邱玲，錢俊佳，康振，陳堅(jiān)

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；3.希森美康生物科技無錫有限公司，江蘇無錫214028；4.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

乙肝表面抗原在釀酒酵母中的異源表達(dá)

邱玲1，2，錢俊佳3，康振1，2，陳堅(jiān)*2，4

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；3.希森美康生物科技無錫有限公司，江蘇無錫214028；4.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

乙肝表面抗原HBsAg是乙肝疫苗的主要組分。從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平以及翻譯后水平對其進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了HBsAg在重組釀酒酵母中的高效異源表達(dá)。與組成型啟動(dòng)子TEF1、TDH3、HXT7、ADH1相比，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1可大幅度提高HBsAg的表達(dá)；與GCCACC和AAAAAA相比，kozak序列TACACA最有利于HBsAg的翻譯表達(dá)；而共表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶pdi對HBsAg的活性表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用。通過3種水平的優(yōu)化，HBsAg活性從最初的8.87 IU/g提高至151.08 IU/g；最終，利用Ni柱親和層析成功獲得純化的HBsAg，活性為3.32 IU/mL。

釀酒酵母；乙肝表面抗原；啟動(dòng)子；kozak序列；共表達(dá)

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）屬致癌性病毒，嚴(yán)重危害人類的健康，HBV感染會(huì)引起急、慢性病毒性肝炎，其感染性強(qiáng)、攜帶率高、流行面廣、慢性化傾向嚴(yán)重，更有部分感染者會(huì)發(fā)生肝硬化和肝細(xì)胞癌［1］。目前尚無特異性藥物可完全控制其傳染和流行暴發(fā)，預(yù)防和控制乙肝病毒感染最有效的方法是接種乙肝疫苗［2-4］。乙肝疫苗的主要有效成分為乙肝表面抗原（Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg），HBsAg由HBV S基因編碼［5］，是在HBV增殖過程中產(chǎn)生的包膜蛋白質(zhì)，是HBV的主要特征抗原，具有與天然病毒相近的抗原表位，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體而預(yù)防HBV感染。

乙型肝炎疫苗的研制先后經(jīng)歷了血源性疫苗和基因工程疫苗階段，血源性乙肝疫苗因血源供應(yīng)有限且具有潛在的危險(xiǎn)性，已逐步被基因工程疫苗所取代。目前基因工程乙肝疫苗技術(shù)已相當(dāng)成熟，而釀酒酵母生物安全性好，具有真核細(xì)胞的翻譯后修飾功能，工藝成熟，成本低，因而非常適合重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，已成為制備重組乙肝疫苗的主要系統(tǒng)之一。早在1981年美國科學(xué)家Rutter首先在釀酒酵母中成功表達(dá)了rHBsAg［6］。隨后1982年Valenzuela等［7］利用酵母乙醇脫氫酶（ADH）啟動(dòng)子成功實(shí)現(xiàn)了adw亞型的HBsAg基因在釀酒酵母中的表達(dá)。近年來，已有很多釀酒酵母表達(dá)乙肝疫苗的研究報(bào)道，但釀酒酵母表達(dá)HBsAg的水平并不高。因此，研究有效提高HBsAg表達(dá)水平的方法，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

一般來說，外源基因在酵母中的表達(dá)與基因的轉(zhuǎn)錄水平有密切的關(guān)系，所以選擇轉(zhuǎn)錄活性較優(yōu)、強(qiáng)度較高的啟動(dòng)子對基因的高效表達(dá)十分重要。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)常用的啟動(dòng)子分為組成型和誘導(dǎo)型兩種，這兩種啟動(dòng)子各有利弊，針對不同的目標(biāo)產(chǎn)物和表達(dá)體系，選擇適配的啟動(dòng)子需要進(jìn)一步的探究。Yocum等［8-9］研究表明，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1的調(diào)控活性強(qiáng)于GAL10。Siavash Partow等［10］通過檢測β-半乳糖苷酶的表達(dá)量考察了釀酒酵母中較常見的組成型和誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子（TEF1、TPI1、HXT7、 PGK1、PYK1、GAL1、GAL10、TDH3、ADH1）的強(qiáng)度和活力，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子TEF1、TDH3在發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖尚未耗盡時(shí)調(diào)控強(qiáng)度最大，葡萄糖耗盡時(shí)TEF1、HXT7的調(diào)控強(qiáng)度最大，而啟動(dòng)子ADH1適合高葡萄糖濃度下的調(diào)控。本研究中選用釀酒酵母中較為常見的4種組成型強(qiáng)啟動(dòng)子（TEF1、TDH3、HXT7、ADH1）及廣泛應(yīng)用的誘導(dǎo)性強(qiáng)啟動(dòng)子GAL1來分別表達(dá)HBsAg并進(jìn)行比較。

蛋白質(zhì)的翻譯也是基因表達(dá)過程中的關(guān)鍵步驟。Kozak序列是存在于真核生物mRNA上AUG側(cè)翼的一段序列，能夠被核糖體識別并作為翻譯起始位點(diǎn)，對應(yīng)于原核生物的SD序列。因此在酵母中表達(dá)基因時(shí)，一般可在基因的N端添加kozak序列［11-12］，以增強(qiáng)基因的翻譯效率，有效提高基因的表達(dá)。參照Kozak［13］提出的真核生物偏好的轉(zhuǎn)移起始密碼子周邊序列，本研究中選取GCCACC序列（記為k）通過引物添加于HBsAg序列上游的-1到-6位；根據(jù)Robert Hamilton針對釀酒酵母kozak序列的報(bào)道［14］，另選用TACACA序列（記為yk）及AAAAAA序列（記為kk），從而考察不同kozak序列對HBsAg表達(dá)的影響。

對于大多數(shù)蛋白質(zhì)，多肽鏈翻譯后還要進(jìn)行不同方式的加工修飾才具有生理功能，其中，二硫鍵的形成是蛋白質(zhì)折疊過程中的限速步驟，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和保持其活性功能有極其重要的作用［15］。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）是真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的一種多功能蛋白質(zhì)，能催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成、還原或異構(gòu)化，還具有抑制錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集的分子伴侶活性［16］。PDI在蛋白質(zhì)折疊和分泌的過程中起重要的作用，F(xiàn)reedman等認(rèn)為，PDI通過形成正確的鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵，進(jìn)而使蛋白質(zhì)正確地折疊，形成正確的空間構(gòu)象［15，17］。Robinson等［17］發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)pdi可以使人血小板導(dǎo)出生長因子B二聚體在釀酒酵母中的分泌量提高10倍。Smith等［18］在釀酒酵母中表達(dá)葡萄糖苷酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用基因工程手段增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的分子伴侶BIP和PDI的量，可以提高表達(dá)量。研究表明，酵母中pdi的過量表達(dá)能大幅度提高外源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平及分泌量，尤其是含較多二硫鍵的蛋白質(zhì)。而HBsAg是具有8對二硫鍵的復(fù)雜蛋白質(zhì)，故本研究中將pdi和HBsAg進(jìn)行共表達(dá)。

本研究中利用組成型啟動(dòng)子TEF1在釀酒酵母中成功表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原，并通過篩選強(qiáng)啟動(dòng)子、優(yōu)化kozak序列及共表達(dá)二硫鍵，輔助蛋白質(zhì)PDI分別從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平及翻譯后加工水平有效提高HBsAg的表達(dá)。

1　材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

相關(guān)質(zhì)粒和菌株見表1，Escherichia coli JM109用于重組質(zhì)粒的保存和增殖，Saccharomyces cerevisiae INVscI作為HBsAg表達(dá)的宿主。

表1　菌株和質(zhì)粒Table 1　Strains and plasmids used in this study

1.2試劑

PCR引物（見表2），由生工生物上海有限公司合成；質(zhì)粒提取試劑盒，購自生工生物上海有限公司；Prime Star DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶，DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，DNA凝膠回收試劑盒，感受態(tài)制備試劑盒，均購自寶生物大連有限公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，購自碧云天（Beyotime）公司；酵母基因組提取試劑盒，購自上海杰美基因（GENMED）公司。YNB、半乳糖、氨芐青霉素、卡那霉素、咪唑及其他常用試劑，均為國產(chǎn)分析純。

表2　引物Table 2　Primers used in this study

續(xù)表2

1.3培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani Medium）培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，氯化鈉10；pH 7.0～7.2。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂粉。

YNB（Yeast Nitrogen Base）選擇性培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，硫酸銨1.7，YNB 5；pH 5.5。添加過濾除菌的亮氨酸、組氨酸、色氨酸至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

YPDG（Yeast Extract Peptone Dextrose Galactose）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉10，胰蛋白胨20，葡萄糖20，半乳糖33；pH 5.5。

1.4HBsAg重組表達(dá)載體的構(gòu)建

HBsAg主蛋白質(zhì)由S區(qū)編碼，由226個(gè)氨基酸組成。按照酵母密碼子偏好性對S區(qū)基因序列（Genbank：AF504292.1）進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成基因（金斯瑞生物科技），所得質(zhì)粒pUC57-sAg含有完整的HBsAg編碼序列（681 bp），在其C端添加有6×His純化標(biāo)簽，并在上下游分別添加BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。

用BamHI和EcoRI酶切質(zhì)粒pUC57-sAg得sAg片段，經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，分別與經(jīng)相同酶切及純化的載體pTEF1、pTDH3、pHXT7、pADH1及pYES2進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，再經(jīng)酶切驗(yàn)證及上海生工生物公司測序驗(yàn)證，獲得含有不同啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pTEF1-sAg、pTDH3-sAg、pHXT7-sAg、pADH1-sAg及pGAL1-sAg。如圖1所示。

使用引物（ksAg_F、yksAg_F、kksAg_F及sAg_R）分別克隆出含不同kozak序列的ksAg、yksAg及kksAg片段，經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切及純化后，與經(jīng)相同酶切及純化的載體pYES2進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，再經(jīng)酶切及測序驗(yàn)證，獲得含有不同kozak序列的重組質(zhì)粒pGAL1-ksAg、pGAL1-yksAg、pGAL1-kksAg。

圖1　BamHI和EcoRI雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒Fig.1　Confirmation of recombinant plasmids by BamHI and EcoRI digestion

在質(zhì)粒pGAL1-yksAg的基礎(chǔ)上構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒（見圖2），利用引物pGAL1_F、pGAL1_R和tCYC1_F、tCYC1_R從質(zhì)粒pYES2克隆獲得pGAL1（474 bp）和tCYC1（259 bp）片段，連接至pGAL1-yksAg獲得具有兩個(gè)表達(dá)框的二價(jià)表達(dá)載體pGAL1-yksAg-PT。使用引物pdi_F、pdi_R從P.pastoris GS115基因組擴(kuò)增得二硫鍵異構(gòu)酶基因pdi，經(jīng)NotI和XbaI雙酶切及PCR純化試劑盒純化，與經(jīng)相同酶切及純化的載體pGAL1-yksAg-PT進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，再經(jīng)酶切及測序驗(yàn)證，獲得pdi共表達(dá)質(zhì)粒pGAL1-yksAg-pdi。

1.5酵母轉(zhuǎn)化及重組菌發(fā)酵

按照Invitrogen公司提供的LiAc/SS-DNA/PEG法制作釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，涂布于含所需氨基酸的YNB選擇性平板，獲得的酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR檢驗(yàn)。50 μL反應(yīng)體系如下：Taq DNA聚合酶1 μL，10×loading buffer 5 μL，mix dNTP 4 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

圖2　共表達(dá)質(zhì)粒pGAL1-yksAg-pdi的構(gòu)建Fig.2　Construction of pGAL1-yksAg-pdi for co-expression

挑取菌落PCR呈陽性的酵母轉(zhuǎn)化子接種于YNB液體培養(yǎng)基，于30℃200 r/min培養(yǎng)36～39 h，按體積分?jǐn)?shù)10%接種量轉(zhuǎn)接至YPD（含啟動(dòng)子TEF1、TDH3、HXT7、ADH1的重組菌）或YPDG（含誘導(dǎo)啟動(dòng)子GAL1的重組菌）培養(yǎng)基，28℃200 r/ min培養(yǎng)70 h［19］。發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體，經(jīng)洗滌后懸浮于PBS緩沖液（pH 7.5），在低溫條件下利用玻璃珠進(jìn)行酵母細(xì)胞破碎，于4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液即為胞內(nèi)樣品，加入PMSF至終濃度為1 mmol/L，以防止蛋白質(zhì)水解酶降解，4℃保存。

1.6HBsAg活性檢測及HBsAg的純化

使用希森美康生物科技（無錫）有限公司的Sysmex HISCL-2000i全自動(dòng)免疫分析儀和配套試劑測定HBsAg活性。所用HISCL HBsAg校準(zhǔn)品溯源至WHO standard 00/588。

重組HBsAg在C端添加有6×His純化標(biāo)簽，可采用Ni柱親和層析進(jìn)行初步純化。鎳離子柱His_Trap_FF_crude，1 mL Global（90 μm），按Novagen公司Ni.NTAHis·BindResin說明書提供的方法進(jìn)行純化。純化后的蛋白質(zhì)樣品液進(jìn)行HBsAg活性檢測和SDS-PAGE分析。

2　結(jié)果與討論

2.1重組表達(dá)載體的鑒定及重組菌構(gòu)建

重組表達(dá)質(zhì)粒pTEF1-sAg、pTDH3-sAg、pHXT7-sAg、pADH1-sAg、pGAL1-sAg經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，均獲得約0.7 kb大小片段，對應(yīng)于sAg片段的大?。▓D1（a））。重組表達(dá)質(zhì)粒pGAL1-ksAg、pGAL1-yksAg、pGAL1-kksAg經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，均獲得約0.7 kb大小片段，對應(yīng)于ksAg、yksAg、kksAg片段的大小（圖1（b））。重組表達(dá)質(zhì)粒pGAL1-yksAg-pdi（構(gòu)建過程見圖2）經(jīng)NotI和XbaI雙酶切，獲得約1.6 kb大小片段，對應(yīng)于pdi片段的大?。▓D2（c））。結(jié)果表明，HBsAg的重組表達(dá)質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

重組表達(dá)質(zhì)粒pTEF1-sAg、pTDH3-sAg、pHXT7-sAg、pADH1-sAg、pGAL1-sAg轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，獲得相應(yīng)重組菌，分別命名為TEF1-sAg、TDH3-sAg、HXT7-sAg、ADH1-sAg、GAL1-sAg。將重組質(zhì)粒pGAL1-ksAg、pGAL1-yksAg、pGAL1-kksAg成功轉(zhuǎn)化釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，獲得相應(yīng)重組酵母菌，分別命名為ksAg、yksAg及kksAg。共表達(dá)質(zhì)粒pGAL1-yksAg-pdi轉(zhuǎn)化釀酒酵母獲得重組菌，命名為yksAg-pdi。

2.2篩選啟動(dòng)子強(qiáng)化HBsAg表達(dá)

Partow的報(bào)道中，啟動(dòng)子TEF1的調(diào)控強(qiáng)度大而且穩(wěn)定，本研究中將啟動(dòng)子TEF1應(yīng)用于HBsAg的表達(dá)。TEF1-sAg重組菌經(jīng)發(fā)酵細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)9.14 g/L（pTEF1空質(zhì)粒對照菌株干質(zhì)量為9.96 g/ L），可見表達(dá)HBsAg對菌株生長有一定的不利影響。TEF1-sAg重組菌發(fā)酵樣品HBsAg活性為8.87 IU/g，表明在釀酒酵母中，采用啟動(dòng)子TEF1能成功表達(dá)HBsAg，且產(chǎn)物具有免疫活性。

基因最終的表達(dá)效果直接受啟動(dòng)子的強(qiáng)弱及適配性的影響，因此選擇合適的強(qiáng)啟動(dòng)子至關(guān)重要。為了篩選適合表達(dá)HBsAg的啟動(dòng)子，將啟動(dòng)子TEF1、TDH3、HXT7、ADH1及GAL1進(jìn)行比較。TEF1-sAg、TDH3-sAg、HXT7-sAg、ADH1-sAg及GAL1-sAg重組菌的HBsAg活性分別為8.87、43.25、12.94、10.61 IU/g及46.45 IU/g（圖3）。表明在釀酒酵母中采用TEF1、TDH3、HXT7、ADH1及GAL1 5種啟動(dòng)子均能成功表達(dá)HBsAg，且產(chǎn)物具有免疫活性。其中，采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1時(shí) HBsAg活性最高（46.45 IU/g），較TEF1啟動(dòng)子提高了4.23倍；其次為組成型啟動(dòng)子TDH3，較TEF1提高了3.87倍。

圖3　采用不同啟動(dòng)子表達(dá)HBsAgFig.3　Expression of HBsAg under different promoters

本研究中，采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1來表達(dá)HBsAg相對更為適合，因?yàn)楫a(chǎn)物HBsAg對細(xì)胞生長會(huì)產(chǎn)生一定不利影響，而誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可將細(xì)胞生長與產(chǎn)物積累分開，即在GAL1啟動(dòng)子關(guān)閉時(shí)細(xì)胞利用葡萄糖正常生長，當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)啟動(dòng)子被激活開始表達(dá)下游基因，而此時(shí)細(xì)胞已生長到一定密度，產(chǎn)物HBsAg對酵母細(xì)胞生長的影響已經(jīng)不明顯，從而避免了產(chǎn)物積累對細(xì)胞原有代謝平衡及細(xì)胞生長的不利影響。Siavash Partow［10］在以β-半乳糖苷酶為報(bào)告基因的研究中，啟動(dòng)子TEF1與TDH3在葡萄糖尚未耗盡時(shí)的調(diào)控強(qiáng)度大體相同；在Sun等［20］的研究中，啟動(dòng)子的強(qiáng)度TEF1＞TDH3；本研究中，在表達(dá)HBsAg時(shí)，啟動(dòng)子強(qiáng)度GAL1＞TDH3＞HXT1＞ADH1＞TEF1，啟動(dòng)子TDH3較TEF1提高了3.87倍。可見，對于不同的目標(biāo)產(chǎn)物及表達(dá)體系，適配的啟動(dòng)子不能一概而論。

2.3優(yōu)化kozak序列提高HBsAg表達(dá)

Kozak序列是能提高基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)上游調(diào)控元件，它的存在將有利于翻譯的起始。因此通過添加不同的kozak序列改變AUG周邊序列組成，可以影響基因的翻譯，從而調(diào)控基因的表達(dá)。本研究中選取了GCCACC（k）、TACACA（yk）及AAAAAA（kk）3種kozak序列添加至HBsAg基因上游，構(gòu)建不同重組表達(dá)載體及相應(yīng)重組菌。

將ksAg、yksAg及kksAg重組菌株進(jìn)行發(fā)酵后，HBsAg活性分別為58.05、63.67 IU/g及59.47 IU/g（圖4），表明GCCACC（k）、TACACA（yk）以及AAAAAA（kk）3種kozak序列均能促進(jìn)HBsAg的表達(dá)，分別使HBsAg活性提高了25%、37%及28%（與GAL1-sAg對照菌株相比），可見TACACA（yk）序列最有利于HBsAg的表達(dá)。

圖4　不同kozak序列對HBsAg表達(dá)的影響Fig.4　Expression of HBsAg with different kozak sequences

2.4共表達(dá)pdi促進(jìn)HBsAg表達(dá)

HBsAg共有14個(gè)半胱氨酸殘基（Cys），并以Cys的二硫鍵形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)［21］，故加速二硫鍵的形成對HBsAg的折疊及活性都極為重要。而蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶PDI能催化蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的形成。本研究中從酵母基因組克隆得pdi基因與HBsAg進(jìn)行共表達(dá)。

將yksAg-pdi重組菌進(jìn)行發(fā)酵后，HBsAg活性達(dá)151.08 IU/g（圖5），與yksAg對照菌相比提高了1.37倍，表明共表達(dá)pdi能明顯促進(jìn)HBsAg的表達(dá)。Inan等［22］發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)pdi能使Na-SPl在畢赤酵母中的表達(dá)量顯著提高。Moralejo等［23］研究表明，甜蛋白質(zhì)分泌表達(dá)量與pdi基因的表達(dá)水平存在相關(guān)性，當(dāng)pdi表達(dá)水平提高2～4倍，甜蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高5倍。

yksAg-pdi重組菌綜合了啟動(dòng)子、kozak序列以及PDI的有利影響，使HBsAg的表達(dá)活性提高了16倍。基于C端的6×His純化標(biāo)簽，對此菌株表達(dá)的重組HBsAg進(jìn)行Ni柱親和層析，在含300 mmol/L咪唑的洗脫條件下獲得電泳純的樣品（HBsAg活性3.32 IU/mL）。圖5（b）所示純化的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約35 000，較HBsAg的24 000未糖基化形式及27 000糖基化形式［24］都偏大；但釀酒酵母作為宿主易使表達(dá)的外源蛋白質(zhì)過度糖基化，而HBsAg糖基化位點(diǎn)在第146位的天冬酰胺（Asn）殘基，分析35 000處蛋白質(zhì)即為過糖基化的目的產(chǎn)物HBsAg。

圖5　共表達(dá)pdi對HBsAg表達(dá)的影響Fig.5　Co-expression of pdi and HBsAg

3　結(jié)語

在釀酒酵母中，采用組成型啟動(dòng)子TEF1成功表達(dá)乙肝表面抗原，活性為8.87 IU/g。為了從轉(zhuǎn)錄水平提高HBsAg的表達(dá)，比較了組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ADH1、HXT7、TEF1、TDH3及誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子GAL1。結(jié)果表明，采用后者使HBsAg活性提高了4.23倍（46.45 IU/g）。為了增強(qiáng)HBsAg的翻譯，促進(jìn)表達(dá)，考察了GCCACC、TACACA及AAAAAA 3種kozak序列對HBsAg表達(dá)的影響。結(jié)果表明，3種序列均有利于HBsAg的表達(dá)，TACACA序列效果最明顯（63.67 IU/g），使HBsAg表達(dá)提高了37%。為了從翻譯后水平促進(jìn)HBsAg的表達(dá)，將二硫鍵異構(gòu)酶pdi與HBsAg進(jìn)行共表達(dá)，使得HBsAg活性進(jìn)一步提高1.37倍（151.08 IU/g）。

綜上所述，通過篩選啟動(dòng)子、優(yōu)化kozak序列，以及共表達(dá)pdi，分別從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、翻譯后水平進(jìn)行優(yōu)化，使HBsAg活性由8.87 IU/g提高至151.08 IU/g，提高了16倍。本研究結(jié)果表明，選擇合適的啟動(dòng)子對HBsAg的表達(dá)至關(guān)重要，而共表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶pdi的促進(jìn)作用也很明顯，因?yàn)镠BsAg富含二硫鍵。利用其他的二硫鍵輔助蛋白質(zhì)促進(jìn)HBsAg表達(dá)，則有待進(jìn)一步深入研究。

［1］Miyanohara A.Expression of hepatitis B surface antigen gene in yeast［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1983，80（1）：1-5.

［2］Liu R.Optimization of fermentation conditions for maximal recombinant hepatitis B surface antigen particle production in Pichia pastoris［J］.Bioengineering，2008，24（12）：98-105.

［3］Tiollais P，Buendia M A.Hepatitis B virus［J］.Sci Am，1991，264（4）：116-123.

［4］成軍，楊守純.現(xiàn)代肝炎病毒分子生物學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：25-42.

［5］Krugman S，Giles J P，Hammond J.Hepatitis virus：Effect of heat on the infectivity and antigenicity of the MS-1 and MS-2 strains［J］.J Infect Dis，1970，122（5）：432-436.

［6］Rutter W J.Control of transcription in eukaryotes：summary［J］.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1981，26：171-178.

［7］Valenzuela P.Synthesis and assembly of hepatitis B virus surface antigen particles in yeast［J］.Nature，1982，298（5872）：347-350.

［8］Yocum R R.Use of lacZ fusions to delimit regulatory elements of the inducible divergent GAL1-GAL10 promoter in Saccharomyces cerevisiae［J］.Mol Cell Biol，1984，4（10）：1985-1998.

［9］West R，Jr W.GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences［J］.Genes Dev，1987，1（10）：1118-1831.

［10］Partow S.Characterization of different promoters for designing a new expression vector in Saccharomyces cerevisiae［J］.Yeast，2010，27（11）：955-964.

［11］Outten C E，Culotta V C.Alternative start sites in the Saccharomyces cerevisiae GLR1 gene are responsible for mitochondrial and cytosolic isoforms of glutathione reductase［J］.Journal of Biological Chemistry，2004，279（9）：7785-7791.

［12］Stuart J A.Physiological levels of mammalian uncoupling protein 2 do not uncouple yeast mitochondria［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276（21）：18633-18639.

［13］Kozak M.Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation［J］.J Biol Chem，1991，266（30）：19867-19870.

［14］Hamilton R，Watanabe C K，de Boer H A.Compilation and comparison of the sequence context around the AUG startcodons in Saccharomyces cerevisiae mRNAs［J］.Nucleic Acids Res，1987，15（8）：3581-3593.

［15］Freedman R B.Protein disulfide isomerase：Multiple roles in the modification of nascent secretory proteins［J］.Cell，1989，57（7）：1069-1072.

［16］Wilkinson B，Gilbert H F.Protein disulfide isomerase［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1699（1-2）：35-44.

［17］Robinson A S，Hines V，Wittrup K D.Protein disulfide isomerase overexpression increases secretion of foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnology，1994，12（4）：381-384.

［18］Smith J D，Robinson A S.Overexpression of an archaeal protein in yeast：secretion bottleneck at the ER［J］.Biotechnol Bioeng，2002，79（7）：713-723.

［19］Kim E J.Expression of hepatitis B surface antigen S domain in recombinant Saccharomyces cerevisiae using GAL1 promoter［J］.J Biotechnol，2009，141（3-4）：155-159.

［20］Sun J.Cloning and characterization of a panel of constitutive promoters for applications in pathway engineering in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biotechnol Bioeng，2012，109（8）：2082-2092.

［21］Wampler D E.Multiple chemical forms of hepatitis B surface antigen produced in yeast［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1985，82（20）：6830-6834.

［22］Inan M.Enhancement of protein secretion in Pichia pastoris by overexpression of protein disulfide isomerase［J］.Biotechnol Bioeng，2006，93（4）：771-778.

［23］Moralejo F.A defined level of protein disulfide isomerase expression is required for optimal secretion of thaumatin by Aspergillus awamori［J］.Molecular Genetics and Genomics，2001，266（2）：246-253.

［24］李河民，汪和睦.基因工程乙肝新型疫苗（漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)）的開發(fā)［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2001，29（3）：47-54.

LI Hemin，WANG Hemu.Development of new hepatitis vaccine for gene engineering［J］.Progress in Microbiology and Immunology，2001，29（3）：47-54.（in Chinese）

Heterologous Expression of HBsAg in Saccharomyces Cerevisiae

QIU Ling1，2，QIAN Junjia3，KANG Zhen1，2，CHEN Jian2，4
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Sysmex Biotech Co.，Ltd.in Wuxi，Wuxi214028，China；4.NationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Hepatitis B surface antigen（HBsAg）is a major component of the hepatitis B vaccine.In the present work，we achieved its high efficient heterologous expression in the recombinant Saccharomycescerevisiaebyoptimizationatthreelevels：transcription，translationand post-translation.Compared with the constitutive promoters TEF1，TDH3，HXT7 and ADH1，the inducible promoter GAL1 substantially increased the expression of HBsAg.Moreover，compared with GCCACC and AAAAAA，the kozak sequence TACACA is more beneficial to the translation and active expression of HBsAg.More importantly，co-expression of protein disulfide isomerase（PDI）also significantly increased the expression of HBsAg.Through three levels of optimizations，the activity of recombinant HBsAg was increased from 8.87 IU/g CDW to 151.08 IU/g CDW. Finally，applying the Ni column affinity chromatography，we successfully obtained the purifiedHBsAg with an activity of 3.32 IU/mL.

Saccharomyces cerevisiae，HBsAg，promoter，kozak sequence，co-expression

Q 753

A

1673—1689（2015）09—0906—08

2014-02-28

國家863計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011AA100905）；教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT1135）；國家博士后基金面上項(xiàng)目（2013 M540414）；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項(xiàng)目。

陳堅(jiān)（1962—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶技術(shù)、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制研究。E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn