徐　莉，禤開智，紀少凡，符靈梅，蔣林蓉

（海南省出入境檢驗檢疫局技術中心，海南?？?70311）

UPC2快速測定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸含量研究

徐莉，禤開智，紀少凡，符靈梅，蔣林蓉

（海南省出入境檢驗檢疫局技術中心，海南海口570311）

建立了超高效合相色譜法（Ultra Performance Convergence Chromatography，UPC2）分離和測定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸的方法。超高效合相色譜（UPC2）技術集合超臨界流體色譜（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）和超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLCTM）的技術優(yōu)點，流動相CO2為主體，0.1%磷酸甲醇為助溶劑。選用Waters BEH色譜柱，流速1.5 mL/min，檢測波長為245 nm，方法檢出限為2.0 mg/kg，定量限為6.0 mg/kg，線性范圍為2.5～80.0 mg/L；加標回收率范圍為93.2%～105.9%；相對標準偏差RSD為4.5%～9.8%，該方法操作便捷、檢測速度快、準確性高、重復性好、節(jié)約成本，能夠滿足葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸的檢測。

超高效合相色譜，葡萄酒，抗壞血酸，異抗壞血酸

抗壞血酸是人體必需的主要維生素之一，能夠保持肌膚潤滑、防止衰老、抗壞血癥等。異抗壞血酸是它的同分異構體，其抗氧化能力較強，多作為食品抗氧化劑和肉類的防腐助色劑，但在耐熱性和抗壞血病等活性方面弱于后者。異抗壞血酸不僅在人體代謝過程中可能會與抗壞血酸發(fā)生競爭作用，從而影響人體對抗壞血酸的吸收及生理營養(yǎng)作用的發(fā)揮，而且攝入過多也會導致身體的多種不適，如白細胞抗病能力下降、尿酸、結石、皮疹等［1］。

基于上述兩種物質(zhì)的抗氧化特性，在葡萄酒生產(chǎn)過程中，抗壞血酸或異抗壞血酸鹽可與二氧化硫聯(lián)合使用，以控制葡萄酒在貯存期間發(fā)生非酶促氧化反應［2］。異抗壞血酸作為葡萄酒的使用添加劑，其使用限量為0.15 g/kg。目前國內(nèi)報道的檢測方法如熒光法、比色法和滴定法，均只能測定兩種物質(zhì)的總量［3-4］；而液相色譜法大部分則為直接提取后采用不同的色譜柱如C18、C8、Hilic等或改變流動相檢測［5-9］，但分離效果不佳且分析時間長、基質(zhì)干擾大。本文擬探討建立的超高效合相色譜（UPC2）國內(nèi)尚未報道。該方法與其他方法相比不僅具有有機溶劑的使用量少，前處理操作簡便，靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析速度快等優(yōu)點［10-13］，還能避免由于葡萄酒中天然存在的抗壞血酸干擾造成難以對食品添加劑異抗壞血酸含量的準確定量。因此，本實驗通過考察超高效合相色譜分離上述兩種目標物的影響因素，為口岸進出口葡萄酒質(zhì)量監(jiān)管提供一種準確、可靠、快速、節(jié)約型測定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸的分離分析方法。

1　實驗部分

1.1材料與儀器

甲醇、乙腈、磷酸（色譜純） TEDIA公司；CO2（純度99.997%） 海南嘉騰氣體有限公司；抗壞血酸、異抗壞血酸均購自百靈威公司，純度均≥99.0%。

超高效合相色譜儀配有Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司；MS3 digital旋渦混合器德國IKA公司；320R冷凍離心機UNIVERSAL公司；移液槍美國Thermo Electron公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制標準貯備液：分別準確稱取0.1g抗壞血酸和異抗壞血酸標準品，用含0.1%磷酸的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液定容至10mL，搖勻，配制成1.0mg/mL混合標準儲備液，0～4℃保存。

1.2.2超高效合相色譜條件色譜柱：Waters BEH 3.0 mm×100 mm 1.7 μm；柱溫35℃；流動相A：CO2，B：0.1%磷酸甲醇；等度洗脫條件：CO2+0.1%磷酸甲醇（9+1）；流速1.5 mL/min；進樣量2 μL；檢測波長245 nm；動態(tài)背壓（ABPR）1800 Psi。

1.2.3高效液相色譜條件色譜柱：Waters Hilic 2.1 mm×100 mm 1.7 μm；柱溫35℃；流動相：0.1%磷酸水溶液+乙腈（1+9）；流速：0.3 mL/min；進樣量5 μL；檢測波長245 nm。

1.2.4樣品前處理稱取2.5 g葡萄酒試樣（精確至0.001 g），置于50 mL具塞試管中，加入甲醇（含0.1%磷酸）-水（8∶2，V/V）溶液定容至25 mL，均質(zhì)5 min，高速冷凍離心機于4℃下以12000 r/min離心10 min，取離心后液體1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，直接進樣分離分析。

2　結果與討論

2.1液相色譜法與超高效合相色譜法的比較

基于抗壞血酸和異抗壞血酸具有弱酸性，易溶于水且不穩(wěn)定的特性，測定目標物時多采取流動相比例直接提取的方式，從而避免測定物質(zhì)氧化降解。為了考察超效合相色譜法在測定葡萄酒基質(zhì)中的優(yōu)越性，本實驗將文獻報道的0.1%磷酸水溶液提取高效液相色譜法測定與UPC2法進行比較發(fā)現(xiàn)，前者用于葡萄酒的檢測不可行，兩種目標物的標樣分離度較佳，樣品檢測時卻出現(xiàn)基質(zhì)干擾、包峰、拖尾等現(xiàn)象，無法進行準確定量，如圖1所示。這可能是由于葡萄酒基質(zhì)中存在酒精所產(chǎn)生的溶劑效應。因此，實驗利用超高效合相色譜超臨界流體的特點建立提取液直接上機的方法測定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸?？紤]到UPC2系統(tǒng)對樣品中含水量要求，本實驗最終采用甲醇和水按8∶2比例直接提取上機測定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸的含量。

2.2流速及進樣量的選擇

超臨界CO2作為流動相兼有氣體的低粘度，液體的高密度，以及介于氣液體之間的擴散系數(shù)特征，分離過程可具有較高的線速度，因此流速和進樣量的選擇對待測物質(zhì)檢測的影響較大。本實驗采用亞2 μm填料色譜柱，選取流速在1.2～2.0 mL/min以及進樣量在1.0～5.0 μL范圍內(nèi)進行優(yōu)化：流速過高，峰形好但長時間易造成儀器系統(tǒng)超壓；進樣量過大，峰形寬且塌陷從而影響兩種目標物的分離效果。綜合考慮，實驗設定流速為1.5 mL/min、進樣量為2.0 μL時，可保證獲得較佳的分離度效果。245 nm波長下抗壞血酸和異抗壞血酸標準色譜圖見圖2。

圖1　高效液相色譜法測定標樣與加標樣品色譜圖比較Fig.1　The standard of chromatogram compare with spiked by HPLC

圖2　D-異抗壞血酸和L-抗壞血酸標準品色譜圖Fig.2　Chromatogram of standard of isoascorbic acid and ascorbic acid

2.3流動相的選擇與優(yōu)化

UPC2所采用的流動相是以CO2超臨界流體為主體，配比不同有機溶劑作為助溶劑來調(diào)節(jié)流動相的極性及溶解性，并加入少量改性劑，從而有效改變目標物的峰形和保留時間以獲得最佳的分離效果。常用助溶劑一般為甲醇、乙腈、乙酸乙酯，實驗考察以上三種常用有機溶劑發(fā)現(xiàn)，乙腈和乙酸乙酯作為助溶劑時兩種目標物均無響應，而加入磷酸改性劑的甲醇溶解能力最佳。劉倩倩等研究建立含0.05%磷酸改性劑的甲醇與CO2梯度洗脫方式測定維生素C的方法［14］，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)梯度洗脫無法很好分離葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸?？紤]到UPC2體系中CO2的比例最好不要低于70%，實驗分別選擇CO2∶甲醇（含0.1%磷酸）比例為80∶20、85∶15和90∶10進行等度洗脫，結果發(fā)現(xiàn)隨著CO2比例增加，峰形變窄，保留時間后延，抗壞血酸和異抗壞血酸能獲得較好分離度。故實驗最終選擇CO2∶甲醇（含0.01%磷酸）比例為90∶10等度洗脫。

2.4動態(tài)背壓（ABPR）的選擇

在超高效合相色譜中，動態(tài)背壓是為了確保CO2在整個操作過程中處于超臨界狀態(tài)，當背壓升高時，超臨界流體密度會增大，溶劑化能力增強，由此說明它的變化也會影響物質(zhì)的分離。本實驗以CO2和0.01%磷酸甲醇為流動相，考察了背壓在1500～2000Psi范圍內(nèi)對樣品分離的影響。結果表明，背壓降低，目標物色譜峰的保留時間減少，響應增加，柱壓降低。綜合考慮樣品基質(zhì)、保留時間及色譜柱壓力三個因素，當背壓為1800Psi時，抗壞血酸和異抗壞血酸能達到較好的分離。

2.5方法考察

2.5.1線性范圍和靈敏度在優(yōu)化實驗條件下，將濃度為2.5、5.0、20.0、40.0、80.0 mg/L一系列抗壞血酸和異抗壞血酸混合標準溶液按上述色譜條件進行測定，繪制樣品濃度（橫坐標x，mg/L）與峰面積（縱坐標y，AU）標準曲線，進行線性回歸。結果表明，該方法在2.5～80mg/L范圍內(nèi)有較好的線性關系，兩種待測物的線性相關系數(shù)R2均大于0.998，根據(jù)S/N信噪比計算得出抗壞血酸和異抗壞血酸的檢出限均為2.0mg/kg，定量限均為6.0mg/kg。

2.5.2回收率和精密度采用上述的前處理方法對陰性紅葡萄酒、起泡白葡萄酒樣品進行抗壞血酸和異抗壞血酸的添加回收實驗，添加水平分別為10.0、50.0、150 mg/kg，按上述色譜條件進行測定。結果表明回收率在93.2%～105.9%之間，相對標準偏差（RSD）為4.5%～9.8%。結果如表1所示，方法的重現(xiàn)性好、精密度理想、準確性高。

表1　抗壞血酸和異抗壞血酸線性范圍、相關系數(shù)及加標回收Table 1　Linear ranges，correlation coefficients（r），spiked recoveries of ascorbic acid and isoascorbic acid

2.5.3實際樣品的測定利用上述實驗優(yōu)化條件，準確稱取干紅葡萄酒、干白葡萄酒和起泡白葡萄酒樣各2.5 g至50 mL具塞離心管中，加入25 mL甲醇（含0.1%磷酸）-水（8+2），均質(zhì)，超聲提取，離心后取1 mL上清液，過濾膜，按“1.2.2色譜條件”的測定，見圖3～圖5，分別為抗壞血酸11.3 mg/kg，異抗壞血酸42.1 mg/kg，未檢出，以上結果表明該方法可用于葡萄酒的測定，無需進行復雜的前處理，干擾小，可直接進樣，直接檢測。

3　結論

選用CO2和0.1%磷酸甲醇為流動相，等度洗脫，利用PDA檢測方法同時測定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸。實驗結果表明：所建立的超高效合相色譜法可以快速分離上述兩種待測物，前處理過程簡單，分析時間短，線性相關性好，準確度高，與普通高效液相色譜法相比避免了由于基質(zhì)特殊性造成分離度差難以定量的缺點，試劑使用量少，環(huán)保、運行成本低，對未來的色譜分析提供新的方向，具有較高的實用價值，可用于口岸進出口葡萄酒的監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量控制。

圖3　干紅葡萄酒樣品色譜圖Fig.3　Sample of dry red wine

圖4　干白葡萄酒樣品色譜圖Fig.4　Sample of dry white wine

圖5　起泡白葡萄酒樣品色譜圖Fig.5　Sample of sparking wine

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Research method of rapid determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine by Ultra-performance Convergence Chromatography

XU Li，XUAN Kai-zhi，JI Shao-fan，F(xiàn)U Ling-mei，JIANG Lin-rong
（Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Haikou 570311，China）

A new method was developed for the determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine by Ultra Performance Convergence Chromatography（UPC2）.The mobile phase was mixture with supercritical CO2and methanol（added 0.1%H3PO4）at a flow rate of 1.5 mL/min.Using the Waters BEH column，UV detector was set at a wavelength of 245 nm.The limit of detection was 2.0 mg/kg，the calibration linear range was 2.5～80.0 mg/L，its spiked recoveries were 93.2%～105.9%，and the relative standard deviation range from 4.5%to 9.8%.The method with high efficient，rapid，simplicity，high sensitivity and accurate results，it was applicable for determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine.

Ultra Performance Convergence Chromatography（UPC2）；wine；ascorbic acid；isoascorbic acid

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0075-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.006

2014－11－14

徐莉（1981-），女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品有害物質(zhì)檢測，E-mail：klppt1026@126.com。

海南省科技興海項目（XH201407）；海南省自然科學基金項目（313105）。