何義，朱景松，姜旋，苑寧，張偉

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000）

八寶粥軟罐頭中一種致腐微生物的分離鑒定

何義，朱景松，姜旋，苑寧，張偉*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北保定071000）

從脹袋的八寶粥軟罐頭中分離出一株致腐細(xì)菌zjs001，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察、革蘭氏染色和API 20E生化鑒定，同時(shí)提取其基因組DNA，進(jìn)行16SrDNA PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與NCBI中已知序列進(jìn)行比對(duì)，以確定其種屬，研究結(jié)果表明，引起八寶粥脹袋的腐敗菌為陰溝腸桿菌。

八寶粥；軟罐頭；致腐菌；鑒定

八寶粥是中國(guó)傳統(tǒng)食品，歷史悠久，銷(xiāo)量大且廣泛。八寶粥由糯米、香米、蓮子、大棗、花生、紅豆、綠豆、銀耳、白糖等多種原料制成［1］，具有健脾益胃、清熱潤(rùn)肺、安神補(bǔ)腎的作用，并且含有豐富的營(yíng)養(yǎng)素，易于消化吸收，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。

八寶粥軟罐頭采用了新型的包裝形式［2］，由蒸煮袋［3］等包裝材料代替了以往的易拉罐，具有成本低、攜帶方便、營(yíng)養(yǎng)損失少等優(yōu)點(diǎn)［4］。但由于包裝材料、殺菌技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)不足，導(dǎo)致八寶粥軟罐頭穩(wěn)定性較差，在貯存過(guò)程中易被微生物污染，大大降低了產(chǎn)品的保質(zhì)期［5-9］。目前，關(guān)于八寶粥的研究多集中于配方和工藝的優(yōu)化［10］，八寶粥致腐微生物的研究鮮有報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以脹袋后的八寶粥軟罐頭為研究對(duì)象，對(duì)其中的腐敗菌進(jìn)行了分離鑒定，確定了腐敗菌的分類(lèi)，為八寶粥軟罐頭的安全生產(chǎn)、品質(zhì)控制、防腐保鮮提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑

材料：腐敗變質(zhì)的八寶粥軟罐頭。

試劑：革蘭氏染色液：杭州百思生物技術(shù)有限公司；引物合成：華大基因；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）、膠回收試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；API試劑條：法國(guó)梅里埃公司。

培養(yǎng)基：YEPD瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、LB肉湯。

1.2方法

1.2.1保溫試驗(yàn)和密封試驗(yàn)

將廠家隨機(jī)抽取的100袋八寶粥樣品放在37℃的溫箱中培養(yǎng)7 d，觀察是否有脹袋現(xiàn)象。將脹袋的粥樣放入水浴鍋內(nèi)，然后慢慢升高水的溫度至90℃左右，觀察此過(guò)程中是否有連續(xù)氣泡冒出，如果沒(méi)有，表明袋密封完好。

1.2.2腐敗菌的分離、純化

采用無(wú)菌操作方法取脹袋的粥樣20g放入錐形瓶中混合，加入20mL的無(wú)菌蒸餾水，此即含菌的原液，然后采用梯度稀釋的方法，取0.1 mL菌懸液分別涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂和YEPD平板，分別在36℃和28℃培養(yǎng)。然后挑取單菌落純化3次，鏡檢，按菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果進(jìn)行分離純化，分別采用斜面保藏和液體石蠟密封保存。

1.2.3菌種的生化鑒定

1.2.3.1菌體形態(tài)鑒定

挑取試管斜面保存的菌種，稀釋到10～8，涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察菌落特征，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色及鏡檢。

1.2.3.2API細(xì)菌生化鑒定

通過(guò)革蘭氏染色和氧化酶試驗(yàn)結(jié)果確定采用API試紙條的類(lèi)型，測(cè)定操作與結(jié)果判斷按API法要求進(jìn)行。根據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行編碼，從API 20E V3.2數(shù)據(jù)庫(kù)中查找此編碼可鑒定菌種。

1.2.416SrDNA分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)16SrDNA通用引物：上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’；下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。送華大基因合成。

1.2.4.2基因組DNA的提取

采用熱裂解法提取分離菌株的基因組DNA，并經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)確認(rèn)。

1.2.4.316SrDNA序列PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系和PCR程序如表1和表2所示。

表1　PCR反應(yīng)體系Table 1The PCR reaction system

表2　PCR程序Table 2The PCR program

1.2.4.4電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNAMarker為DL2000，凝膠成像觀察拍照。

1.2.4.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收及序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳確認(rèn)后，用試劑盒回收DNA條帶，送華大基因測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的基因序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，查找同源性大于或等于99%的菌種，用MEGA4軟件進(jìn)行多序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1保溫試驗(yàn)和密封試驗(yàn)

100袋八寶粥樣品在保溫試驗(yàn)中只有一袋出現(xiàn)了膨脹現(xiàn)象。氣密性檢測(cè)顯示各袋密封性良好，未出現(xiàn)漏袋現(xiàn)象。粥樣簡(jiǎn)單染色鏡檢結(jié)果：大量短桿狀細(xì)菌，單個(gè)或成對(duì)排列，未發(fā)現(xiàn)酵母菌和真菌。結(jié)果如表3所示。

表3　結(jié)果報(bào)告單Table 3The results report

2.2腐敗菌的分離、純化

按“1.2.2”方法從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上篩選出1株腐敗細(xì)菌，YEPD平板上未發(fā)現(xiàn)酵母菌和真菌。將這株細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上反復(fù)純化培養(yǎng)后，斜面保存?zhèn)溆谩?.3菌種的生化鑒定

2.3.1菌體形態(tài)鑒定

腐敗菌的菌落及菌體形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1　腐敗菌的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)Fig.1Colony Morphology and Microscopic Morphology

菌落形態(tài)（如圖1中a所示）：圓形，有凸起，邊緣整齊，大而濕潤(rùn)，黏稠，乳白色，不透明。

鏡檢菌體形態(tài)（如圖1中b所示）：革蘭氏染色為陰性（紅色），粗短桿菌，單個(gè)或成對(duì)排列，無(wú)芽孢。

2.3.2API細(xì)菌生化鑒定

通過(guò)革蘭氏染色和氧化酶試驗(yàn)結(jié)果（陰性）確定采用API試紙條的類(lèi)型為API20E。觀察API20E試劑條顏色反應(yīng)，進(jìn)行結(jié)果判斷，如表4所示。

表4　API結(jié)果表Table 4Result of API

根據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行編碼，形成一個(gè)7位數(shù)字?jǐn)?shù)碼：3305563，從API 20E V3.2數(shù)據(jù)庫(kù)中查找此編碼，初步鑒定為陰溝腸桿菌，%ID為96.4≥90.0，T值為0.38≥0.25，為好的鑒定結(jié)果。

2.3.316SrDNA分子生物學(xué)鑒定

16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16SrR NA）的基因，長(zhǎng)度約為1 500 bp，是細(xì)菌分類(lèi)學(xué)研究中最常用、最有用的“分子化石”。將本菌株命名為zjs001，16SrDNA目的基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

圖2　菌液PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2Electrophoresis for bacterium fluid PCR products

電泳驗(yàn)證結(jié)果在1 500 bp左右處出現(xiàn)了亮色條帶，由此可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是菌株zjs001的16S rDNA。切膠后用膠回收試劑盒回收目的DNA，經(jīng)測(cè)序后，菌株zjs001的16SrDNA全序列堿基長(zhǎng)度為1 384 bp。在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，選擇同源性高的菌株（≥99%）用MEGA4軟件進(jìn)行多序列同源性分析，zjs001與Enterobacter cloacae（陰溝腸桿菌）JQ308592的同源性最高，為99.4%，與API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果相符，可鑒定為陰溝腸桿菌。用MEGA4軟件進(jìn)行多序列同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（如圖3所示），但系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示zjs001獨(dú)立為一小分支，也有為一新種或亞種的可能性，還有待進(jìn)一步研究。

圖3　菌株zjs001的16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3Phylogenetic tree based on the 16SrDNA seguences of strain zjs001

3討論與結(jié)論

八寶粥由8種糧谷物組成，每種都有其特定的微生物滋生，所以引起八寶粥食品腐敗的微生物種類(lèi)繁多，其豐富的營(yíng)養(yǎng)，為微生物的繁殖提供了條件和良好的生長(zhǎng)環(huán)境。據(jù)前人研究知，細(xì)菌、霉菌、酵母等都可以引起八寶粥食品的腐敗。霉菌、酵母菌對(duì)高溫的抵抗力差，一般的高溫加熱就可以使霉菌、酵母菌致死，引起這兩種類(lèi)型菌污染的原因是加熱不足或加熱不均勻，食品的某些部位沒(méi)有達(dá)到預(yù)想的溫度，出現(xiàn)了微生物的殘留，造成了食品的變質(zhì)，本論文從脹袋的八寶粥中分離到一株主要腐敗細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)觀察、革蘭氏染色、API 20E生化鑒定和16SrDNA分子測(cè)序方法的鑒定結(jié)果為陰溝腸桿菌，說(shuō)明陰溝腸桿菌能導(dǎo)致該種八寶粥軟罐頭食品腐敗，其污染可能是由于加熱不均勻所致，在大批量的生產(chǎn)中只有少數(shù)出現(xiàn)腐敗問(wèn)題，可見(jiàn)嚴(yán)格按照規(guī)范生產(chǎn)操作至關(guān)重要。

微生物的鑒定方法很多，目前比較經(jīng)典的是生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法。生理生化試驗(yàn)對(duì)不同代謝產(chǎn)物、代謝酶系統(tǒng)的檢測(cè)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。分子生物學(xué)是現(xiàn)代發(fā)展比較迅速和前沿的學(xué)科，根據(jù)四種核苷酸的排列順序可以對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。16SrDNA具有高度保守的序列，在生物的演變史中幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，可利用保守區(qū)將細(xì)菌16SrDNA擴(kuò)增出來(lái)，根據(jù)非保守區(qū)區(qū)分種屬。又由于16SrDNA大小適中，約1 500 bp大小的長(zhǎng)度，對(duì)其測(cè)序相對(duì)容易，所以16SrDNA稱(chēng)為鑒定細(xì)菌的首選。

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Separation and Identification Spoilage Microorganisms in the Soft Can of Rice Pudding

HE Yi，ZHU Jing-song，JIANG Xuan，YUAN Ning，ZHANG Wei*
（Agricultural Univorsity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

A strain of pathogenic Microbal zjs001 was successfully isolated from the spoilage of one soft can of rice pudding，by morphological observation.Gram staining and biochemical characterization of 20E API were performed，and the genomic DNA wasextracted，and PCR 16SrDNA was amplified and sequenced.The amplified products were sequenced and compared with the known sequences in NCBI，identified as Enterobacter cloacae.

rice porridge；soft can；rot fungus；identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.036

2015-08-17

何義（1979—），男（漢），助理研究員，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

張偉（1963—），男，教授，研究方向：食品科學(xué)。