曹文璽 金慧涵 季 沅

江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院肝膽外科，江蘇無錫214002

缺氧對肝癌上皮細(xì)胞E-Cadherin、間質(zhì)細(xì)胞Vimentin表達(dá)的影響

曹文璽 金慧涵 季 沅

江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院肝膽外科，江蘇無錫214002

目的探討缺氧對肝癌上皮細(xì)胞E-Cadherin、間質(zhì)細(xì)胞Vimentin表達(dá)的影響。方法選取人肝癌細(xì)胞系：HepG2（低度侵襲力）、SMMC7721（高度侵襲力），分別置于缺氧條件組與常氧條件組，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后備用。比較肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)及上皮細(xì)胞E-Cadherin、間質(zhì)細(xì)胞Vimentin的Western blot檢測結(jié)果。結(jié)果倒置顯微鏡下觀察，缺氧后的細(xì)胞由原來的緊密排列狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^松散的紡錘體樣改變，細(xì)胞松散。Western blot檢測顯示，缺氧條件下，上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)值較正常（常氧條件）明顯下降（P＜0.01），間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)值明顯升高（P＜0.01）。常氧條件下，肝癌細(xì)胞表現(xiàn)為上皮多角形且排列較為致密。缺氧條件下，肝癌細(xì)胞之間以松散類圓或紡錘體樣連接為主。結(jié)論缺氧將導(dǎo)致肝癌細(xì)胞形態(tài)變化，促使上皮表型蛋白E-Cadherin表達(dá)量下降，間質(zhì)表型蛋白Vimentin表達(dá)量升高，誘發(fā)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

缺氧；肝癌；上皮細(xì)胞E-Cadherin；間質(zhì)細(xì)胞Vimentin

原發(fā)性肝癌（肝癌）的發(fā)生、發(fā)展極其復(fù)雜，作為一種多因素、多基因、多步驟疾病，受到多種細(xì)胞分子干預(yù)。以往的研究已經(jīng)證實(shí)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤病灶發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的重要機(jī)制，參與EMT的各種細(xì)胞因子均在腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮重要作用［1］。其中波形蛋白（Vimentin）作為中間絲蛋白質(zhì)家族最主要的成員之一，在正常間質(zhì)細(xì)胞中有一定的表達(dá)，具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的功能。近年國外學(xué)者提出Vimentin是一種極為重要的EMT因子，其可作為間質(zhì)組織增生與分化的標(biāo)志物而廣受重視［2］。E-Cadherin則作為鈣離子依賴性細(xì)胞間黏附分子，在腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)中起重要作用，以往的研究已經(jīng)證實(shí)其在消化道、泌尿道、口腔組織等惡性腫瘤患者中的表達(dá)水平顯著降低［3］。

在實(shí)體腫瘤患者中，缺氧將導(dǎo)致腫瘤組織的微環(huán)境發(fā)生改變，腫瘤細(xì)胞處于乏氧狀態(tài)，從而導(dǎo)致腫瘤周圍正常細(xì)胞死亡，加速腫瘤組織的浸潤與轉(zhuǎn)移。本研究通過探討缺氧引起肝癌上皮細(xì)胞E-Cadherin、間質(zhì)細(xì)胞Vimentin表達(dá)變化，以期為肝癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立

選取人肝癌細(xì)胞系：HepG2（低度侵襲力）、SMMC7721（高度侵襲力）。均置于含10％小牛血清與1‰雙抗的1640培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃，95％氮?dú)馀c5％ CO2混合氣培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞均勻鋪滿培養(yǎng)瓶基地后進(jìn)行傳代處理。棄上清后經(jīng)清洗、胰酶處理后加入培養(yǎng)液，離心5 min后，再次棄上清，行重懸與分裝，間隔3 d更換培養(yǎng)液。所選取之兩種人肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在胰酶處理后接種在6孔板上，加入去血清1640培養(yǎng)基，后靜置于細(xì)胞缺氧培養(yǎng)罐內(nèi)，缺氧條件組置于氮?dú)鉂舛葹?5％，CO2濃度為5％，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后備用。常氧條件組置于常氧條件下，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后備用。

1.2 肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及上皮細(xì)胞E-Cadherin、間質(zhì)細(xì)胞Vimentin的W estern blot檢測方法

將肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721分別通過倒置顯微鏡對其細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。Western blot檢測則將肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721分別置于常氧與缺氧條件下培養(yǎng)72 h，通過清洗、離心、棄上清，之后加入細(xì)胞裂解液，靜置半小時，于4℃條件下12 000 r/min，離心15 min，取上清液置于-80℃冰箱內(nèi)備用。其中所用兔抗人E-Cadherin多克隆抗體及鼠抗人Vimentin單克隆抗體均以1∶100稀釋，并將其與PDVF膜充分融合，4℃培育12 h，之后將其與羊抗兔/羊抗鼠二抗進(jìn)行1∶4000稀釋，再次與PDVF膜充分融合，室溫條件下孵育60 min，加入發(fā)光劑，至暗室曝光，并與βactin內(nèi)參蛋白進(jìn)行對比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分許數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同條件下肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721中E-Cadherin及Vimentin W estern blot結(jié)果的比較

腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下，肝癌細(xì)胞兩種細(xì)胞的上皮表型蛋白E-Cadherin其表達(dá)量顯著降低，而間質(zhì)表型蛋白Vimentin的表達(dá)量顯著升高。在肝癌細(xì)胞HepG2中，常氧條件下，E-Cadherin蛋白的表達(dá)水平為0.488±0.021，缺氧條件下，E-Cadherin蛋白的表達(dá)水平為0.279±0.030，常氧條件下E-Cadherin蛋白的表達(dá)水顯著高于缺氧條件下（P=0.00029）；常氧條件下，Vimentin蛋白的表達(dá)水平為0.292±0.036，缺氧條件下，Vimentin蛋白的表達(dá)水平為0.566±0.040，常氧條件下Vimentin蛋白的表達(dá)水顯著低于缺氧條件下（P=0.00046）。在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中，常氧條件下E-Cadherin蛋白的表達(dá)水顯著高于缺氧條件下（P=0.00016），常氧條件下Vimentin蛋白的表達(dá)水顯著低于缺氧條件下（P=0.00003）（表1、圖1、圖2）。

表1 不同條件下肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721中E-Cadherin及Vimentin Western blot結(jié)果的比較（pg/m l，±s）

表1 不同條件下肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721中E-Cadherin及Vimentin Western blot結(jié)果的比較（pg/m l，±s）

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圖1 Western blot檢測肝癌細(xì)胞缺氧與否E-Cadherin、Vimentin蛋白含量變化

圖2 缺氧與否兩種肝癌細(xì)胞E-Cadherin、Vim entin蛋白表達(dá)變化A：HepG2；B：SMMC-7721；**P＜0.01

2.2 缺氧與否兩種肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

將HepG2、SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞分別置于常氧與缺氧環(huán)境持續(xù)培養(yǎng)72 h，通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，常氧條件下，肝癌細(xì)胞表現(xiàn)為上皮多角形且排列較為致密。缺氧條件下，肝癌細(xì)胞之間以松散類圓或紡錘體樣連接為主，且胞體相對狹長，細(xì)胞較為分散（圖3～圖6）。

圖3 常氧條件下HepG2細(xì)胞形態(tài)（×400）

圖4 缺氧條件下HepG2細(xì)胞形態(tài)（×400）

圖5 常氧條件下SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)（×400）

圖6 缺氧條件下SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)（×400）

3 討論

以往的研究已經(jīng)證實(shí)，EMT是惡性腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移的最重要因素［4］。在惡性腫瘤發(fā)生EMT過程中，出現(xiàn)許多EMT相關(guān)蛋白的變化，其中上皮表型蛋白E-Cadherin的下調(diào)及間質(zhì)表型蛋白Vimentin的上調(diào)被認(rèn)為是目前最為明顯的標(biāo)志性蛋白［5-6］。同時腫瘤組織的微環(huán)境改變對腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生、發(fā)展亦具有重大影響。缺氧環(huán)境對腫瘤組織的微環(huán)境造成一定影響，導(dǎo)致其細(xì)胞的遷移，進(jìn)而其侵襲性增強(qiáng)，容易出現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時長期的缺氧環(huán)境還會引起正常組織和細(xì)胞死亡，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞所占比例增高，出現(xiàn)腫瘤組織體積增大。

E-Cadherin是上皮細(xì)胞中最為重要的一種黏附分子，在維持上皮細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵性作用，其大量表達(dá)與抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)［7-8］。研究稱在ECadherin蛋白表達(dá)降低甚至缺失時，細(xì)胞間黏附水平降低，在腫瘤組織中易出現(xiàn)向外界的浸潤生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［9］。Vimentin蛋白作為細(xì)胞骨架最為重要的支撐蛋白，主要參與細(xì)胞的生長與分化，并在細(xì)胞游走和遷移過程中發(fā)揮重要作用。大量研究證實(shí)［10-15］，上皮性腫瘤患者中Vimentin蛋白的表達(dá)顯著增加。本組針對E-Cadherin、Vimentin蛋白于缺氧和常氧條件下對比發(fā)現(xiàn)，結(jié)果顯示，缺氧后HepG2和SMMC-7721兩種肝癌細(xì)胞的上皮表型蛋白E-Cadherin表達(dá)量明顯下降，間質(zhì)表型蛋白Vimentin表達(dá)量明顯升高。同時SMMC-7721的EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)量變化較HepG2細(xì)胞更明顯，提示缺氧能顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT［16］，且侵襲性越高其EMT變化越顯著［17］。本研究選取低度侵襲性肝癌HepG2細(xì)胞株與高度侵襲性SMMC-7721肝癌細(xì)胞株，分別置于N2濃度為95％與CO2濃度為5％的缺氧培養(yǎng)罐條件下進(jìn)行缺氧性培養(yǎng)72 h，同時選擇另一組于常氧條件下培養(yǎng)72 h，觀察其形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，常氧條件下，肝癌細(xì)胞表現(xiàn)為上皮多角形且排列較為致密。缺氧條件下，肝癌細(xì)胞之間以松散類圓或紡錘體樣連接為主［18］，且胞體相對狹長，細(xì)胞較為分散［19］，提示缺氧培養(yǎng)72 h，低度侵襲性肝癌HepG2細(xì)胞株與高度侵襲性SMMC-7721肝癌細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)均有一定的改變，且高度侵襲性SMMC-7721肝癌細(xì)胞株形態(tài)改變更最具EMT特征［20］。

綜上所述，缺氧將導(dǎo)致肝癌細(xì)胞形態(tài)變化，促使上皮表型蛋白E-Cadherin表達(dá)量下降，間質(zhì)表型蛋白Vimentin表達(dá)量升高，誘發(fā)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

［1］曾思恩，肖勝軍，張小玲，等.肝細(xì)胞肝癌中轉(zhuǎn)錄輔抑制因子CtBP1與其靶基因E-cadherin的表達(dá)［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2010，26（6）：655-657.

［2］石磊，邵淵，王作仁，等.肝癌中ADAM10、EGFR和E-cadherin的表達(dá)分析及其與臨床病理關(guān)系的研究［J］.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，32（8）：23-29.

［3］Thiery JP，Sleeman JP.Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7（2）：131-142.

［4］黃文慶，楊文理，柴新娟，等.肝癌患者E-cadherin基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的研究［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2011，18（5）：514-519.

［5］Kotoh M.Epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer［J］.Int J Oncol，2005，27（6）：1677-1683.

［6］Halbleib JM，Nelson WJ.Cadherins in development：cell adhesion，sorting，and tissue morphogenesis［J］.Genes Dev，2006，20（23）：3199-3214.

［7］黃建強(qiáng)，常瑞明，溫立強(qiáng)，等.E-cadherin在肝癌組織中的表達(dá)及其對肝癌患者預(yù)后的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2014，36（22）：2301-2304.

［8］Grunert S，Jechlinger M，Beug H.Diverse cellular and molecular mechanisms contribute to epithelial plasticity and metastasis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4（8）：657-665.

［9］隋承光，孟凡東，付立業(yè).MicroRNA-100調(diào)節(jié)mTOR表達(dá)對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23（1）：15-19.［10］曹文璽.缺氧誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肝癌細(xì)胞侵襲力的關(guān)系研究［D］.蘇州：蘇州大學(xué)，2011.

［11］文文.低氧誘導(dǎo)因子-1負(fù)調(diào)控Cyclin D1的分子機(jī)制及其在腫瘤化療抵抗中的作用研究［D］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2009.

［12］許秋然，鄭鑫，昝獻(xiàn)峰，等.膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與Shh、Vimentin、E-cadherin蛋白的相關(guān)性研究［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28（5）：536-543.

［13］Kwon S，Choi KC，Kim YE，et al.Monoclonal antibody targeting of the cell surface molecule TM4SF5 inhibits the growth ofhepatocellular carcinoma［J］.Cancer Res，2014，74（14）：3844-3856.

［14］Yamada S，Okumura N，Wei L，et al.Epithelial to mesenchymal transition is associated with shorter disease-free survival inhepatocellular carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2014，21（12）：3882-3890.

［15］李四光，劉凱歌，常遠(yuǎn)鴻.肝星狀細(xì)胞經(jīng)趨化因子SDF-1/CXCR4軸途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的作用及其機(jī)制［J］.吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2013，39（4）：730-736.

［16］黃小瓊，王偉，孫達(dá)權(quán)，等.肝星形細(xì)胞分泌的趨化因子CXCL1在肝癌轉(zhuǎn)歸中的作用［J］.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2015，37（6）：801-808.

［17］Hayashi Y，Osanai M，Lee GH.NOTCH2 signaling confers immature morphology and aggressiveness in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Oncol Rep，2015，34（4）：1650-1658.

［18］楊穎，馬穎，毛睿，等.高爾基體蛋白73和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)分子在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，38（2）：174-177.

［19］Nagahara T，Shiraha H，Sawahara H，et al.Hepatic stellate cells promote upregulation of epithelial cell adhesion molecule and epithelial-mesenchymal transition in hepatic cancer cells［J］.Oncol Rep，2015，34（3）：1169-1177.

［20］吳暢，劉玉武，何瓊瓊，等.肝細(xì)胞肝癌中uPA及vimentin蛋白的表達(dá)及意義［J］.中國普通外科雜志，2013，22（4）：469-473.

Influence of hypoxia on expressions of E-Cadherin of epithelial cell and Vimentin of interstitial cell from liver cancer

CAO Wen-xi JIN Hui-han JI Yuan
Department of Hepatobiliary Surgery，the Second People′s Hospital of Wuxi City in Jiangsu Province，Wuxi 214002，China

Objective To explore the influence of hypoxia on expressions of E-Cadherin of epithelial cell and Vimentin of interstitial cell from liver cancer.Methods The cell line of human liver cancer including HepG2（low invasiveness）and SMMC7721（strong invasiveness）was selected.They were placed in hypoxia and normoxia conditions respectively. They were prepared for usage after 72-hour cultivation in incubator of 37℃.The morphology of hepatoma carcinoma cell，and Western blot detection outcome of E-Cadherin of epithelial cell and Vimentin of interstitial cell was compared respectively.Results Under inverted microscope，the cells in hypoxia condition changed from original closely aligned to loose spindle like change and cell was loose.Western blot detection indicated that in hypoxia condition，expression value of marked protein E-Cadherin of epithelial cell was greatly decreased compared with normal condition（normal oxygen）（P＜0.01）.The expression value of marked protein Vimentin of interstitial cell was remarkably increased（P＜0.01）.Under normoxia condition，hepatoma carcinoma cell displayed in epithelial polygon and compact arrangement.In hypoxia condition，it was connected in loose quasi-circle or spindle-like between hepatoma carcinoma cells.Conclusion Hypoxia will lead to morphological change，enhance the decrease of epithelial phenotype protein E-Cadherin expression and increase of interstitial protein Vimentin，and induce the transformation from epithelial type to interstitial one in hepatoma carcinoma cell.

Hypoxia；Liver cancer；E-Cadherin of epithelial cell；Vimentin of interstitial cell

R735.7

A

1674-4721（2015）12（b）-0004-04

2015-07-03 本文編輯：許俊琴）

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金面上項目（2011NJ MU114）