王丹丹 史國娟 于顧然

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇南京 210029）

補(bǔ)腎益精方含藥血清對(duì)β-淀粉樣蛋白干預(yù)血腦屏障體外模型滲透性的影響

王丹丹 史國娟 于顧然

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇南京 210029）

目的：以Aβ1-42干預(yù)血腦屏障大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型，評(píng)價(jià)補(bǔ)腎益精方含藥血清對(duì)該模型的滲透性的影響。方法：體外分別培養(yǎng)胚胎鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，鑒定并測(cè)定跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻，利用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)池，建立內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的血腦屏障體外模型，將5μmol/L Aβ1-42加入大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)血腦屏障模型。分為Aβ1-42模型組和Aβ1-42加補(bǔ)腎益精方低、中、高劑量組，另設(shè)血腦屏障空白組，分別檢測(cè)并比較各培養(yǎng)組熒光素鈉的滲透性。結(jié)果：補(bǔ)腎益精方低、中劑量組熒光素鈉的通透性明顯低于Aβ1-42模型組（P＜0.05）。結(jié)論：補(bǔ)腎益精方含藥血清對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的血腦屏障滲透性增加有抑制作用。

補(bǔ)腎益精方含藥血清 腦血管 內(nèi)皮細(xì)胞 星形膠質(zhì)細(xì)胞 血腦屏障 滲透性 體外實(shí)驗(yàn) Wistar乳鼠

阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以進(jìn)行性全面認(rèn)知功能損害為特征的老年變性性疾病，細(xì)胞外老年斑及神經(jīng)元纖維纏結(jié)是其病理學(xué)特征［1］。在該病發(fā)病學(xué)說中，β-淀粉樣蛋白（Aβ）破壞血腦屏障功能是該病發(fā)病的重要機(jī)制［2-3］。針對(duì)該病中醫(yī)發(fā)病機(jī)理，王永炎院士提出了“毒損腦絡(luò)”理論［4］?；贏D中西醫(yī)發(fā)病機(jī)制，我們建立了Aβ干預(yù)的血腦屏障體外模型，探討我們臨床治療阿爾茲海默病常用的補(bǔ)腎益精方含藥血清對(duì)該模型的影響［5-6］。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar乳鼠購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2008001652684，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 主要試劑與耗材Aβ1-42（美國sigma公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國FALCON 353014），青霉素/鏈霉素溶液（Penicillin/streptomycin solution）、0.25%胰蛋白酶（Tripsin-EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO12800-082），F(xiàn)12培養(yǎng)液（美國GIBCO 883684），胎牛血清（FBS，美國ExCell Biology FBS500），24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（24 wellcell culture plate，美國Corning Incorporated 3413），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（96 wellcell culture plate，美國Corning Incorporated 3599），因子Ⅷ（Abcam ab11713），膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP，博士德PB0046），內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ECGS， Sciencell 1052），熒光素鈉（Sigma F6377）。

1.3 主要儀器與設(shè)備超凈工作臺(tái)（中國蘇州凈化SW-CJ-1FD），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO XD-101），生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS IX51），臺(tái)式低速離心機(jī)（中國上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，80-2），多功能酶標(biāo)儀（美國MD M3），電阻儀（美國Millipore公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain capillary endothelial cells，BCECs）培養(yǎng)：無菌條件下取Wistar乳鼠大腦，留皮質(zhì)，將皮質(zhì)剪碎后勻漿，勻漿液依次經(jīng)100目、200目篩網(wǎng)過濾，收集200目濾網(wǎng)上物質(zhì)，向其加入0.1%Ⅱ型膠原酶，37℃作用30min后離心（2000r/min，10min），用完全培養(yǎng)液［DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液+15%FBS+1%（v/v）ECGS+120U/mL肝素］懸浮管底沉淀，吹打均勻后接種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的塑料培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes，As）培養(yǎng)：無菌條件下取Wistar乳鼠大腦，分離大腦皮質(zhì)，將皮質(zhì)剪碎后在0.125%胰蛋白酶中37℃消化10min（期間每隔3min輕搖晃數(shù)次），200目篩網(wǎng)過濾，濾過液以1000r/min，離心2min，管底沉淀用星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液（DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10%FBS）懸浮后，接種于多聚賴氨酸包被的塑料培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞鑒定細(xì)胞培養(yǎng)板中取出長滿腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（或星形膠質(zhì)細(xì)胞）的蓋玻片，浸入4%的多聚甲醛固定液中30min或過夜，PBS浸洗3min×3次。將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復(fù)緩沖液的燒杯中，高火檔至煮沸，將燒杯取出置于電熱器上保持微沸狀態(tài)20min，而后將燒杯浸入流水中，自然冷卻后用PBS浸洗3次。每張切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫（15～25℃）封閉10min，PBS浸洗3次。滴加即用型山羊血清50～100μL，室溫孵育20min；滴加一抗Ⅷ及GFAP（1∶100稀釋）50μL，37℃，濕盒孵育2h，PBS浸洗3次；滴加異硫氰酸熒光素（FITC，1∶200稀釋）二抗50μL，37℃，避光孵育1h，PBS浸洗3次。每張片子滴加配制二脒基苯基吲哚（DAPI）染液50～100μL復(fù)染，室溫避光放置5min，用防萃滅封片膠封片。

2.3 體外血腦屏障模型的建立采用Corning公司的Transwell 3413細(xì)胞培養(yǎng)池（PET膜材，孔徑0.22μm）作為共培養(yǎng)的支持物，建立大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)模型。首先將分離的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)池的上室，將細(xì)胞培養(yǎng)池置于底部含有星形膠質(zhì)細(xì)胞的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)7d后BCEC即可形成致密單層，測(cè)定其電阻。

2.4 跨內(nèi)皮細(xì)胞（BCEC）電阻的測(cè)定通過測(cè)定模型中跨BCEC的電阻值評(píng)價(jià)體外血腦屏障模型中細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)程度。用Millicell-ERS測(cè)定共培養(yǎng)模型的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值（transendothelial electricresistance，TEER），以無細(xì)胞的培養(yǎng)池作為對(duì)照，測(cè)得其電阻值為濾過層的TEER［7］。通過測(cè)定BCEC兩側(cè)的電阻可以評(píng)價(jià)緊密連接形成的程度。大多數(shù)結(jié)果表明，跨細(xì)胞單層電阻值應(yīng)該在300Ω·cm2以上，本實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)模型的電阻值為（320.056±32.833）Ω·cm2，符合體外血腦屏障模型的要求［7］。

2.5 實(shí)驗(yàn)分組與熒光素鈉通透性的測(cè)定補(bǔ)腎益精方含藥血清（簡稱含藥血清）包含菟絲子、蛇床子、覆盆子、楮實(shí)子、熟地黃、人參、茯苓、白術(shù)、海風(fēng)藤、石菖蒲，制備方法參見文獻(xiàn)［6］。實(shí)驗(yàn)分組：空白組（體外血腦屏障模型）、模型組（Aβ1-425μmol/L）、Aβ1-42+補(bǔ)腎益精方低劑量組（Aβ1-425μmol/L+10%含藥血清+20%正常血清+70%培養(yǎng)液）、Aβ1-42+補(bǔ)腎益精方中劑量組（Aβ1-425μmol/L+20%含藥血清+10%正常血清+70%培養(yǎng)液）、Aβ1-42+補(bǔ)腎益精方高劑量組（Aβ1-425μmol/L+30%含藥血清+70%培養(yǎng)液）。首先在供給池中加入200μL含有熒光素鈉10mg/L、不同濃度中藥組分和5μmol/L Aβ的Hanks液，在接受池中加入Hanks液，使插板內(nèi)外液面平行，于10、20、30、40、60min分別從接受池中取200μL溶液，測(cè)定熒光強(qiáng)度，再通過熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算熒光素鈉透過血腦屏障模型及無細(xì)胞對(duì)照組的量。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法計(jì)算各組血腦屏障通透性［7］。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白組比較，Aβ1-42模型組熒光素鈉通透性明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎益精方低、中劑量組熒光素鈉通透性明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組熒光素鈉通透性比較

4 討論

AD是臨床發(fā)病率最高的癡呆類型，針對(duì)其致病毒素Aβ和Tau蛋白開發(fā)的藥物，臨床研究均證明無效，目前該病現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無針對(duì)病因治療的藥物［8］。Aβ破壞血腦屏障功能是該病發(fā)病的重要機(jī)制［2-3］。

補(bǔ)腎益精方是我們依據(jù)元代宮廷醫(yī)家許國禎的《御藥院方》神仙六子丸，并根據(jù)《難經(jīng)》“損其腎者益其精”理論結(jié)合臨床實(shí)踐化裁而成，有補(bǔ)腎益精、健脾化痰、活血化瘀之功效，臨床治療AD取得較好的療效［5］。

本研究通過測(cè)定TEER值評(píng)價(jià)血腦屏障體外模型的完整性。TEER值是反映小離子通透物理屏障的電阻抗，是公認(rèn)的測(cè)定血腦屏障完整性的最精確和最敏感的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎益精方各劑量組對(duì)Aβ1-42引起的血腦屏障破壞有保護(hù)作用，其中中劑量和低劑量的保護(hù)作用更明顯。血腦屏障的通透性是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特征控制的［9］，這些特征與內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等的相互作用有關(guān)，它們統(tǒng)稱為神經(jīng)血管單元，形成了一個(gè)調(diào)節(jié)分子進(jìn)出大腦的功能性屏障［10-12］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益精方含藥血清對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)原代神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷有抑制作用［6］，本實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的血腦屏障破壞有保護(hù)作用，我們推測(cè)補(bǔ)腎益精方含藥血清可能通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞等的完整性而起作用。該方保護(hù)血腦屏障的分子生物學(xué)機(jī)制將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

綜上，補(bǔ)腎活血化痰對(duì)血腦屏障損傷有保護(hù)作用，該方法可延緩或減輕Aβ引起的繼發(fā)損害。另外，該模型可用于阿爾茲海默病有效中藥篩查，為開發(fā)符合中醫(yī)理論的有效方藥提供方便高效的研究平臺(tái)。下一步研究可應(yīng)用該體外模型篩查補(bǔ)腎益精方中有效中藥單體，進(jìn)一步研究中藥對(duì)Aβ誘導(dǎo)血腦屏障組成成分內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)可研究中藥對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞膜Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響，以明確中藥保護(hù)血腦屏障的靶點(diǎn)。

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R241.1

A

1672-397X（2015）10-0072-03

王丹丹（1990—），女，碩士研究生，神經(jīng)內(nèi)科學(xué)專業(yè)。

于顧然，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。dr.ygrdf@163.com

2015-06-04

編輯：吳寧

國家自然科學(xué)基金資助（81573771）；江蘇省自然科學(xué)基金資助（BK20151599）；江蘇省中醫(yī)藥局基金資助（LZ13027）