周國君，唐　　玲，胡　　萍，王曉靜，朱建榮，陳　　韻

（1．貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴陽三聯(lián)乳業(yè)有限公司，貴州貴陽550004；3.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003）

應(yīng)用PCR-DGGE對巴氏消毒乳中腐敗細(xì)菌的污染溯源研究

周國君1，2，唐玲3，胡萍1，*，王曉靜2，朱建榮2，陳韻1，2

（1．貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴陽三聯(lián)乳業(yè)有限公司，貴州貴陽550004；3.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003）

運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)分析了巴氏殺菌乳從原料乳到殺菌、灌裝這兩個(gè)加工關(guān)鍵控制點(diǎn)的微生物動態(tài)變化和差異性，容易發(fā)生污染的環(huán)節(jié)是擠乳環(huán)節(jié)、殺菌后的加工管道和包裝環(huán)節(jié)。原料乳中易攜帶的細(xì)菌是乳酸鏈球菌（Lactococcus lactis subsp.）和乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）；擠乳環(huán)節(jié)中易受無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）污染；殺菌后的加工管道易受熱殺環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）、鉆黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和2株非培養(yǎng)的假單胞菌屬（Uncultured Pseudomonas sp.）污染；肉桿菌屬（Carnobacterium sp.）和產(chǎn)乳酸菌素的肉桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）則在擠乳環(huán)節(jié)、殺菌后的加工管道或包裝環(huán)節(jié)都可能被污染。

PCR-DGGE，巴氏殺菌乳，腐敗微生物，污染溯源

牛乳營養(yǎng)豐富，含有人體所需的全部營養(yǎng)素，鮮乳中有上百種營養(yǎng)成分，主要包括豐富的蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、乳糖、鈣、鎂等礦物質(zhì)［1］，但同時(shí)也是腐敗菌的良好培養(yǎng)基，屬高危險(xiǎn)性的食品原料［2］。微生物會破壞牛乳的營養(yǎng)成分、引起牛乳變味、可能還會使巴氏殺菌失敗，這些都可能危害人體健康［3］。引起乳品腐敗變質(zhì)的主要原因是在生產(chǎn)過程中污染繁殖和原料乳本身攜帶的微生物。原料乳中的微生物主要包括細(xì)菌、霉菌和酵母等，以細(xì)菌和真菌為主［4-5］。常見的有脂肪分解菌、乳酸菌、產(chǎn)氣菌、胨化細(xì)菌、產(chǎn)堿菌等［6］。PCR-DGGE技術(shù)在分析各類食品加工過程中的微生物群落組成及動態(tài)變化方面得到了廣泛的應(yīng)用。

目前，關(guān)于原料乳及乳品中腐敗菌的報(bào)道大多僅限于腐敗菌的危害、計(jì)數(shù)檢測、分離及特性等方面，而對其菌相組成和多樣性的研究很少。國內(nèi)尚未有關(guān)于原料乳及乳品中腐敗微生物系統(tǒng)分析的報(bào)道，國外也很少。本研究首次采用DNA指紋技術(shù)PCR-DGGE，對巴氏消毒乳生產(chǎn)中的腐敗微生物進(jìn)行快速鑒定，揭示原料乳及乳品中的主要污染細(xì)菌種群以及群落的變化規(guī)律，為進(jìn)一步確定乳品生產(chǎn)中的關(guān)鍵質(zhì)量控制措施提供依據(jù)。溯源，追本溯源，探尋事物的根本、源頭，本文著重對乳品中的腐敗微生物進(jìn)行溯源研究，對保證乳品質(zhì)量和提高安全性有十分重要的實(shí)踐意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳品貴陽三聯(lián)乳業(yè)有限公司，共3個(gè)樣品，具體見表1；溴化乙錠（EB）、TE緩沖液、溶菌酶、尿素、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、甲叉雙丙烯酰胺北京Solarbio公司提供；上下游引物由上海生工生物工程有限公司提供；Go Taq Green Master Mix美國Promega公司提供；6×loading buffer、2000 bp DNA Marker大連Takara有限公司提供；瓊脂糖上海晶泰生物技術(shù)有限公司提供；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒北京天根生化科技有限公司提供。

表1　乳品樣品Table 1　Samples of dairy products

S1000TMThermal Cycler型PCR儀、Gel DocXR型凝膠成像儀、DcodeTMUniversal Mutation Detection System型DGGE電泳儀美國Bio-rad公司；Micro 17R微量高速冷凍離心機(jī)美國Thermo Electron公司；Gilson P型移液器法國吉爾森公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品的前處理用移液槍分別吸取200 μL無水乙醇、200 μL乙醚和200 μL丙酮加入1 mL樣品中，充分混勻后進(jìn)行高速冷凍離心，去上清液，將剩余的沉淀用TE緩沖液（pH=8.0）溶解，再加入10 μL濃度為50 mg/mL的溶菌酶溶液充分混勻，于37℃在水浴鍋中溫育1 h以上。

1.2.2細(xì)菌總DNA的提取參照DP302-02細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中說明書所示，對原料乳和乳房炎乳樣品中的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行提?。ㄆ渲校糠植襟E進(jìn)行了改進(jìn)），將所提DNA于-20℃下貯藏。

1.2.3PCR擴(kuò)增（巢式PCR） 細(xì)菌通用引物見表2。

參照文獻(xiàn)［9］對所提DNA進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增。

16S rDNA全長擴(kuò)增：用引物27F和1492R進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL模板DNA，濃度為1 μM的上下引物各2.5 μL，Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL，補(bǔ)去離子水6.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃2 min；再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，包括94℃1 min，58℃1 min，72℃2 min；最終72℃2 min。

16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增：用引物GC-338F和518R進(jìn)行擴(kuò)增，在引物338F的5’加入GC夾，序列為CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G。25 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL模板DNA，其他體系同上。PCR反應(yīng)程序（touchdown PCR）：94℃5 min；先進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，94℃1 min，退火溫度于65℃降至55℃，每個(gè)循環(huán)降0.5℃，退火時(shí)間3 s，72℃1 min；再進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，包括94℃1 min，55℃30 s，72℃1 min。

Reconditioning PCR：用引物GC-338F和518R進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL模板DNA，其他體系同上。PCR反應(yīng)程序：共5個(gè)循環(huán)，包括94℃5 min；94℃1 min，55℃45 s，72℃1 min；最終72℃5 min。

1.2.4變性梯度凝膠電泳（DGGE） DcodeTMDGGE電泳儀對上述樣品細(xì)菌總DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。電泳條件［10］：DGGE變性梯度凝膠是濃度為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑梯度為35%～55%（100%變性含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺），在0.5×TAE緩沖液中，200 V預(yù)電泳5 min，再進(jìn)行85 V、16 h的恒壓電泳。凝膠經(jīng)EB染色后于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)拍照并記錄。

1.2.5條帶回收及DNA測序無菌條件下切下凝膠上不同位置的條帶，加入20 μL無菌去離子水4℃放置過夜。進(jìn)行DGGE驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。若驗(yàn)證條帶與所割條帶位于相同的遷移位置，再切膠回收，用引物338F和518R進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增，送上海生工公司純化并測序。

表2　16S rDNA擴(kuò)增的通用引物Table 2　16S rDNA amplification of universal primers

圖1　樣品細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Representative electrophoresis photo of PCR amplification products of V3 variable region of meat

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR的擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，樣品T、L和P均擴(kuò)增出大小約為230 bp左右的特異性擴(kuò)增片斷，且陰性對照無條帶，DNA質(zhì)量能滿足后續(xù)DGGE的實(shí)驗(yàn)要求。

2.2DGGE分析

圖2　樣品細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)的DGGE圖譜Fig.2　DGGE profiles of bacterial 16S rDNA V3 variable region of samples

樣品細(xì)菌基因組DNA的DGGE圖譜如圖2所示。由圖2可知，樣品共分離到27條不同的條帶，原料乳T分離到20個(gè)條帶，條帶7、11、12、14、16和26的亮度最高；殺菌乳L分離到8個(gè)條帶，條帶12、15、16和21的亮度最高；成品乳分離到14個(gè)條帶，條帶15、16、17、21和27的亮度最高。

2.3主要條帶測序分析

DGGE圖譜主要條帶（1～27）的測序結(jié)果見表3。

表3　主要條帶測序分析Table 3　DNA sequencing of bands

由表3可知，條帶1～27所代表的細(xì)菌相似性均達(dá)到97%以上，它們分別是：馬腸鏈球菌（Streptococcus equinus）、熱殺環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）、2株非培養(yǎng)的細(xì)菌（Uncultured bacterium）、非培養(yǎng)的乳桿菌目細(xì)菌（Uncultured Lactobacillales bacterium）、2株非培養(yǎng)的假單胞菌屬（Uncultured Pseudomonas sp.）、棉子糖腸球菌（Enterococcus raffinosus）、非培養(yǎng)的鏈球菌屬（Uncultured Streptococcus sp.）、海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、乳酸鏈球菌（Lactococcus lactis subsp.）、棉子糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）、鉆黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）、乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）、解糖腸球菌（Enterococcussaccharolyticus）、魚乳球菌（Lactococcus piscium）、乳球菌屬（Lactococcus sp.）、肉桿菌屬（Carnobacteriumsp.）、瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）、非培養(yǎng)的乳球菌屬（Uncultured Lactococcus sp.）、嗜酸菌屬（Acidovorax sp.）、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、產(chǎn)乳酸菌素的肉桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）、豬鏈球菌（Streptococcus suis）和解沒食子酸鏈球菌（Streptococcus gallolyticus）。

2.4腐敗菌的溯源研究

DGGE圖片及測序結(jié)果表明：在巴氏奶的生產(chǎn)過程中，樣品中的微生物具有顯著差異性和動態(tài)演替過程。樣品T（貯奶罐中原料乳）中，條帶7、11、12、14、16和26的亮度最高，代表了其中的優(yōu)勢菌群：棉子糖腸球菌（Enterococcus raffinosus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、棉 子 糖 乳 球 菌（Lactococcus raffinolactis）、乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）和豬鏈球菌（Streptococcus suis）。這表明鏈球菌屬是該原料乳樣品中的優(yōu)勢污染菌。據(jù)張紅研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌是牛乳中的主要細(xì)菌之一，在樣品T中也檢測到了乳酸鏈球菌（Lactococcus lactis subsp.）、乳酸桿菌（Lactobacillussp.）和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）的存在，其中，乳酸鏈球菌（Lactococcus lactis subsp.）普遍存在于牛乳中，幾乎在所有的生鮮乳中均能檢出這種細(xì)菌［11］，這也與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）則是發(fā)酵食品和乳制品中普遍存在的一種乳酸菌。棉子糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）發(fā)現(xiàn)于乳制品和植物產(chǎn)品，是一種常見的細(xì)菌。而無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）則是乳房炎的病原體，在奶牛的體表、乳頭和乳房內(nèi)都存在，可通過擠乳人員的手、擠乳機(jī)器以及蠅類的攜帶而傳播的。這說明除了原料乳本身攜帶的一些微生物外，擠乳機(jī)械、擠乳人員和擠乳環(huán)境等存在衛(wèi)生問題，擠乳環(huán)節(jié)是造成乳品污染的一個(gè)源頭。

經(jīng)過巴氏殺菌后，乳品中的微生物發(fā)生了變化，在樣品L（巴氏殺菌后的牛乳）中，條帶1、5、10、11、13、14、18、19、22、23、24和26消失，條帶7、9、15、16、17、21和27有所減弱。新出現(xiàn)了條帶3、4和6，而條帶12亮度增強(qiáng)，變得十分明亮，它們分別代表了2株非培養(yǎng)的細(xì)菌（Uncultured bacterium）、1株非培養(yǎng)的假單胞菌屬（Uncultured Pseudomonas sp.）以及嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）。表明在巴氏殺菌過程中有部分細(xì)菌被完全殺死，另外一部分細(xì)菌則在數(shù)量上大大降低。但又新出現(xiàn)了3株菌，這3株菌的條帶都很弱，在數(shù)量上并不占主導(dǎo)地位，可能是殺菌后樣品溫度變化為原料乳中原本就存在但數(shù)量極少導(dǎo)致之前未能檢測到的菌提供了良好的生長繁殖環(huán)境，因?yàn)橛醒芯勘砻鳎颊麄€(gè)群落細(xì)菌數(shù)量1%以下的菌群在DGGE圖譜中不容易被觀察到［12］。而條帶12在樣品L中呈現(xiàn)出極高的濃度，說明嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是巴氏殺菌后牛乳中的主要微生物，占據(jù)主導(dǎo)地位。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）來源于乳制品，能在45℃以上的溫度生長繁殖，這可能就是巴氏殺菌后它在樣品中成為絕對優(yōu)勢菌的原因。

在樣品P（包裝消毒牛奶）中，微生物的多樣性又發(fā)生了變化，條帶3、4消失，條帶12減弱，出現(xiàn)了條帶8、20、23和25，而條帶6、7、9、15、16、17、21和27的亮度增強(qiáng)。其中，條帶15、16、17、21和27在數(shù)量上是優(yōu)勢菌群，是樣品中的主要腐敗菌，且都不是新出現(xiàn)的菌，它們分別代表了鉆黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）、乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）、解糖腸球菌（Enterococcussaccharolyticus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和解沒食子酸鏈球菌（Streptococcus gallolyticus），尤其是鉆黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus） 和 瑞 士 乳 桿 菌（Lactobacillus helveticus）在樣品P中的濃度最高。這幾種菌在包裝后的成品中成為優(yōu)勢菌，可能有兩個(gè)原因：一是因?yàn)闅⒕蟮娜槠吩诠嘌b之前有一個(gè)迅速冷卻的過程，如果加工管道的清潔和衛(wèi)生程度不夠，這一環(huán)節(jié)也可能會有污染發(fā)生；二是有些微生物經(jīng)過高溫殺菌后能很快恢復(fù)并快速生長起來。而新出現(xiàn)的4個(gè)條帶：1株非培養(yǎng)的假單胞菌屬（Uncultured Pseudomonas sp.）、肉桿菌屬（Carnobacterium sp.）、嗜酸菌屬（Acidovorax sp.）和產(chǎn)乳酸菌素的肉桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）在樣品中有比較微弱的存在，說明這4株菌也是腐敗菌的一部分，但在數(shù)量上并不占主導(dǎo)。其中，產(chǎn)乳酸菌素的肉桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）來源于蟑螂的腸道微生物群落以及它們在受河流污染的影響下產(chǎn)生變化的細(xì)菌，說明包裝環(huán)境、包裝機(jī)器和包裝人員等可能存在衛(wèi)生問題。表明產(chǎn)品是在進(jìn)入包裝環(huán)節(jié)后被污染的，包裝環(huán)節(jié)也是乳品的一個(gè)污染源。

通過分析，貯奶罐原料乳中的優(yōu)勢菌是棉子糖腸球菌（Enterococcusraffinosus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、棉 子 糖 乳 球 菌（Lactococcus raffinolactis）、乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）和豬鏈球菌（Streptococcus suis），巴氏殺菌后的牛乳樣品中嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）成為其絕對優(yōu)勢菌，而包裝后的消毒牛奶中有以下優(yōu)勢菌群：鉆黃腸球菌（Enterococcuscasseliflavus）、乳酸桿菌（Lactobacillussp.）、解糖腸球菌（Enterococcus saccharolyticus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和解沒食子酸鏈球菌（Streptococcus gallolyticus）。擠乳環(huán)節(jié)、加工管道和包裝環(huán)節(jié)是該產(chǎn)品的微生物污染源。

3　結(jié)論

運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)分析了巴氏殺菌乳從原料乳到殺菌、灌裝這兩個(gè)加工關(guān)鍵控制點(diǎn)的微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性，得出了主要腐敗細(xì)菌的污染來源和容易發(fā)生污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3.1乳品中腐敗微生物的兩個(gè)主要來源分別是原料乳本身含有的微生物以及在生產(chǎn)加工過程中被污染的微生物，包括：擠乳環(huán)節(jié)、殺菌后的加工管道和包裝環(huán)節(jié)。

3.2原料乳中易攜帶的細(xì)菌是乳酸鏈球菌（Lactococcus lactis subsp.）和乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）；擠乳環(huán)節(jié)中易受無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）污染；殺菌后的加工管道易受熱殺環(huán)絲菌（Brochothrix thermosphacta）、鉆黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和2株非培養(yǎng)的假單胞菌屬（Uncultured Pseudomonas sp.）污染；肉桿菌屬（Carnobacterium sp.）和產(chǎn)乳酸菌素的肉桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）則在擠乳環(huán)節(jié)、殺菌后的加工管道或包裝環(huán)節(jié)都可能被污染。

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Research on pollution sources of spoilage bacteria in pasteurized milk by PCR-DGGE

ZHOU Guo-jun1，2，TANG Ling3，HU Ping1，*，WANG Xiao-jing2，ZHU Jian-rong2，CHEN Yun1，2
（1.College of Liquor Making and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Guiyang Trigeminy Dairy Industry Limited Company，Guiyang 550004，China；3.Zunyi Medical University，Zunyi 563003，China）

PCR-DGGE technology was applied to analyze the differences and dynamic changes of microbial community of pasteurized milk from key control points of raw milk to pasteurization and filling process.The results showed that the points proned to be contaminated were milk making，processing pipeline after pasteurization and packaging.Lactococcus lactis subsp.and Lactobacillus sp.were easy carried by raw milk. Streptococcus agalactiae was polluted at milk making.Brochothrix thermosphacta，Enterococcus casseliflavus，Lactobacillus helveticus and 2 strains of uncultured Pseudomonas sp.might be polluted at processing pipeline after pasteurization.Carnobacterium sp.and Carnobacterium maltaromaticum may be polluted at milk making，processing pipeline after pasteurization and packaging.

PCR-DGGE；pasteurized milk；spoilage bacteria；pollution tracing

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.001

2015－01－06

周國君（1964-），男，大學(xué)本科，高級工程師，研究方向：乳品加工與質(zhì)量控制，E-mail：pinghu2008806@163.com。

胡萍（1970-），女，博士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與安全，E-mail：ls.phu@gzu.edu.cn。

貴州省科技農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目［黔科合NY字（2009）3076］；貴陽市乳業(yè)重大專項(xiàng)［（2009）筑科農(nóng)合同字2-017-5］。