李 貞 顧鏡月

新生大鼠缺氧缺血性腦損傷HIF-1α和VEGF的表達(dá)及相關(guān)性分析

李 貞 顧鏡月

目的 建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型，研究HIBD時(shí)腦組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)及其相關(guān)性，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 7日齡新生Wistar大鼠112只，隨機(jī)分為正常組，HIBD模型組。各組分別于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)取腦組織，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HIF-1α和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)及其相關(guān)性。結(jié)果（1）HIBD模型組HIF-lα及VEGF陽(yáng)性表達(dá)與正常組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。（2）HIBD模型組HIF-1α 和VEGF的表達(dá)趨勢(shì)一致，呈直線正相關(guān)（r=0．613，P＜0．01）。結(jié)論 HIF-1α 和VEGF在HIBD新生大鼠神經(jīng)保護(hù)作用中起協(xié)同作用。

低氧誘導(dǎo)因子-1α；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；缺氧缺血性腦損傷

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指各種圍生期缺氧窒息引起的腦損傷，是新生兒死亡及遠(yuǎn)期運(yùn)動(dòng)智能落后、腦性癱瘓、癲癇等的主要原因之一[1]。研究表明，缺氧引起的凋亡主要由缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）調(diào)節(jié)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是唯一高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，被認(rèn)為是血管生成最直接、最重要的生長(zhǎng)因子。缺氧是VEGF表達(dá)的強(qiáng)效因素之一。VEGF的基因啟動(dòng)子HIF-1α在低氧條件下處于激活狀態(tài)，對(duì)VEGF的表達(dá)起直接誘導(dǎo)作用，從而促進(jìn)血管新生及側(cè)支循環(huán)的建立，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用無氧法創(chuàng)建新生大鼠HIBD模型，研究HIF-1α和VEGF表達(dá)變化及相關(guān)性，揭示缺氧缺血性腦損傷發(fā)生機(jī)制，為臨床尋找更有效的治療方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的建立 選用佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康7日齡Wistar大鼠112只，雌雄不限，體重15～20g，隨機(jī)分為正常組，HIBD模型組，各56只。根據(jù)處死時(shí)間不同每組又分為 7個(gè)亞組：3h組、8h組、12h組、24h組、48h組、72h組、5d組，每個(gè)亞組8只。HIBD模型組參照無氧法[2]制備HIBD模型。

1.2 標(biāo)本采集及免疫組織化學(xué)檢測(cè) 分別于3h、8h、12、24h，3d及5d取各組動(dòng)物乙醚麻醉，心臟灌注20 ml生理鹽水，待流出液澄清，用4%多聚甲醛進(jìn)行內(nèi)固定，開顱取腦。于4%多聚甲醛、4℃固定24 h，脫水透明后石蠟包埋，于前囟前0.3mm至前囟后0.6mm連續(xù)切片，片厚5μm備用。標(biāo)本采用免疫組化SABC法。陽(yáng)性結(jié)果判定：取正常組、HIBD組各時(shí)間點(diǎn)免疫組化切片各3張。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬區(qū)和皮層，取同一批次染色切片3個(gè)相應(yīng)、不重復(fù)的視野，放大200倍，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)用（±s）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-la免疫組化染色結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 腦組織HIF-lα陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞胞漿或胞核棕黃色細(xì)顆粒沉積，以大腦皮層及海馬區(qū)陽(yáng)性表達(dá)最為顯著。正常組腦組織神經(jīng)細(xì)胞僅見很少量HIF-lα陽(yáng)性表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HIBD模型組腦組織HIF-lα陽(yáng)性表達(dá)于造模后3h開始升高，但與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；12h-24h陽(yáng)性表達(dá)到達(dá)峰值，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與HIBD模型組其它時(shí)間點(diǎn)比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；48h后陽(yáng)性表達(dá)逐漸下降，3-5d陽(yáng)性表達(dá)仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表1所示。

表1 二組大鼠（n=8）各時(shí)間點(diǎn)HIF-la陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（個(gè)/200倍視野）

2.2 VEGF免疫組化染色及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 腦組織VEGF陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)中可見棕黃色細(xì)顆粒沉積，主要分布于大腦皮層及海馬區(qū)。正常組腦組織神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)中僅有極少量VEGF陽(yáng)性表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)差異無顯著性（P＞0.05）。HIBD模型組腦組織于造模后8h開始有少量VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；24-48h達(dá)高峰，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；3d后VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少。表2所示。

2.3 HIF-1α和VEGF的相關(guān)性 繪制散點(diǎn)圖對(duì)HIBD模型組HIF-lα和VEGF的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-lα和VEGF呈直線正相關(guān)（r=0.613，P＜0.01）。如圖3所示。

3 討論

表2 二組大鼠（n=8）各時(shí)間點(diǎn)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（個(gè)/200倍視野）

圖3 HIBD模型組HIF-lα和VEGF表達(dá)的相關(guān)性

核轉(zhuǎn)錄因子HIF-1是低氧誘導(dǎo)因子蛋白家族（HIFs）中維持細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)的主要分子，由一個(gè)β結(jié)構(gòu)性亞基和一個(gè)α功能性亞基構(gòu)成，α亞基的表達(dá)有賴于細(xì)胞內(nèi)的氧濃度。低氧條件下，HIF-1可誘導(dǎo)PI3K/Rho/ROCK途徑激活c-myc，使其與myc-max反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)血管形成；還可促進(jìn)GLUT-1，ENO-1，EPO等基因的表達(dá)，抑制凋亡。Baek等[3]發(fā)現(xiàn)VEGF是缺氧時(shí)HIF-1最重要的靶基因之一。研究表明，HIF-1α缺失可導(dǎo)致VEGF表達(dá)下降，抑制腫瘤新生血管的形成，降低細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性，增加細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)模型組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)均高于正常組，海馬及皮質(zhì)區(qū)尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)明顯增強(qiáng)。神經(jīng)元在海馬及皮質(zhì)區(qū)分布較集中，對(duì)缺氧缺血較敏感。缺氧缺血腦損傷后，可能通過增加HIF-1α 的表達(dá)，激活 PI3K/Rho/ROCK途徑[4]，促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管形成，使細(xì)胞、組織對(duì)低氧環(huán)境發(fā)生適應(yīng)性和保護(hù)性改變，抵抗細(xì)胞凋亡，為神經(jīng)修復(fù)提供條件。本研究?jī)H揭示缺氧缺血性腦病可能的發(fā)病機(jī)制，臨床實(shí)踐中應(yīng)用何種治療手段能促進(jìn)腦組織中積極因子的表達(dá)，從而提高缺氧缺血性腦病患兒的臨床療效及預(yù)后有待進(jìn)一步研究。

[1]Jiang W,Chen L,Zhang XJ,Chen J,Li XC,Hou WS,et al．Red photon treatment inhibits apoptosis via regulation of bcl-2 proteins and ROS levels,alleviating hypoxic-ischemic brain damage[J]．Neuroscience,2014,268:66-74．

[2]莫國(guó)梁,余加林．新生兒缺氧缺血性腦病動(dòng)物模型的建立[J]．兒科藥學(xué)雜志,2008(02):58-60．

[3]Park HJ,Baek KH,Lee HL,Kwon A,Hwang HR,Qadir AS,et al．Hypoxia inducible factor-1alpha directly induces the expression of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand in periodontal ligament fibroblasts[J]．Mol Cells．2011,31(6):573-8．

[4]Mizukami Y,Fujiki K,Duerr EM,Gala M,Jo WS,Zhang X,et al．Hypoxic regulation of vascular endothelial growth factor through the induction of phosphatidylinositol 3-kinase/Rho/ROCK and c-Myc[J]．J Biol Chem,2006,281(20):13957-63．

THE EXPRESSION OF HIF-1AIN AND VEGF IN HYPOXIA ISCHEMIA BRAIN DAMAGE IN NEONATAL RATS

Li Zhen1Gu Jingyue2
(1Anyang city maternal and child health care and children's hospital,455000；2Jiamusi university first affiliated hospital，154002)

Objective To investigate the expression of HIF-1ain and VEGF in Hypoxia Ischemia Brain Damage in neonatal rats.Methods A total of 112 female or male Wistar rats aged 7 days were randomly divided into three groups:normol group and HIBD model group.HIBD model of neonatal rats were established in HIBD model group.Rats in three groups were sacrificed at different time points and brain tissue were collected.Then morphologic changes of brain tissue in general obtained through macroscopic observation,the brain tissue were HE stained to observe the pathological changes under light microscope.The expression of HIF-1αand VEGF in hippocampa was detected with the immunohistochemistry method.Results（1）In the Hypoxia Ischemia Brain Damage model,the expression of HIF-1α and VEGF positive cells compared with the normol group(P＜0.05).（2）The expressions of HIF-1αand VEGF in brain tissue in HIBD had notable positive correlation(r=0.613,P＜0.01).Conclusion The expressions of HIF-1α and VEGF in brain tissue in HIBD and rhG-CSF treatment group had notable positive correlation.

Hypoxia inducible factor-1α ；Vascular endothelial growth factor；Hypoxia ischemia brain injury

作者單位：455000安陽(yáng)市婦幼保健院暨兒童醫(yī)院（李貞）；154002 佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院（顧鏡月）

R722．1

B