宋志敏，劉海平，2

(1.溫州醫(yī)科大學體育科學學院，浙江溫州325035;2.溫州醫(yī)科大學低氧醫(yī)學研究所，浙江溫州325035)

人類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)，又稱為肽基二肽酶A(peptidyl dipeptidase A)，是由ACE基因編碼的一種含鋅的金屬糖蛋白，其分子量為150 000 KD。編碼ACE蛋白的基因序列第16號內(nèi)含子上存在一段287 bp片段的插入(insertion，I)/缺失(Deletion，D)多態(tài)，該多態(tài)位點與血清ACE水平有顯著關聯(lián)性，II、ID及DD基因型受試者ACE濃度分別為(299.3±49)、(392.6±66.8)和(494.1 ±88.3)μg/L［1］。有研究報道，攜帶I等位基因受試者，其自身血清ACE水平較低，下調(diào)的ACE活性可以通過減輕心臟的后負荷壓力來增加心輸出量和毛細血管的密度，改善運動時骨骼肌血液的供給，維持工作能力［2］。目前關于ACE基因I/D多態(tài)性與運動能力的遺傳學研究，多集中在該基因多態(tài)性與有氧耐力、速度耐力、力量素質(zhì)的關聯(lián)性研究方面，其中有氧耐力的可訓練性與ACE基因I/D的多態(tài)關聯(lián)性研究成為各國學者關注的焦點。楊賢罡等基于ACE基因I/D多態(tài)性與耐力素質(zhì)的關聯(lián)性研究的Meta分析研究報道，歐洲人群中II型純合子與優(yōu)秀耐力素質(zhì)明顯關聯(lián)，中國漢族人群未發(fā)現(xiàn)顯著關聯(lián)［3］。

關于ACE基因I/D多態(tài)位點與低氧訓練效果的關聯(lián)研究較少報道。周付濤等研究報道［4］II型基因型可能參與高原低氧適應的調(diào)節(jié)。鑒于ACE的生物學功能，其基因多態(tài)性也有可能與低氧訓練效果的個體差異性有關。本研究選取位于ACE基因序列16號內(nèi)含子I/D多態(tài)，研究該多態(tài)位點基因型(genotype)與平原人群進行高住－高練－低訓(living high-exercise high-training low，HiHiLo)過程中生理表型指標變化關聯(lián)性，探究運動員低氧訓練過程中生理表型指標改善效果與遺傳學基因標記的關聯(lián)性。

1 研究方法

1.1 研究對象

選35名體質(zhì)水平相近的健康受試者(男性23名、女性12名)，均系中國北方漢族人群，且所有受試者無低氧暴露經(jīng)歷。受試基本情況見表1。

表1 受試者基本情況(±S)

表1 受試者基本情況(±S)

N年齡/yr 身高/cm 體重/kg 35 19.54±2.55 177.94±4.27 68.07±5.579

1.2 研究方案

本實驗采用關聯(lián)研究方法(Association Study)，研究受試者ACE基因I/D多態(tài)性與HiHiLo低氧訓練后生理表型指標關聯(lián)性。所有受試者每天在氧濃度為15.4%的低氧艙內(nèi)(相當于海拔2 500 m高度)休息和睡眠，低氧暴露時間≥10 h/d(pm 8:00－am 6:00，低氧環(huán)境由Hypoxic Tent System TM”和“CAT Hatch TM(美國產(chǎn))設備制造，由CNJK-AT(中國，天津)監(jiān)測控制系統(tǒng)檢測O2、CO2濃度)，白天在海拔50m的常氧環(huán)境下訓練、生活。每周在氧濃度為15.4%的低氧環(huán)境下進行3次70%O2max強度蹬功率車運動(MONARK 818功率自行車，瑞典)，每次30 min，功率自行車轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/min，HiHiLo低氧實驗持續(xù)4周。

生理指標測試:HiHiLo低氧實驗前后分別測試最大攝氧量(maximal oxygen uptake，O2max)、血象(hematological parameters)等生理表型指標。O2max測試(MedGraphicsVO2000便攜式氣體代謝分析儀，美國)采用遞增負荷運動實驗，受試者以60 W為起始運動強度，蹬功率車轉(zhuǎn)速為每分鐘60轉(zhuǎn)，每級負荷運動持續(xù)3 min，3 min后遞增30 W，直至運動力竭;血象指標采用BECKMAN STKS型全自動血細胞分析儀(日本)進行，受試者晨起空腹抽取靜脈血0.5 ml，血象測試指標主要包括紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)等。

ACE基因I/D多態(tài)性分析:抽取受試者靜脈血2ml，2%EDTA抗凝，采用DNA提取專用試劑盒提取受試者DNA(promega公司)。依據(jù)人類ACE基因序列16號內(nèi)含子上一段基因序列設計上、下游引物(Primer 5.0)，上、下游引物分別為:5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3’;5’-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3’(上海生工)。20 μL PCR反應擴增體系(LifePro Thermal Cycler，中國杭州)(2 μL 的 10 × PCR Buffer，1.2 μL 的 25 mM MgCl2，10 mM dNTP 各 1 μL，0.5 μL 的 10 pmol上、下引物，Taq酶2 U，模板100 ng)。擴增方案包括40 s 94℃變性;40 s 54℃退火;40 s 72℃延伸，共進行35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳(80 V)40 min，EB熒光染色，紫外透射儀下觀察結果并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計包(SPSS software for Windows 11.5 package)統(tǒng)計分析。哈溫(Hardy-weinberg)遺傳平衡定律檢驗采用卡方檢驗(chi square-test，χ2)處理;不同基因型受試者低氧訓練前、后生理表型指標統(tǒng)計處理，分別采用單因素方差分析(ANOVA)和協(xié)方差分析進行。所有數(shù)據(jù)以(±S)表示，顯著水平設為P＜0.05。

2 結果

2.1 ACE基因I/D多態(tài)性的分析結果

35名受試者ACE基因I/D解析結果顯示(圖1)，II、ID及 DD基因型頻率分別為40%、51%，和9%，其中I等位基因頻率占66%，D等位基因頻率占34%。受試人群基因型的Hardy-weinberg遺傳定律通過卡方檢驗處理，結果顯示，χ2值為0.699(P＞0.05)，符合Hardy-weinberg平衡遺傳定律，表明該樣本具有群體代表性。

圖1 ACE基因酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

2.2 ACE基因I/D多態(tài)性與HiHiLo低氧訓練后生理表型指標變化的關聯(lián)性

HiHiLo低氧訓練前后，ACE基因I/D多態(tài)性不同基因型受試者O2max、Hb、RBC 等生理表型指標變化見表2。結果顯示，低氧訓練前，ACE基因不同基因型受試者之間O2max、Hb、RBC 指標均無顯著性差異。

表2 HiHiLo低氧訓練后ACE基因I/D多態(tài)性基因型生理表型指標變化(±S)

表2 HiHiLo低氧訓練后ACE基因I/D多態(tài)性基因型生理表型指標變化(±S)

注:＆:P＜0.10，與ID、II型相比;*:P＜0.05，與ID型相比。圖2同。

指標基因型II(14) ID(18) DD(3)基礎值rO2max(ml/min·kg)49.21±3.8149.59±4.8752.40±2.43 O2max(ml/min)3484.58±394.03 3275.03±454.37 3587.43±395.27 Hb(g/L) 148.81±17.08 146.19±13.87 145.77±14.69 RBC(×1012/L) 4.70±0.54 4.71±0.46 4.73±0.30變化量ΔrO2max(ml/min·kg)0.85±4.290.31±3.433.30±0.87＆ΔO2max(ml/min)45.45±315.1011.39±221.03228.10±72.13*ΔHb(g/L) －0.52±8.88 －0.24±6.86 2.53±9.92 ΔRBC(×1012/L)0.19±0.43 0.12±0.42 0.33±0.56

4周HiHiLo低氧訓練后，ACE基因不同基因型受試者間 ΔO2max存在明顯差異(P ＜0.05)，DD 基因型受試者增加了(228.10±72.13)ml/min，提高了6.4%，ID基因型受試者增加了(11.39±221.03)ml/min，僅提高 0.3%;同時，ΔrO2max也表現(xiàn)出 DD基因型受試者改善優(yōu)于II、ID基因型趨勢(P＜0.1，表2，圖2)，DD基因型受試者最大攝氧量相對值變化量與低氧訓練前相比提高了6.3%，而II和ID基因型受試者則分別提高1.7%和0.6%。4周HiHi-Lo低氧訓練后，Hb和RBC變化量未顯現(xiàn)出基因型組間差異(表2)。

圖2 ACE基因I/D多態(tài)不同基因型間rO2max、O2max變化比較

3 討論

低氧環(huán)境下，低氧濃度信號刺激機體產(chǎn)生一系列生理適應性變化，低氧適應的優(yōu)劣，對人類在低氧環(huán)境下的運動、生活會產(chǎn)生重要的影響。目前，國內(nèi)外很多運動員進行低氧訓練(包括傳統(tǒng)高原訓練及人工低氧訓練等)，以獲得低氧訓練適應，提高身體機能能力。但因不同個體對低氧環(huán)境適應所表現(xiàn)出的生理反應差異性，導致產(chǎn)生了不同的低氧訓練適應效果。大量研究表明，不同低氧訓練效果差異性與遺傳學因素有著密切關聯(lián)［5－6］。2010年 SCIENCE雜志報道，人類對低氧環(huán)境適應與遺傳因素有著高度緊密關聯(lián)［7］。本文選取ACE基因16內(nèi)含子上I/D多態(tài)性，探究其與低氧訓練效果個體差異關聯(lián)性。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，4周HiHiLo低氧訓練后，ACE基因I/D多態(tài)與低氧訓練后最大攝氧量變化存在著一定的關聯(lián)性，DD基因型受試者最大攝氧量絕對值的變化量與ID基因型受試者相比有顯著性提高，DD基因型受試者提高6.4%，而ID基因型受試者僅提高0.3%，且DD基因型受試者最大攝氧量相對值變化量與低氧訓練前相比提高了6.3%，而II和ID基因型受試者則分別提高1.7%和0.6%，DD基因型有優(yōu)于II、ID基因型的趨勢。但本研究結果未發(fā)現(xiàn)ACE基因I/D多態(tài)與血象指標關聯(lián)性。

人類ACE基因是由26個外顯子(exon)和25個內(nèi)含子(intron)組成，位于染色體17q23區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄表達的ACE是膜結合糖蛋白，是一種二肽羧肽酶，ACE在體內(nèi)的生理作用主要是將十肽血管緊張素-I的C末端亮氨酸和組氨酸殘基的肽腱水解，生成八肽的血管緊張素-II，血管緊張素II具有收縮血管和氣管平滑肌作用，同時，血管緊張素II在腎素－血管緊張素系統(tǒng)能刺激醛固酮分泌，促進腎小管對鈉、鉀離子的重吸收，增加血容量，對于心臟具有正性肌力作用和變時作用［8］。有研究報道，ACE基因I/D多態(tài)性與血清ACE水平有關，I等位基因攜帶者可能具有較低氧血清ACE水平［1］，Woods DR報道，較低的血清ACE水平可緩解血管緊張度，降低心臟后負荷，達到增加心輸出量效果;此外，促進可促使骨骼肌和心肌吸收葡萄糖和氨基酸，提高能量物質(zhì)的儲存和利用;較低的血清ACE水平，可減少血管緊張素II的生成，調(diào)節(jié)激素和水鹽平衡，從而提高機體在低氧環(huán)境下的有氧工作能力［9］。由此推理，攜帶I等位基因受試者可能具有較好的低氧適應能力。Droma等研究報道［10］，具有較好低氧適應能力的夏爾巴人群I等位基因頻率明顯高于平原人群;樊輝娟等觀察ACE基因I/D多態(tài)性在藏、漢人群中分布發(fā)現(xiàn)，生活在海拔3 500m左右藏族人群I等位基因頻率、II基因型頻率明顯高于生活在同一地區(qū)的漢族人群，且藏族人群血清ACE水平也明顯低于漢族人群［11］。平原人群進入高原低氧環(huán)境中是否也表現(xiàn)為I等位基因攜帶者優(yōu)于D等位基因攜帶者呢?

從本研究發(fā)現(xiàn)，ACE基因I/D多態(tài)性中DD基因型受試者經(jīng)4周HiHiLo訓練后，O2max絕對值、相對值改善程度優(yōu)于II、ID基因型。但這一結果由于DD基因型例數(shù)較少，有待于進一步驗證。前期關于ACE基因I/D多態(tài)性與運動能力關聯(lián)研究較多，但這些研究結果存在著一些差異。早期Montgomery報道［12］，25名英國優(yōu)秀運動員ACE基因II基因型頻率顯著高于對照組;Cieszczyk、Ahmetov等分別觀察ACE基因I/D多態(tài)性在波蘭和俄羅斯優(yōu)秀運動員分布特點發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀運動員中I等位基因及II基因型頻率明顯高于對照組［13－14］。但ACE基因I/D多態(tài)性在中國北方漢族優(yōu)秀耐力項目運動員中，并未發(fā)現(xiàn)運動員組和對照組之間存在顯著性差異［15］。此外，Amir等的研究結果發(fā)現(xiàn)［16］，以色列優(yōu)秀馬拉松運動員DD基因型頻率和D等位基因頻率顯著高于短跑運動員與健康普通對照組;2000年Rankinenr報道［17］，高加索人種進行20周耐力訓練后，DD純合子O2max水平顯著增加，與II基因型受試者相比，在50W的負荷下，DD基因型受試者的心率下降了36%。2012年，有一項關于ACE基因I/D多態(tài)性與HiHiLo低氧訓練敏感性的關聯(lián)研究指出［18］，II、ID基因型受試者有HiHiLo低氧訓練敏感性趨勢，這與本研究結果趨勢性變化存在著不同。通過分析該項研究發(fā)現(xiàn)，該研究僅通過比較各組基因型受試者低氧訓練自身前后生理表型指標差異顯著，且低氧訓練后，基因型組間生理表型指標變化量無統(tǒng)計學差異的基礎上得出上結論，這可能不夠確切。

4 結論

研究結果提示，ACE基因I/D多態(tài)性與HiHiLo低氧訓練后O2max變化可能存在著一定的關聯(lián)性。但限于本研究樣本數(shù)量相對偏少，因此，所得結論有待于今后進一步驗證。

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