李思瑩，張瑜，叢賀，沈明花

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133000）

金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓的溶栓作用

李思瑩，張瑜，叢賀，沈明花*

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林延吉133000）

研究金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓的影響及可能機(jī)制。三氯化鐵誘導(dǎo)大鼠頸動(dòng)脈血栓模型，觀察金針菇發(fā)酵液對(duì)血栓重量和血管組織形態(tài)學(xué)改變。檢測(cè)血漿6-酮-前列腺素E1α（6-keto-PGE1α）、血栓素B2（TXB2）、血管內(nèi)皮素-1（ET-1）、組織纖溶酶原激活物（t-PA）和纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）的含量和一氧化氮（NO）水平。與模型組相比，用藥組的血栓重量顯著降低，血管內(nèi)的血栓被溶解，血管內(nèi)膜的損傷較輕。金針菇發(fā)酵液不同程度地提高NO、6-keto-PGE1α和t-PA水平，同時(shí)減少PAI-1和TXB2的含量，對(duì)ET-1水平的的影響并不明顯。金針菇發(fā)酵液具有溶栓活性，它對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用有可能是其溶栓機(jī)制之一。

金針菇；發(fā)酵液；溶栓；血管內(nèi)皮細(xì)胞

近幾年的研究表明，有些食用菌具有溶栓活性，如金針菇［1］、杏鮑菇［2］、裂褶菌［3］、白黃側(cè)耳［4］、榆干離褶傘［5］等。研究者們從這些食用菌中分離純化了不同的溶栓酶，并進(jìn)行了酶學(xué)特征分析。我們?cè)鴪?bào)道過(guò)金針菇發(fā)酵液的體外溶栓作用［6］。但是，這些食用菌在體內(nèi)的溶栓作用以及其機(jī)制方面的研究甚少。本文探討了金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血栓的影響，為金針菇的藥理作用提供一定理論參考。

1材料與試劑

1.1樣品的制備

金針菇發(fā)酵液由本教研室制備［6］。

1.2動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，200 g～250 g，雌雄各半共50只，由延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（吉）2011-0007。

1.3試劑

6-keto-PGE1α、TXB2、ET-1、t-PA和PAI-1試劑盒：上海市嚴(yán)謹(jǐn)生物科技有限公司；NO試劑盒：南京建成科技有限公司；FeCl3為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4儀器

RT-2100型酶標(biāo)儀：深圳雷杜公司產(chǎn)品；奧林巴斯BX53熒光顯微鏡：日本奧利巴斯株式會(huì)社產(chǎn)品；5308型全自動(dòng)離心機(jī)：Sigma公司產(chǎn)品。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

將50只大鼠隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型組和用藥低、中、高劑量組（100、200、400 mg/kg，以體質(zhì)量計(jì)）。用藥組按不同劑量定時(shí)灌胃，假手術(shù)組和模型組灌胃等容生理鹽水，每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后將大鼠用烏拉坦麻醉，參照Kurz［7］法制備頸總動(dòng)脈血栓模型。用浸有20%FeCl3溶液的濾紙條（1 cm×1.5 cm）包裹右側(cè)頸總動(dòng)脈15 min后將其取下。40 min后結(jié)扎錫箔紙兩端血管，精確剪下濾紙條包裹的血管，取出血栓，稱(chēng)重。每組隨機(jī)取兩只大鼠頸動(dòng)脈血栓血管，制備HE染色標(biāo)本。假手術(shù)組用生理鹽水包裹。腹主動(dòng)脈取血，用枸櫞酸鈉抗凝，制備血漿。

2.2測(cè)定方法

按常規(guī)HE染色方法制備頸動(dòng)脈組織標(biāo)本。其他均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間差異性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和t-檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1金針菇發(fā)酵液對(duì)血栓形成的影響

金針菇發(fā)酵液對(duì)血栓形成的影響見(jiàn)表1和圖1。

用藥組比模型組血栓重量明顯減少，并隨著用藥劑量的增加血栓重量減少趨勢(shì)更為顯著，這就提示金針菇發(fā)酵液具有溶栓作用。

組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，模型組血管完全被血栓阻塞，部分血管內(nèi)膜從管壁脫落，管腔內(nèi)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而用藥組血管內(nèi)的血栓明顯變?yōu)槭杷?。中、高劑量組血管內(nèi)的血栓大部分被溶解，血管內(nèi)膜比較完整，見(jiàn)圖1。

表1　金針菇發(fā)酵液對(duì)血栓重量的影響Table 1The effect of Flammulina Velutipes fermentation broth on the thrombus weight

圖1　頸總動(dòng)脈血栓病理組織學(xué)觀察結(jié)果（×200）Fig.1Pathologieal observation of carotid thrombus

3.2金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠NO、ET-1、6-keto-PGE1α和TXB2的影響

金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠NO、ET-1、6-keto-PGE1α和TXB2的影響見(jiàn)表2。

表2　金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠NO、ET-1、6-keto-PGE1α和TXB2的影響Table 2The effect of Flammulina Velutipes fermentation broth on levels of NO、ET-1、6-keto-PGE1αand TXB2

模型組的NO和6-keto-PGE1α水平明顯低于假手術(shù)組，而TXB2含量高于假手術(shù)組。與模型組相比，用藥組的NO和6-keto-PGE1α水平明顯升高，TXB2含量下降。各組之間ET-1含量變化不明顯。

3.3金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠t-PA和PAI-1的影響

金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠t-PA和PAI-1的影響見(jiàn)表3。

表3　金針菇發(fā)酵液對(duì)大鼠t-PA和PAI-1的影響Table 3The effect of Flammulina Velutipes fermentation broth on levels of t-PA and PAI-1

與假手術(shù)組相比，模型組的t-PA水平下降，而PAI-1含量無(wú)顯著變化。與模型組相比，用藥組的t-PA水平升高，PAI-1含量明顯減少，導(dǎo)致tPA/PAI-1比值升高。

4討論

血管內(nèi)膜的損傷、血小板的激活、血液黏度的增加以及凝血-纖溶系統(tǒng)的功能異常均可引起血栓性疾病。本實(shí)驗(yàn)中以FeCl3誘導(dǎo)大鼠頸動(dòng)脈血栓模型，探討了金針菇發(fā)酵液溶栓作用。

FeCl3通過(guò)高價(jià)鐵離子的氧化作用，引起血管壁的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的大鼠血管內(nèi)膜部分脫落，導(dǎo)致內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的完整性遭到破壞，從而血小板粘附于受損內(nèi)皮下的膠原，繼發(fā)引起損傷處的阻塞性血栓。與模型組相比，用藥組的血管內(nèi)膜比較完整，血栓部分溶解，尤其是高劑量組大鼠的血栓明顯變小、疏松。血栓重量測(cè)定結(jié)果也支持組織病理學(xué)檢查結(jié)果，這就提示金針菇發(fā)酵液具有溶栓作用。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，有些食用菌的發(fā)酵液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用［8］。由此，我們主要從保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的角度探討了金針菇發(fā)酵液的溶栓機(jī)制。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是一個(gè)機(jī)械屏障，而且又作為內(nèi)分泌器官，分泌多種血管活性物質(zhì)。一方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO、ET、PGI2、t-PA、PAI等生物活性物質(zhì)在調(diào)節(jié)血管舒縮性、抗血小板聚集以及纖溶等過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，具有一定的抗血栓作用。另一方面，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PGI2抑制血小板合成血栓素（TXA2），從而抑制血管的收縮及血小板的活化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)eCl3作用與血管壁以后，模型組的NO、t-PA和PGI2的代謝產(chǎn)物-6-keto-PGE1α水平下降，而TXA2代謝產(chǎn)物-TXB2的含量升高。這就說(shuō)明，血管內(nèi)膜受到氧化損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受到影響，從而降低其分泌功能。與模型組相比，用藥組的NO、6-keto-PGE1α和t-PA水平升高，TXB2和PAI-1含量減少，這就提示金針菇發(fā)酵液保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少三氯化鐵對(duì)血管內(nèi)皮的氧化損傷，從而減緩血栓的形成。我們?cè)鴪?bào)道過(guò)金針菇發(fā)酵液的抗氧化活性［9］，這種抗氧化作用是其保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制之一。

綜上所述，金針菇發(fā)酵液具有溶栓活性，血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是其作用靶點(diǎn)之一。

［1］Park SE，Li MH，Kim JS，et al.Purification and characterization of a fibrinolytic protease from a culture supernatant of Flammulina velutipesmycelia［J］.BiosciBiotechnol Biochem，2007，71（9）:2214-2222

［2］Cha WS，Park SS，Kim SJ，et al.Biochemical and enzymatic properties of a fibrinolytic enzyme from Pleurotus eryngii cultivated under solid-state conditions using corn cob［J］.Bioresour Technol，2010，101（16）:6475-6481

［3］Park IS，Park JU，Seo MJ，et al.Purification and biochemical characterization of a 17 kDa fibrinolytic enzyme from Schizophyllum commune［J］.J Microbiol，2010，48（6）:836-841

［4］沈明花，金梅花，金成俊.白黃側(cè)耳溶栓酶的分離純化及特性分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（9）:7-10

［5］沈明花，彭瀛，宋曉琳.榆干離褶傘發(fā)酵液的溶栓作用與降血脂作用研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（10）:28-30

［6］沈明花，彭瀛，宋曉琳.金針菇發(fā)酵液的溶栓作用研究［J］.食品科學(xué)，2012，33（17）:246-248

［7］Kurz KD，Main BW，Sandusky GE.Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride［J］.Thromb Res.1990，60（4）:269-280

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［9］彭瀛，范卉，葉松，等．金針菇發(fā)酵液的降低血脂作用及抗氧化作用［J］．延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（2）:101-103

Thrombolytic Function of Flammulina Velutipes Fermentation Broth on Arterial Thrombosis in Rats

LI Si-ying，ZHANG Yu，CONG He，SHEN Ming-hua*
（Medical College，Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）

To study the effect of Flammulina Velutipes fermentation broth on arterial thrombosis in rats and its mechanisms.Animal model was induced by ferric chloride in rats，then the thrombus weight was detected，the morphological changes of vascular tissue were observed，and the levels of 6-keto-PGE1α，TXB2，ET-1，t-PA，PAI-1 and NO in plasma were measured.As compared with the model group，the thrombus weight reduced，the intravascular thrombosis dissolved to some extent，and vascular intimal damage reduced in Flammulina Velutipes fermentation broth group.Flammulina Velutipes fermentation broth increased the levels of NO，6-keto-PGE1αand t-PA，reduced PAI-1 and TXB2content.However，there was no significant difference in the ET-1 level.Flammulina Velutipes fermentation broth has the thrombolytic function.The effects may be due to its protective effect on vascular endothelial.

Flammulina Velutipes；fermentation broth；thrombolysis；vascular endothelium

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.037

2015-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30760150）

李思瑩（1991—），女（漢），本科，研究方向：食用菌生物活性。

沈明花，副教授，研究方向：食用菌抗栓活性研究。