5-MCL.IgH/CCND1 polyploid was found in 2 classical cases.Conclusion:MCL is a type of special immunophenotypic B-cell lymphoma.The prognoses of blastoid and polymorphic subtypes are poor.Special subtypes should be classified during diagnosis.

mantle cell lymphoma,immunohistochemistry,fluorescence in situ hybridization,prognosis套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）是一種相對少見的非霍奇金淋巴瘤，侵襲性較強，遠期生存率低，目前尚無統(tǒng)一治療方案。本文收集了112例套細胞淋巴瘤的臨床病理資料加以回顧分析，以提高對此病認識，開拓診斷思路，為臨床治療及預(yù)后判斷提供參考。

10.3969/j.issn.1000-8179.20141779

福建省腫瘤醫(yī)院病理科，福建省腫瘤醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化重點實驗室（福州市350014）

*本文課題受國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目、福建省自然基金資助項目（編號：2012J01326）及福建省創(chuàng)新基金資助項目（編號：2012-cx-7）資助通信作者：陳剛naichengang@163.com

Department of Pathology,Key Laboratory of Cancer Translational Medicine of Fujian,Teaching Hospital of Fujian Medical University,Fujian Tumor Hospital,Fuzhou 350014,China.

This work was supported by grants from the National Clinical Key Specialty Construction Program and the Provincial Natural Science Foundation of Fujian(No.2012J01326),and the Provincial Innovative Foundation of Fujian(No.2012-cx-7)

周冬梅專業(yè)方向為腫瘤病理診斷。

E-mail：fjzdm.2004@126.com